阅读说明：本技术 一种高效表达重组猫干扰素ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺 (Mammalian cell culture process for efficiently expressing recombinant cat interferon omega 2 mutant ) 是由 代燕平 王雯茜 高小平 罗弟祥 于 2020-03-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高效表达重组猫干扰素-ω2(rFeIFN-ω2)突变体的哺乳动物细胞悬浮培养工艺,该培养工艺在生物反应器中进行,包括：(1)培养初始温度设定为36.5℃,溶氧40％、pH7±0.3,于培养第6天降低温度至33℃；(2)于培养第3、6、8、10、12天补充5％、5％、5％、5％、3％无血清补料培养基1,于培养第4、7、9、11天分别流加2％的无血清补料培养基2；于培养第5、8天分别流加6g/L的水解物,维持溶氧40％、pH7±0.3,于第18天结束培养。本发明培养工艺流程简单,细胞在高密度生长条件下保持活率时间长,目标蛋白表达可达2.5g/L以上,且抗病毒活性佳,生产成本低,适合大规模产业化应用。(The invention provides a mammalian cell suspension culture process for efficiently expressing recombinant cat interferon-omega 2 (rFeIFN-omega 2) mutants, which is carried out in a bioreactor and comprises the following steps: (1) setting the initial culture temperature to 36.5 ℃, dissolving oxygen at 40%, and reducing the temperature to 33 ℃ on the 6 th day of culture, wherein the pH is 7 +/-0.3; (2) supplementing 5%, 3% of serum-free supplemented medium 1 on days 3, 6, 8, 10, and 12, and feeding 2% of serum-free supplemented medium 2 on days 4, 7, 9, and 11; 6g/L of the hydrolysate was fed on days 5 and 8, respectively, dissolved oxygen was maintained at 40%, pH 7. + -. 0.3, and the culture was terminated on day 18. The invention has simple culture process flow, long survival rate of cells under high-density growth condition, high antiviral activity and low production cost, and the target protein expression can reach more than 2.5g/L, thereby being suitable for large-scale industrialized application.)

一种高效表达重组猫干扰素ω2突变体的哺乳动物细胞培养 工艺

技术领域

本发明涉及一种高效表达rFeIFN-ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺，属于生物制药

技术领域

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发明背景

1985年，干扰素ω首次从仙台病毒诱导的Namalwa细胞中克隆得到，现已鉴定出在猫、猪、马、兔、蝙蝠、牛和羊中存在。1992年，猫干扰素基因被Nakamura分离得到，随后rFeiIFN-ω药物研制成功并成为唯一一个获批上市的猫干扰素ω制剂，该制剂称为Virbagen Omega，已在日本和欧美国家广泛使用。主要用于治疗猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒感染性疾病和犬细小病毒感染性疾病，同时对猫病毒性鼻气管炎、猫杯状病毒、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、传染性肠胃炎病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒等感染型疾病的治疗也表现出良好的治疗效果。

近年来随着对猫科干扰素-ω的深入研究，我国学者刘文军等人于2005年从猫中分离获得13种新型猫干扰素-ω，其中，通过酵母表达体系获得的-ω2表现出最强的抗病毒活性(刘文军等：猫ω干扰素及其编码基因与应用。2005，授权公告号：CN 1730491A)(Yanget al:Cloning and Characterization of a Novel Feline IFN-ω.JOURNAL OFINTERFERON&CYTOKINE RESEARCH.2007；27:119–127)。2015年，胡小元等人通过比对猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列，对猫ω2干扰素进行氨基酸定点突变，将编码猫ω2干扰素突变体的基因克隆到杆状病毒转移载体中与杆状病毒重组感染昆虫宿主，表达外源基因，获得猫ω2干扰素突变体蛋白，通过突变使猫ω2干扰素的抗病毒活性提高45％以上(胡小元等：猫ω2干扰素突变体及其制备方法和应用。2015，授权公告号：CN108276486A)。若能将猫ω2干扰素突变体蛋白实现产业化生产，将会具有良好应用前景。目前FeINF-ω主要在大肠杆菌、酵母以及家蚕杆状病毒体系中成功表达，但大肠杆菌表达的rFeINF-ω活性不佳，家蚕杆状病毒表达体系所表达的产物其N-聚糖结构上存在高比例的核心α1,3岩藻糖，具有潜在的免疫原性反应(Minagawa S et al.Novel recombinantfeline interferon carrying N-glycans with reduced allergy risk produced by atransgenic silkworm system.BMC Vet Res.2018；14:260)。

哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工修饰能力，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。猫属于哺乳动物，且rFeINF-ω是一种糖蛋白，由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白，不仅在活性方面高于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，同时可以克服因昆虫或植物细胞表达体系特有的N-聚糖链核心α1-3岩藻糖所带来的免疫原性风险。但哺乳动物细胞表达体系成本高、效率低。因此本发明开发出一种操作简单易控、成本低廉的工艺方法，经本发明工艺生产的rFeINF-ω2突变体蛋白，其产量可达2.5g/L以上，产物抗病毒活性明显优于其它表达体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效表达rFeINF-ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺，使其克服采用哺乳动物细胞表达低效、成本高昂的问题。具体地，为rFeINF-ω2突变体蛋白的产业化提供一种操作简单易控、成本低廉、表达产物产量高、的生产培养工艺，其主要技术方案如下：

将表达rFeINF-ω2突变体的哺乳动物细胞接种至含无血清基础培养基的生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中控制温度、溶氧、pH、转速，且培养过程中定期流加不同无血清补料培养基、水解物和谷氨酰胺，同时监测细胞生长情况，并补充葡萄糖溶液。

优选地，所述的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞，优选CHO DG44细胞。

优选地，所述的细胞接种密度为5-8×10⁵/mL，优选5×10⁵/mL。

优选地，所述的生物反应器基础培养基的工作体积为1-500L，转速设置为10-200转/分钟，具体地，

7升生物反应器中培养基的工作体积为1-5L，优选3L工作体积；设置转速100-200转/分钟，优选150转/分钟；

50升生物反应器中培养基的工作体积为10-40L，优选30L工作体积；设置转速80-120转/分钟，优选90转/分钟；

250升生物反应器中培养基的工作体积为40-200L，优选150L工作体积；设置转速10-80转/分钟，优选50转/分钟；

优选地，所述的温度控制是初始培养温度设置为36℃-38℃，优选36.5℃；培养第6天开始降低培养温度至33℃。

优选地，所述的溶氧控制条件为30％-80％，优选40％；

优选地，所述的pH控制范围为5-7.5，优选7±0.3；

优选地，所述的无血清培补料培养基1流加方式为第3、6、8、10、12天分别流加5％、5％、5％、5％、3％的无血清补料培养基；所述的无血清补料培养基2流加方式为第4、7、9、11天分别流加2％的无血清补料培养基；

优选地，所述的水解物流加方式为第5、8天分别流加6g/L的水解物；

优选地，所述的无血清基础培养基由浓度为10-30g/L的ActiPro培养基、浓度为10-20g/L的SFM4CHO培养基中的一种或几种组成；另含添加物，由浓度为0.5-2g/L的F68、3-5g/L的葡萄糖、4-8mM谷氨酰胺中的一种或几种组成，pH7-7.5。

优选地，所述的无血清补料培养基1，由浓度为100～200g/L的Cell Boost 7a、50～100g/L的Cell Boost 7b补料中的一种或几种组成；无血清补料培养基2，由浓度为50～100g/L的EX-CELL Advanced CHO Feed 1补料组成。

优选地，所述的水解物，由浓度为50～200g/L的Hypep 7504、50～200g/L的PFPlus ACF水解物中的一种或几种组成；

本发明的有益效果：提供了一种简单、高效表达rFeINF-ω突变体的哺乳动物细胞培养工艺，使其表达产物产量高、成本低、抗病毒活性佳、适合大规模产业化应用。

附图说明

图1显示了rFeINF-ω突变体蛋白表达细胞在生物反应器中培养天数和细胞密度变化曲线

图2显示了rFeINF-ω突变体蛋白表达细胞在生物反应器中培养天数和细胞活率变化曲线

图3显示了rFeINF-ω突变体蛋白表达细胞在生物反应器中培养上清样品SDS-PAGE考染鉴定结果(还原)

图4显示了rFeINF-ω突变体蛋白表达细胞在生物反应器中培养上清样品表达水平

具体实施方式

本发明将提供以下实施例用于进一步理解和解释本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1重组猫干扰素-ω2突变体蛋白表达细胞扩种培养

复苏表达重组猫干扰素-ω2突变体哺乳动物细胞，以5×10⁵cells/ml密度接种至细胞摇瓶中置于摇床进行振荡培养，设置摇床参数为：36.5℃、5％CO₂、140rpm/min；连续培养约3天后细胞密度达到2-3×10⁶cells/ml，以5×10⁵cells/ml密度进行传代培养，直至细胞数量足够接种生物反应器时，获得种子细胞液。

实施例2重组猫干扰素-ω2突变体蛋白表达细胞生物反应器培养

将种子细胞液以5×10⁵cells/ml密度接种至生物反应器(工作体积为3L)中，采用ActiPro培养基进行培养，设置工艺参数为：温度36.5℃、溶氧40％、pH7±0.3、搅拌转速150转/分钟，培养第6天降低温度至33℃；培养第3、6、8、10、12天分别流加5％、5％、5％、5％、3％Cell Boost 7a/Cell Boost 7b(10:1比例)补料，培养第4、7、9、11天分别流加2％EX-CELL Advanced CHO Feed 1补料，培养第5、8天分别流加6g/L的Hypep 7504水解物，培养第3天补加1％200mM的谷氨酰胺；每天取细胞上清液进行生化指标测定，当葡萄糖浓度低于2g/L时补加1％400g/L葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度保持在2g/L以上。细胞连续培养至第8天达到峰密度3.27×10⁷cells/ml(图1)，在高密度生长条件下培养至第14天，活率仍然维持在恒定水平，培养至15天略有下降，至18天细胞活率仍维持在80％以上(图2)，终止培养，获得细胞原液。

实施例3重组猫干扰素-ω2突变体蛋白的产量评估

取生物反应器中培养第12、14、16、18天上清样品进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定，在约20KDa处存在明显rFeIFN-ω2突变体蛋白条带，且随培养时间延长，rFeIFN-ω2突变体蛋白表达水平不断增加(图3)。同时采用亲和层析技术对上清样品进行纯化，然后采用BCA对纯化的rFeIFN-ω2突变体蛋白进行定量，结果也显示蛋白表达水平随培养时间增加而升高，在收获的第18天时高达2.61g/L(图4)。另对纯化产物的抗VSV病毒比活性评估显示，本发明培养工艺生产的rFeIFN-ω2突变蛋白抗VSV的生物比活性>3×10⁸IU/mg。