用于减少双特异性抗体的聚集的方法
阅读说明：本技术 用于减少双特异性抗体的聚集的方法 (Methods for reducing aggregation of bispecific antibodies ) 是由 B·贾甘纳坦 J·许 M·特罗伊海特 D·单 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本文披露的本发明涉及通过在解冻后将抗体保持在某些温度下用于减少由在冷冻条件下储存而产生的双特异性抗体的聚集,例如减少双特异性T细胞接合(BiTE)抗体构建体的聚集的方法。(The invention disclosed herein relates to methods for reducing aggregation of bispecific antibodies, such as reducing aggregation of bispecific T cell junction (BiTE) antibody constructs, resulting from storage under freezing conditions by maintaining the antibodies at certain temperatures after thawing.)
本申请要求2018年10月1日提交的美国临时申请号62/739,542的权益，将其通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及用于减少双特异性抗体的聚集的方法。更具体地，本申请涉及用于减少由在冷冻条件下储存而产生的本文披露的双特异性抗体(例如双特异性T细胞接合抗体)的聚集的方法。
背景技术
治疗性蛋白质如抗体是针对患者的一种重要的药物类别。典型地，治疗性蛋白质在真核细胞中产生并大量纯化。由于蛋白质对温度变化敏感，因此将这些治疗性蛋白质的原料药在-20℃至-80℃的温度范围下的冷冻条件下储存和运输。冷冻延长了治疗性蛋白质的保质期，并且为安排将蛋白质最终配制和填充到市售的产品包装中提供了灵活性。用于储存和运输的操作基础设施和物流在该范围内的较高温度下是有利的。
冷冻/解冻过程可能是蛋白质的应激源。例如，水在蛋白质原料药的冷冻过程中结晶，这可能导致蛋白质分子达到起始水平的几倍的浓度水平。浓度变化可能导致蛋白质热力学稳定性的丧失，导致折叠事件并造成聚集。参见例如18Lam Philippe等人,Quality byDesign for Biopharmaceutical Drug Product Development[生物药物产品开发的设计质量],第159-189页(Jameel F.等人编辑,2015)。解冻过程可能涉及类似的应激，并且它们可能由于及时融化冰所需的较高温度而加剧。同上。因此，当包含治疗性蛋白质的原料药在冷冻条件下储存和/或运输时，蛋白质聚集体(例如，高分子量(HMW)聚集体)可能由于冷冻/解冻过程产生。然而，原料药中聚集体的存在是不期望的，因为聚集体可能负面影响蛋白质的稳定性、免疫原性和效力。需要用于减少在冷冻条件下储存产生的蛋白质聚集的方法。
发明内容
本文提供了用于减少由在冷冻条件下储存而产生的双特异性抗体(特别是双特异性T细胞接合抗体(BiTE))的聚集的方法。本申请涉及出人意料的发现，即在解冻后，将双特异性抗体在某些温度下保持一段时间减少了在冷冻条件下储存形成的聚集体。
在一个实施例中，本文披露了用于减少双特异性抗体的聚集体的方法，该方法包括将解冻的双特异性抗体在约5℃至约45℃的温度下保持至少4小时，其中在解冻前，该双特异性抗体已储存在约-20℃至约-40℃的温度下。在一个实施例中，将该解冻的双特异性抗体在该温度下保持约4小时至约96小时的时间段。在一个实施例中，将该解冻的双特异性抗体在约10℃至约30℃的温度下保持约10小时至约48小时的时间段。在一个实施例中，将该解冻的双特异性抗体在约10℃至约30℃的温度下保持8小时至48小时的时间段。
在一个实施例中，将该双特异性抗体在约5℃至约45℃的温度下解冻。在一个实施例中，在解冻前，该双特异性抗体已在约-20℃至约-35℃的温度下储存，在另一个实施例中，在解冻前，该双特异性抗体已在约-30℃下储存。在一个实施例中，聚集体包含高分子量(HMW)聚集体。在一个实施例中，HMW聚集体包含双特异性抗体的二聚体。在一个实施例中，双特异性抗体在保持期后包含低于约1％的HMW聚集体，在另一个实施例中，双特异性抗体在保持期后包含低于约0.5％的HMW聚集体。
在一个实施例中，本文披露了用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法，该方法包括将包含已在约-20℃至约-40℃的温度下储存的双特异性抗体的原料药解冻，以及将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约5℃至约45℃的温度下保持至少4小时。在一个实施例中，将原料药在该温度下保持约4小时至约96小时的时间段。在另一个实施例中，将原料药在约10℃至约30℃的温度下保持约10小时至约48小时的时间段。在另一个实施例中，将原料药在约10℃至约30℃的温度下保持8小时至48小时的时间段。在一个实施例中，将原料药在约5℃至约45℃的温度下解冻。在一个实施例中，该原料药已在约-20℃至约-35℃的温度下储存，在另一个实施例中，该原料药已在约-30℃下储存。在一个实施例中，用于制备组合物的方法进一步包括过滤原料药，在另一个实施例中，用于制备组合物的方法进一步包括将组合物等分成药物产品形式。在一个实施例中，组合物是包含双特异性抗体的药物组合物。
在一个实施例中，本文披露了用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法，该方法包括将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约5℃至约45℃的温度下保持至少4小时，其中在解冻前，该原料药已在该原料药的玻璃化转变温度(Tg’)或更高温度下冷冻。在一个实施例中，原料药已在约-10℃至等于或高于原料药的玻璃化转变温度的温度下冷冻，在另一个实施例中，该原料药已在约-32℃下冷冻。在一个实施例中，将原料药在该温度下保持约4小时至约96小时的时间段。在一个实施例中，将原料药在约5℃至约45℃的温度下解冻。在另一个实施例中，将原料药保持在与原料药解冻的温度相同的温度下。在另一个实施例中，将原料药在约15℃至约30℃的相同温度下解冻并保持30小时至50小时的时间段。在另一个实施例中，用于制备组合物的方法进一步包括将组合物等分成药物产品形式。在另一个实施例中，用于制备组合物的方法进一步包括将组合物冻干。在又另一个实施例中，用于制备组合物的方法进一步包括喷雾干燥组合物。
在一个实施例中，原料药在保持期后包含低于约1％的HMW聚集体，在另一个实施例中，原料药包含低于约0.5％的HMW聚集体。在一个实施例中，HMW聚集体包含双特异性抗体的二聚体。
在一个实施例中，原料药包含浓度为约0.05mg/mL至约20mg/mL的双特异性抗体。
在一个实施例中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合抗体(BiTE)。在一个实施例中，双特异性抗体包含与靶细胞表面抗原结合的第一结合结构域，和与人CD3结合的第二结合结构域，并且其中该双特异性抗体呈(scFv)2形式。在一个实施例中，双特异性抗体包含与选自CD19、CD33或BCMA的靶细胞表面抗原结合的第一结合结构域，和与人CD3结合的第二结合结构域，并且其中该双特异性抗体呈(scFv)2形式。
在一个实施例中，双特异性抗体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中该第一结合结构域包含VH区和VL区，并且其中：该VH包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或该VH包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列；或该VH包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列。在另一个实施例中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:17、40或135的氨基酸序列。
在一个实施例中，双特异性抗体是BiTE，其中该BiTE进一步包含第三结构域，该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中这两个多肽单体经由肽接头彼此连接。在另一个实施例中，该第三结构域按氨基至羧基顺序包含铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。在一个实施例中，该第三结构域是半衰期延长的(HLE)结构域。
在一个实施例中，双特异性抗体包含第一结合结构域、第二结合结构域、和第三结构域，其中该第一结合结构域与选自以下的至少一种靶细胞表面抗原结合：CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、CD70、BCMA或PSMA，该第二结合结构域与人CD3结合，并且该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中这两个多肽单体经由肽接头彼此连接。
在一个实施例中，双特异性抗体包含第一结合结构域、第二结合结构域、和第三结构域，该第一结合结构域包含VH区和VL区，并且与选自以下的至少一种靶细胞表面抗原结合：CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、CD70、BCMA或PSMA，该第二结合结构域与人CD3结合，并且该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中这两个多肽单体经由肽接头彼此连接，并且其中(a)该VH包含SEQ IDNO:108的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列；或(b)该VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或(c)该VH包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；或(d)该VH包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或(e)该VH包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或(f)该VH包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；或(g)该VH包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或(h)该VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；或(i)该VH包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列；或(j)该VH包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列；或(k)该VH包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列；或(l)该VH包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列并且该VL包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。
在一个实施例中，双特异性抗体包含第一结合结构域、第二结合结构域、和第三结构域，该第一结合结构域与选自以下的至少一种靶细胞表面抗原结合：CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、CD70、BCMA或PSMA，该第二结合结构域与人CD3结合，并且该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中这两个多肽单体经由肽接头彼此连接，并且其中该双特异性抗体包含选自SEQ IDNO:63、114、41、82、136、104、93、177、125、190或52的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施例中，双特异性抗体是双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质。在一个实施例中，该双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含(a)与第一抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，和与AB1偶联的掩蔽结构域(MD1)，其中该MD1包含(1)抑制或减少AB1与其抗原的结合的第一掩蔽肽(MP1)，和(2)蛋白质识别位点(PR1)，其中蛋白质或蛋白酶与该PR1的结合或对该PR1的裂解增加AB1与其抗原的结合；(b)与第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，和与AB2偶联的第二掩蔽结构域(MD2)，其中该MD2包含：(1)抑制或减少AB2与其抗原的结合的第二掩蔽肽(MPs)，和(2)第二蛋白质识别位点(PR2)，其中蛋白质或蛋白酶与该PR2的结合或对该PR2的裂解增加AB2与其抗原的结合。在一个实施例中，PR1和PR2包含相同的蛋白质识别序列。在另一个实施例中，AB1与人CD3结合并且AB2与人EGFR结合。
附图说明
图1显示将各种HLE BiTE分子在-20℃下储存一个月后，聚集体水平的增加(ΔHMW％)。
图2A显示在具有不同pH的组合物中在-20℃下储存一个月后，DLL3xCD3 HLE BiTE的聚集体水平的增加(ΔHMW％)。
图2B显示在不同温度下储存一个月后，DLL3xCD3 HLE BiTE的聚集体水平的增加(ΔHMW％)。
图3A、3B、3C和3D显示在-20℃或-30℃下储存后，各种HLE BiTE中增加的HMW聚集体水平，以及在解冻后，在室温下保持24小时降低聚集体水平。
图4显示BiTE分子的HMW水平的下降与保持时间和保持温度的关系。
图5显示苄醇的稳定作用。
具体实施方式
方法
本文描述了减少双特异性抗体的聚集体，特别是当双特异性抗体在冷冻条件下储存时形成的聚集体的方法。如本文所用的，术语“聚集体”或“聚集”是指两个或更多个分子的缔合。在某些实施例中，聚集体是分子量和/或尺寸大于非聚集分子的高分子量(HMW)聚集体。在某些实施例中，聚集体包含两个或更多个抗体分子的缔合。在某些实施例中，聚集体包含两个或更多个双特异性抗体分子的缔合，包括双特异性抗体的二聚体。在某些实施例中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合抗体(BiTE)。
聚集体的存在和/或水平可以通过本领域已知的技术测定，例如测定分子尺寸的技术，例如尺寸排阻色谱、阳离子交换色谱、X射线衍射、调制式差示扫描量热法(mDSC)、和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。在一个实施例中，通过尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)测定蛋白质聚集体的存在和/或水平。在另一个实施例中，通过尺寸排阻超HPLC(SE-UHPLC)测定蛋白质聚集体的存在和/或水平。
在一方面，本文披露了用于减少双特异性抗体的聚集体的方法，该方法包括将解冻的双特异性抗体在某一温度下保持至少4小时，其中该双特异性抗体已在解冻前在冷冻条件下储存。如本文所用的，术语“解冻的双特异性抗体”或“解冻的包含双特异性抗体的原料药”应理解为是指来自冷冻状态但由于暴露于温热而产生的液态双特异性抗体或包含双特异性抗体的液态原料药。在某些实施例中，解冻的双特异性抗体或解冻的包含双特异性抗体的原料药是不含或基本上不含冷冻物质的液态双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。
在某些实施例中，双特异性抗体是原料药。如本文所用的，术语“原料药”应理解为是指已从污染蛋白质、脂质和核酸(例如存在于液体培养基或来自宿主细胞(例如来自哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)的污染蛋白质、脂质和核酸)以及生物污染物(例如病毒和细菌污染物)中充分纯化或分离，并且无需进一步实质性纯化和/或净化步骤即可配制成药物组合物的重组蛋白质(例如双特异性抗体)。术语原料药涵盖包含充分纯化的重组蛋白(例如，双特异性抗体)和一种或多种药学上合适的赋形剂的组合物。
在某些实施例中，解冻的原料药是除重组蛋白(例如双特异性抗体)外还包含一种或多种赋形剂的组合物。可以使用适用于药物组合物的赋形剂。示例性的赋形剂包括缓冲剂(例如乙酸盐缓冲剂、谷氨酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乳酸缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、马来酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂或磷酸盐缓冲剂)、糖类(例如葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇或木糖醇)和表面活性剂(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)。在某些实施例中，解冻的原料药是包含重组蛋白(例如双特异性抗体)、缓冲剂(例如谷氨酸盐缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂)、糖类(例如蔗糖)和任选地表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)的组合物。解冻的原料药的pH可以在约3.0至7.0或约4.0至约6.0的范围内。
在某些实施例中，冷冻的双特异性抗体通过暴露于升高的温度而解冻。在某些实施例中，将双特异性抗体在约0℃至约50℃、或约0℃至约40℃、或约0℃至约30℃、或约5℃至约45℃、或约5℃至约30℃、或约10℃至约50℃、或约10℃至约40℃、或约10℃至约30℃、或约15℃至约50℃、或约15℃至约40℃、或约15℃至约30℃、或约20℃至约30℃、或约25℃至约30℃的温度下解冻。在某些实施例中，将双特异性抗体在约0℃至约25℃、或约5℃至约25℃、或约10℃至约25℃、或约15℃至约25℃、或约20℃至约25℃的温度下解冻。在某些实施例中，将双特异性抗体在约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、或约30℃、或约40℃、或约45℃、或约50℃的温度下解冻。正如本领域普通技术人员可以理解的，双特异性抗体可以在解冻过程中轻轻混合以确保温度的均匀分布和/或破坏解冻过程中形成的浓度梯度。轻轻混合可以通过例如使用倾斜振荡器或将双特异性抗体的容器轻轻倒置来实现。可替代地，可在解冻后将双特异性抗体轻轻混合。
在某些实施例中，该方法包括将解冻的双特异性抗体在某一温度下保持至少4小时。在某些实施例中，保持温度是约0℃至约50℃、或约0℃至约40℃、或约5℃至约50℃、或约5℃至约45℃、或约5℃至约40℃、或约5℃至约30℃、或约10℃至约50℃、或约10℃至约45℃、或约10℃至约40℃、或约10℃至约30℃、或约15℃至约40℃、或约15℃至约30℃。在某些实施例中，保持温度是约15℃至约25℃。在某些实施例中，保持温度是约5℃、或约10℃、或约15℃、或约17℃、或约19℃、或约20℃、或约23℃、或约25℃、或约27℃、或约30℃、或约35℃、或约40℃或约45℃。在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在以上温度中的任一个温度下保持约4小时至约120小时、或约4小时至约96小时、或约4小时至约72小时、或约4小时至约48小时、或约4小时至约24小时、或约10小时至约120小时、或约10小时至约96小时、或约10小时至约72小时、或约10小时至约48小时、或约10小时至约24小时、或约24小时至约120小时、或约24小时至约100小时、或约24小时至约96小时、或约24小时至约72小时、或约24小时至约48小时、或约48小时至约100小时、或约48小时至约96小时、或约48小时至约72小时、或约72小时至约100小时、或约72小时至约96小时的时间段。
在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在约5℃至约45℃的温度下保持约4小时至约120小时的时间段、或约4小时至约100小时的时间段、或约4小时至约96小时的时间段、或约4小时至约72小时的时间段、或约4小时至约48小时的时间段、或约4小时至约24小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在约10℃至约30℃的温度下保持约4小时至约24小时的时间段、或约10小时至约120小时的时间段、或约10小时至约96小时的时间段、或约10小时至约72小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约10小时至约24小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在约30℃至约45℃的温度下保持约4小时至约24小时的时间段或约4小时至约10小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在约15℃至约45℃的温度下保持约4小时至约120小时的时间段、或约4小时至约50小时的时间段、或约4小时至约24小时的时间段、或约8小时至约50小时的时间段、或约15小时至约50小时的时间段、或约4小时至约100小时的时间段、或约8小时至约100小时的时间段、或约15小时至约100小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、或约48小时至约100小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约48小时至约72小时的时间段、或约72小时至约100小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在约15℃至约30℃的温度下保持约4小时至约24小时的时间段、或约10小时至约120小时的时间段、或约10小时至约96小时的时间段、或约10小时至约72小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约10小时至约24小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、或约48小时至约100小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约48小时至约72小时的时间段、或约72小时至约100小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的双特异性抗体在约15℃至约25℃的温度下保持约4小时至约24小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约15小时至约30小时的时间段、或约15小时至约24小时的时间段、或约24小时至约120小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、或约48小时至约100小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约48小时至约72小时的时间段、或约72小时至约100小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。在另一个实施例中，将解冻的双特异性抗体在约15℃至约30℃的温度下保持约10小时、或约15小时、或约20小时、或约24小时、或约36小时、或约48小时、或约60小时、或约72小时、或约84小时、或约96小时、或约120小时的时间段。
在解冻前，双特异性抗体已在冷冻条件下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-20℃至约-50℃的温度下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-20℃至约-40℃的温度下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-25℃至约-35℃的温度下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-20℃、约-30℃、约-35℃、约-40℃、或约-50℃的温度下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-30℃的温度下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在0℃至等于或高于抗体的玻璃化转变温度(Tg’)或包含抗体的组合物的Tg’的温度下储存。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-10℃至等于或高于抗体的Tg’或包含抗体的组合物的Tg’的温度下储存。
在某些实施例中，双特异性抗体已在约-20℃至约-40℃的温度下储存约一天至约5年的时间段。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-20℃至约-40℃的温度下储存约一周至约5年或约一个月至约5年的时间段。在某些实施例中，双特异性抗体已在约-20℃至约-40℃的温度下储存约一周、约两周、约三周、约四周、约一个月、约六个月、约十八个月、约一年、约两年、约三年、约四年、或约5年的时间段。
如本文所用，术语“约”当用于修饰特定值或范围时，应理解为是指给定值或范围内可以存在变化，包括高于或低于所述值或范围的20％(例如10％、5％、4％、3％、2％或1％)。
如本文所用的，术语“储存”或“储存的”是指在某些条件下放置或留置双特异性抗体以供以后使用或进一步处理。在某些实施例中，将抗体置于以上所述温度的任一个下，这可以通过使用例如可维持所需温度的冷冻器、冷藏卡车或运输设备来实现。正如本领域普通技术人员可以理解的，当在以上所述的储存温度下储存时，抗体被冷冻。
可以将双特异性抗体储存在可以在储存温度下保持其完整性的任何合适的容器中。示例性的容器包括小药瓶、瓶子、袋和大玻璃瓶。此类容器在本领域中是众所周知的，并且可商购获得。在某些实施例中，将双特异性抗体储存在一次性容器中，如可商购的柔性冷冻解冻容器，例如，FFT系统。储存下的双特异性抗体的体积由用于储存的容器的体积确定。在某些实施例中，容器的体积是5mL、10mL、100mL、500mL、1升(L)、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、或12L。在某些实施例中，储存下的双特异性抗体的体积是约5mL、约10mL、约100mL、约500mL、约1升(L)、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、或约12L。
在某些实施例中，储存下的双特异性抗体的浓度范围是约0.01mg/mL至约25mg/mL、或约0.05mg/mL至约25mg/mL、或约0.1mg/mL至约25mg/mL、或约0.5mg/mL至约25mg/mL、或约1mg/mL至约25mg/mL。在某些实施例中，储存下的双特异性抗体的浓度范围是约1mg/mL至约20mg/mL、或约1mg/mL至约15mg/mL、或约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL。在某些实施例中，储存下的双特异性抗体的浓度是约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL、约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、或约25mg/mL。
本文还披露了用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法。在某些实施例中，该方法包括解冻已在冷冻条件下储存的包含双特异性抗体的原料药，以及将解冻的原料药在某一温度下保持至少4小时。
在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃至约-50℃的温度下储存。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃至约-35℃的温度下储存。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-25℃至约-35℃的温度下储存。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃、约-30℃、约-35℃、约-40℃或约-50℃的温度下储存。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-30℃的温度下储存。
在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃至约-50℃的温度下储存约一天至约5年的时间段。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃至约-40℃的温度下储存约一周至约5年或约一个月至约5年的时间段。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃至约-40℃的温度下储存约一周、约两周、约三周、约四周、约一个月、约六个月、约十八个月、约一年、约两年、约三年、约四年、或约5年的时间段。
在某些实施例中，用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法包括将解冻的包含双特异性抗体的原料药在某一温度下保持至少4小时，其中在解冻前，该原料药已在等于或高于原料药的玻璃化转变温度(Tg’)的温度下冷冻。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-10℃至等于或高于原料药的Tg'的温度下冷冻。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-20℃至等于或高于原料药的Tg'的温度下冷冻。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在等于或高于原料药的Tg’的温度(例如，约-10℃至等于或高于Tg')下冷冻约一天至约5年或约一周至约5年的时间段。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在等于或高于原料药的Tg’的温度(例如，约-10℃至等于或高于Tg’)下冷冻约一个月、约六个月、约一年、约十八个月、约2年、约三年、约4年或约5年的时间段。在某些实施例中，原料药的Tg’是约-30℃、或约-32℃、或约-35℃。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药已在约-32℃的温度下冷冻约一个月、约六个月、约一年、约十八个月、约2年、约三年、约4年或约5年的时间段。
正如本领域普通技术人员可以理解的，双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药的玻璃化转变温度可以通过本领域已知的方法测定，例如差示扫描量热法(DSC)、热机械分析(TMA)、动态力学分析(DMA)和膨胀测定法。
包含双特异性抗体的原料药可能已储存或已冷冻在可以在储存/冷冻温度下保持其完整性的任何合适的容器中。示例性的容器包括小药瓶、瓶子、袋和大玻璃瓶。此类容器在本领域中是众所周知的，并且可商购获得。在某些实施例中，将包含双特异性抗体的原料药储存在一次性容器中，如可商购的柔性冷冻解冻容器，例如，FFT系统。储存下的包含双特异性抗体的原料药的体积由用于储存的容器的体积确定。在某些实施例中，容器的体积是1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L或12L。
包含双特异性抗体的原料药可以通过暴露于升高的温度来解冻。在某些实施例中，将原料药在约0℃至约50℃、或约0℃至约40℃、或约0℃至约30℃、或约5℃至约45℃、或约5℃至约30℃、或约10℃至约30℃、或约15℃至约30℃、或约20℃至约30℃、或约25℃至约30℃的温度下解冻。在某些实施例中，将原料药在约0℃至约25℃、或约5℃至约25℃、或约10℃至约25℃、或约15℃至约25℃、或约20℃至约25℃的温度下解冻。在某些实施例中，将原料药在约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约27℃、或约30℃、或约40℃、或约45℃、或约50℃的温度下解冻。
在某些实施例中，该方法包括将解冻的原料药保持在约0℃至约50℃、或约0℃至约40℃、或约5℃至约50℃、或约5℃至约45℃、或约10℃至约50℃、或约10℃至约45℃、或约10℃至约30℃、或约15℃至约40℃、或约15℃至约30℃的温度下。在某些实施例中，将解冻的原料药保持在约15℃至约25℃的温度下。在某些实施例中，将解冻的原料药保持在约5℃、或约10℃、或约15℃、或约17℃、或约19℃、或约21℃、或约23℃、或约25℃、或约27℃、或约29℃、或约40℃或约45℃的温度下。在某些实施例中，将解冻的原料药在以上温度中的任一个下保持约4小时至约150小时的时间段、或约4小时至约100小时的时间段、或约4小时至约72小时的时间段、或约4小时至约48小时的时间段、或约4小时至约24小时的时间段、或约10小时至约150小时的时间段、或约10小时至约100小时的时间段、或约10小时至约72小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约10小时至约24小时的时间段、或约24小时至约150小时的时间段、或约24小时至约120小时的时间段、或约24小时至约100小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、约48小时至约100小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约48小时至约72小时的时间段、或约72小时至约100小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。
在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约5℃至约45℃的温度下保持至少约4小时。在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约5℃至约45℃的温度下保持约4小时至约120小时的时间段、或约4小时至约96小时的时间段、或约4小时至约72小时的时间段、或约4小时至约48小时的时间段、或约4小时至约24小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约10℃至约45℃的温度下保持约4小时至约100小时的时间段或约4小时至约50小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约15℃至约40℃的温度下保持约4小时至约150小时的时间段、或约4小时至约120小时的时间段、或约4小时至约96小时的时间段、或约4小时至约72小时的时间段、或约4小时至约48小时的时间段、或约4小时至约24小时的时间段、或约10小时至约120小时的时间段、或约10小时至约96小时的时间段、或约10小时至约72小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约10小时至约24小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约15℃至约30℃的温度下保持约10小时至约96小时的时间段、或约10小时至约72小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约10小时至约24小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、或约48小时至约100小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约48小时至约72小时的时间段、或约72小时至约100小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约15℃至约25℃的温度下保持约15小时至约96小时的时间段、或约15小时至约72小时的时间段、或约15小时至约48小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、或约48小时至约100小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约48小时至约72小时的时间段、或约72小时至约100小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。在一个实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约10℃至约30℃的温度下保持约10小时至约96小时的时间段、或约10小时至约72小时的时间段、或约10小时至约48小时的时间段、或约10小时至约24小时的时间段、或约24小时至约96小时的时间段、或约24小时至约72小时的时间段、或约24小时至约48小时的时间段、或约48小时至约96小时的时间段、或约72小时至约96小时的时间段。在另一个实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约10℃至约30℃的温度下保持约4小时、或约10小时、或约24小时、或约48小时、或约60小时、或约72小时、或约96小时、或约120小时、或约150小时的时间段。
在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约5℃至约45℃的温度下保持一段时间，使得包含双特异性抗体的原料药中聚集体的水平降低至与在冷冻条件下储存前大致相同的水平。在某些实施例中，将解冻的包含双特异性抗体的原料药在约5℃至约45℃的温度下保持约4小时直至包含双特异性抗体的原料药中聚集体的水平降低至与在冷冻条件下储存前大致相同的水平的时间。正如本领域普通技术人员可以理解的，解冻的原料药中聚集体的水平降低至与在特定温度下在冷冻条件下储存前大致相同的水平所需的时间可通过使用本领域已知和使用的方法(例如SE-UHPLC)在冷冻条件下储存前和在解冻后的不同时间点测量原料药中聚集体的水平来测定，参见例如实例5。
在某些实施例中，将原料药保持在与该原料药解冻的温度相同的温度下。例如，可以将包含双特异性抗体的原料药在一个温度(例如以上披露的解冻和保持温度的任一个)下，如约5℃至约45℃的温度下解冻，并且然后在解冻后，在相同温度下保持至少4小时(例如，约4小时至约150小时、或约4小时至约120小时、或约4小时至约96小时、或约4小时至约72小时、或约4小时至约48小时、或约4小时至约24小时、或约8小时至约96小时、或约8小时至约72小时、或约8小时至约48小时、或约24小时至约72小时、或约24小时至约48小时的时间段)。本领域普通技术人员可以容易地确定原料药是否解冻。
在某些实施例中，将原料药保持在与该原料药解冻的温度相同的温度下，并且将原料药在相同温度下保持总的时间段(解冻和保持的时间)，直到包含双特异性抗体的原料药中聚集体的水平降低至与在冷冻条件下储存前大致相同的水平。如实例中所示的，本领域普通技术人员可以使用本领域已知的方法(例如SE-UHPLC)测定冷冻前和解冻后不同时间点的原料药中聚集体的水平。在一个实施例中，将原料药在约5℃至约45℃的相同温度下解冻并且保持约30小时至约100小时的总时间段、或约30小时至约90小时的总时间段、或约30小时至约80小时的总时间段、或约30小时至约70小时的总时间段、或约30小时至约60小时的总时间段、或约30小时至约50小时的总时间段。在一个实施例中，将原料药在约15℃至约30℃的相同温度下解冻并且保持约30小时至约100小时的总时间段、或约30小时至约90小时的总时间段、或约30小时至约80小时的总时间段、或约30小时至约70小时的总时间段、或约30小时至约60小时的总时间段、或约30小时至约50小时的总时间段。
在某些实施例中，将包含双特异性抗体的原料药在解冻期间轻轻混合。轻轻混合可以通过例如使用倾斜振荡或将原料药的容器轻轻倒置来实现。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药在解冻期间中不混合，而是将原料药在解冻后轻轻混合。
在某些实施例中，原料药包含浓度为约0.01mg/mL至约25mg/mL、或约0.05mg/mL至约25mg/mL、约0.1mg/mL至约25mg/mL、约0.5mg/mL至约25mg/mL、或约1mg/mL至约25mg/mL的双特异性抗体。在某些实施例中，原料药包含浓度为约1mg/mL至约20mg/mL、或约1mg/mL至约15mg/mL、或约1mg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约5mg/mL的双特异性抗体。在某些实施例中，原料药包含浓度为约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL、约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、或约25mg/mL的双特异性抗体。
在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药的pH范围为约pH 3.5至约pH 7.5或约pH 4.0至约pH 7.0。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药的pH范围为约pH 4.0至约pH 6.5。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药的pH范围为约pH 4.0至约pH4.8。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药的pH范围为约3.5、约4.0、约4.2、约4.4、约4.6、约4.8、约5.0、约5.2、约5.4、约5.6、约5.8、约6、约6.2、约6.4、约6.6、约7.0、或约7.5。
在某些实施例中，本方法进一步包括过滤原料药。在某些实施例中，过滤步骤包括无菌过滤。无菌过滤是本领域已知并且常用的。例如，可以使用正常流过滤(NFF)进行无菌过滤，其中流体流的方向垂直于过滤介质(例如，膜)并且纯化的液体通过过滤介质。在某些实施例中，可以将可减少双特异性抗体聚集的药剂(例如氨基酸、多元醇如苄醇、环糊精、葡聚糖和聚乙二醇(PEG))添加到原料药中。
在某些实施例中，通过该方法制备的组合物是药物组合物。如本文所用的，术语“药物组合物”应理解为是指适合向有此需要的患者(例如，人)注射和/或施用的包含双特异性抗体的配制品。更特别地，药物组合物是基本上无菌的并且不含有对接受者具有过度毒性或感染性的任何药剂。
在某些实施例中，用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法进一步包括将组合物等分成药物产品形式。此类药物产品形式可以以单位剂型(例如在安瓿、单剂量容器或多剂量容器中)存在。如果希望，这些药物产品形式可以存在于小药瓶、包装或分配器装置中，其可包含一个或多个含有双特异性抗体的单位剂型。
在某些实施例中，用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法进一步包括冻干该组合物。在某些实施例中，冻干步骤在将组合物等分成药物产品形式后进行。冻干药物组合物的方法是本领域已知并且常用的。参见例如，Cryopreservation and Freeze-DryingProtocols[冷冻保存和冻干协议](J.G.Day和G.N.Stacey编辑,Springer[斯普林格出版社]2017)。冻干步骤可以在等分步骤之前或之后进行。
在某些实施例中，用于制备包含双特异性抗体的组合物的方法进一步包括喷雾干燥该组合物。喷雾干燥药物组合物的方法是本领域已知并且常用的。例如，Niven,R.,Prestrelski,S.J.,Treuheit,M.J.,Ip,A.Y.和Arakawa,T.Protein NebulizationII.Stabilization of G-CSF to air-jet nebulization and the role ofprotectants.[蛋白质雾化II.G-CSF对喷气雾化的稳定作用以及保护剂的作用](1996)Int.J.Pharm.[国际药物杂志]127,191-20。喷雾干燥步骤可以在等分步骤之前或之后进行。
本文披露的方法减少了双特异性抗体的聚集体。这些方法基于令人惊讶的发现，即当将解冻的抗体在某一温度(例如，约5℃至约45℃)下保持至少4小时的时间段(例如，约4小时至约96小时的时间段)时，在冷冻条件(例如，约-20℃至约-40℃)下储存期间形成的聚集体减少。不希望受任何理论束缚，据信聚集体在保持期后逆转回到未聚集状态。
在某些实施例中，聚集体包含HMW聚集体。在某些实施例中，双特异性抗体在保持期后包含低于约5％、或低于约3％、或低于约2％、或低于约1％、或低于约0.5％的HMW聚集体。在某些实施例中，在冷冻条件下形成的HMW聚集体降低至与冷冻前相同的水平或基本上相同的水平。在某些实施例中，HMW聚集体包含双特异性抗体的二聚体。在某些实施例中，双特异性抗体在保持期后包含低于约1％的双特异性抗体的二聚体。在某些实施例中，双特异性抗体在保持期后包含低于约0.5％的双特异性抗体的二聚体。
在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药在保持期后包含低于约5％、或低于约3％、或低于约2％、或低于约1％、或低于约0.5％的HMW聚集体。在某些实施例中，HMW聚集体包含双特异性抗体的二聚体。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药在保持期后包含低于约1％的双特异性抗体的二聚体。在某些实施例中，包含双特异性抗体的原料药在保持期后包含低于约0.5％的双特异性抗体的二聚体。
本文披露的方法对双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药的稳定性属性没有或基本上没有影响。在某些实施例中，这些方法产生具有与冷冻前的双特异性抗体或原料药相比相同的或基本上相同的颜色和/或透明度的双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。在某些实施例中，这些方法产生具有与冷冻前的双特异性抗体或原料药相比相同的或基本上相同的电荷变体的双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。在某些实施例中，这些方法产生具有与冷冻前的双特异性抗体或原料药相比相同的或基本上相同的效力的双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。在某些实施例中，这些方法产生具有与冷冻前的双特异性抗体或原料药相比相同的或基本上相同的剪切水平的双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。在某些实施例中，这些方法产生具有与冷冻前的双特异性抗体或原料药相比相同的或基本上相同的化学修饰(例如，糖基化)的双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。在某些实施例中，这些方法产生具有与冷冻前的双特异性抗体或原料药相比相同的或基本上相同的pH的双特异性抗体或包含双特异性抗体的原料药。
双特异性抗体
可用于本文披露的方法的双特异性抗体包括在冷冻条件下，例如，在-20℃至-50℃范围内的温度下，倾向于聚集的那些(例如，由于抗体的不同区域之间的疏水相互作用)。如本文所用的，术语“双特异性抗体”应理解为是指能够特异性结合两种不同抗原或靶标或表位的抗体。在某些实施例中，该双特异性抗体包含与一种抗原或靶标特异性结合的第一结构域和与另一种抗原或靶标特异性结合的第二结构域。在某些实施例中，该双特异性抗体的第一结构域特异性结合靶细胞表面抗原，并且双特异性抗体的第二结合结构域特异性结合人CD3，即T细胞上T细胞受体复合物的亚基。在某些优选的实施例中，该双特异性抗体是双特异性T细胞接合(BiTE)抗体构建体。参见例如，WO 2008119567和WO 2017134140。
如本文以下的，术语“结构域特异性结合”或“结构域结合”应理解为是指与给定靶标或表位特异性结合/相互作用/识别其的结构域。抗体构建体的结合结构域包含允许靶结合的抗体的最小结构要求。这种最小要求可以通过存在至少三个轻链CDR(即轻链可变区(VL)的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即重链可变区(VH)的CDR1、CDR2和CDR3)、优选地全部六个CDR来定义。优选地，那些CDR包含在抗体VL和抗体VH的框架中。该术语包括全长抗体和抗体变体的片段。抗体片段、抗体变体或结合结构域的实例包括(1)Fab片段，一种具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab')2片段，一种具有由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，衍生自scFV文库)。另外的抗体片段包括VH、VHH、VL、(s)dAb、Fab’和“r IgG”(“半抗体”)。
术语“抗体构建体”应理解为是指一种分子，其中结构和/或功能基于抗体例如全长或整个免疫球蛋白分子的结构和/或功能，和/或从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取。因此，抗体构建体能够结合其特异性靶标或抗原。抗体构建体还包括修饰的抗体片段(也称为抗体变体，如scFv、二scFv或双(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab)、串联二scFv、串联三scFv)、“多抗体”如三抗体或四抗体以及仅包含一个可变结构域(它可能是VHH、VH或VL)的单结构域抗体(如纳米抗体或单可变结构域抗体，其可能独立于其他V区或结构域特异性地结合抗原或表位)。
如本文所用，术语“单链Fv”、“单链抗体”或“scFv”应理解为是指单个多肽链抗体片段，其包含来自重链和轻链的可变区但缺乏恒定区。通常，单链抗体进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得该单链抗体能够形成允许抗原结合的所需结构。Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约,第269-315页(1994)中详细讨论了单链抗体。产生单链抗体的各种方法是已知的，包括以下中所描述的那些：美国专利号4,694,778和5,260,203；国际专利申请公开号WO88/01649；Bird(1988)Science[科学]242:423-442；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Ward等人(1989)Nature[自然]334:54454；Skerra等人(1988)Science[科学]242:1038-1041。在特定的实施例中，单链抗体也可以是双特异性人的和/或人源化的和/或合成的。
在某些实施例中，双特异性抗体的第一和第二结构域是“双特异性单链抗体构建体”、更优选双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头(如本文所述)连接，该合成接头使它们能够制成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子；参见例如，Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整或全长抗体相同的方式评价片段的功能。因此，scFv是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其通常与约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔韧性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以使VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链可变片段(具有(scFv)2形式的二scFv或双scFv)可以通过连接两个scFv分子(例如，使用如上文所述的接头)而被工程化。连接可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单条肽链从而产生串联scFv来进行(参见例如，Kufer P.等人,(2004)Trendsin Biotechnology[生物技术趋势]22(5):238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scFv分子，这些接头肽对于两个可变区来说太短以致于不能折叠在一起(例如约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体(参见，例如Hollinger,Philipp等人,(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America[美国国家科学院院刊]90(14):6444-8)。
在某些实施例中，双特异性抗体的第一结构域和第二结构域分别特异性结合靶细胞表面抗原和人CD3。在某些实施例中，双特异性抗体的第一结构域和第二结构域形成呈选自由以下组成的组的形式的双特异性抗体构建体：(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体和那些形式中的任一种的寡聚物。
在某些实施例中，第一、第二、或第一和第二结构域可以包含单结构域抗体，其分别为单结构域抗体的可变结构域或至少CDR。单结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域，该抗体可变结构域能够独立于其他V区或结构域而选择性结合至特定抗原。第一单结构域抗体是从骆驼中发现的重链抗体工程化而来，并且这些被称为VHH片段。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR)，可以从这些重链抗体中获得称为VNAR片段的单结构域抗体。一种替代方法是将来自常见免疫球蛋白(例如来自人或啮齿动物)的二聚体可变结构域分裂成单体，由此获得作为单结构域Ab的VH或VL。尽管对单结构域抗体的大多数研究目前都是基于重链可变结构域，但源自轻链的纳米抗体也显示出与靶表位特异性结合。单结构域抗体的实例是所谓的sdAb、纳米抗体或单可变结构域抗体。
在某些实施例中，双特异性抗体的第一(结合)结构域结合靶细胞表面抗原。在一些实施例中，该靶细胞表面抗原是CD70。CD70(也称为CD27L或TNFSF7)是II型整合膜蛋白，其正常表达限于活化的T细胞和B细胞、成熟的树突细胞和胸腺髓样上皮细胞的子集。
在其他实施例中，该靶细胞表面抗原是肿瘤抗原。如本文所用的，术语“肿瘤抗原”应理解为是指呈递在肿瘤细胞上的那些抗原。这些抗原可以以胞外部分呈递在细胞表面上，所述胞外部分通常与分子的跨膜和细胞质部分组合。这些抗原有时只能由肿瘤细胞呈递，而不能由正常细胞呈递。肿瘤抗原可以仅仅在肿瘤细胞上表达或者可能代表与正常细胞相比的肿瘤特异性突变。在这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，并且它们被称为肿瘤相关抗原。与正常细胞相比，这些肿瘤相关抗原可以过表达，或者由于与正常组织相比肿瘤组织的结构不那么紧密，因此在肿瘤细胞中易于抗体结合。在一些实施例中，第二(结合)结构域与选自以下的肿瘤抗原结合：CD19、CD33、表皮生长因子受体变体iii(EGFRvIII)、间皮素(MSLN)、钙粘素19(CDH19)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、δ样配体3(DLL3)、胎盘钙粘素(CDH3)、B细胞成熟抗原(BCMA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在一些实施例中，肿瘤抗原是人肿瘤抗原。
在某些实施例中，双特异性抗体的第二(结合)结构域与T细胞表面上的人CD3ε结合。在某些优选的实施例中，双特异性抗体的第二结构域与人CD3ε链的细胞外表位结合。在一些优选的实施例中，与人CD3的细胞外表位结合的双特异性抗体的第二结构域包含VL区，该VL区包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:27中所描绘的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:28中所描绘的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:29中所描绘的CDR-L3；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:117中所描绘的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:118中所描绘的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:119中所描绘的CDR-L3；以及
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:153中所描绘的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:154中所描绘的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:155中所描绘的CDR-L3。
在另一个优选的实施例中，双特异性抗体的第二结构域与人CD3ε链的细胞外表位结合并且包含VH区，该VH区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:12中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:13中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:14中所描绘的CDR-H3；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:30中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:31中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:32中所描绘的CDR-H3；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:48中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:49中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:50中所描绘的CDR-H3；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:66中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:67中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:68中所描绘的CDR-H3；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:84中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:85中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:86中所描绘的CDR-H3；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:102中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:103中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:104中所描绘的CDR-H3；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:120中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:121中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:122中所描绘的CDR-H3；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:138中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:139中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:140中所描绘的CDR-H3；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:156中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:157中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:158中所描绘的CDR-H3；以及
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:174中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:175中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:176中所描绘的CDR-H3。
在某些优选的实施例中，将上述三组VL CDR与上述十组VH CDR在第二结合结构域内组合以形成(30)组，每组包含CDR 1-3。
同样优选的是，与CD3结合的第二结构域包含VH区，该VH区选自以下VH区的组：如WO 2008/119567的SEQ ID NO:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所描绘的或本序列表中如SEQ ID NO:15或24所描绘的。
优选的，与CD3结合的第二结构域包含VL区，该VL区选自以下VL区的组：如WO2008/119567的SEQ ID NO:17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中所描绘的或本序列表中如SEQ ID NO:16或25所描绘的。
更优选地，双特异性抗体的特征在于结合CD3的第二结构域，该第二结构域包含选自以下的VL区和VH区：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:17或21中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:15或19中所描绘的VH区；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:35或39中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:33或37中所描绘的VH区；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:53或57中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:51或55中所描绘的VH区；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:71或75中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:69或73中所描绘的VH区；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:89或93中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:87或91中所描绘的VH区；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:107或111中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:105或109中所描绘的VH区；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:125或129中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:123或127中所描绘的VH区；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:143或147中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:141或145中所描绘的VH区；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:161或165中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:159或163中所描绘的VH区；或者
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:179或183中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:177或181中所描绘的VH区。
同样在优选的实施例中，双特异性抗体包含与CD3结合的第二结构域，该第二结构域包含如SEQ ID NO:16或25中所描绘的VL区和在本序列表中如SEQ ID NO:15或24中所描绘的VH区。
以上所述的双特异性抗体的优选的实施例的特征在于结合CD3的第二结构域包含选自以下的氨基酸序列：WO 2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或在本序列表中如SEQ ID NO:26中所描绘的。
根据优选的实施例，第一结构域和/或第二结构域具有以下形式：VH区和VL区的对是呈单链抗体(scFv)的形式。VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序排列。优选地，VH区位于接头序列的N-末端且VL区位于接头序列的C-末端。在某些实施例中，双特异性抗体的第一结构域和第二结构域形成呈选自以下的形式的双特异性抗体：(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体或那些形式中的任一种的寡聚物。
在某些优选的实施例中，该双特异性抗体进一步包含第三结构域。在某些实施例中，该第三结构域是单链Fc(scFc)结构域。在某些优选的实施例中，该scFc结构域是scFc半衰期延长的(HLE)结构域。
术语“Fc”部分或“Fc”单体应理解为是指多肽，其包含至少一个具有CH2结构域功能的结构域和至少一个具有免疫球蛋白分子的CH3结构域功能的结构域。包含那些CH结构域的多肽是“多肽单体”。Fc单体可以是多肽，其至少包含免疫球蛋白的恒定区的片段，不包括重链的第一恒定区免疫球蛋白结构域(CH1)，但至少保持一个CH2结构域的功能部分和一个CH3结构域的功能部分，其中CH2结构域是CH3结构域的氨基末端。在优选的实施例，Fc单体可以是包含Ig-Fc铰链区、CH2区和CH3区的一部分的多肽恒定区，其中铰链区是CH2结构域的氨基末端。据信，双特异性抗体的铰链区促进二聚化。此类Fc多肽分子可通过例如免疫球蛋白区域的木瓜蛋白酶消化(当然产生两个Fc多肽的二聚体)来获得。在另一个实施例中，Fc单体可以是包含CH2区和CH3区的一部分的多肽区。此类Fc多肽分子可通过例如免疫球蛋白分子的胃蛋白酶消化来获得。在一个实施例中，Fc单体的多肽序列基本上类似于以下的Fc多肽序列：IgG1 Fc区、IgG2 Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgDFc区和IgE Fc区。(参见例如，Padlan,Molecular Immunology[分子免疫学],31(3),169-217(1993))。在一个实施例中，Fc单体具有如WO 2014/153063中披露的氨基酸序列。由于免疫球蛋白之间存在一些变化，并且仅为了清楚起见，Fc单体应理解为是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区免疫球蛋白结构域。如上所述，Fc单体还可以包括这些结构域的柔性铰链N-末端。对于IgA和IgM，Fc单体可以包括J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管Fc部分的边界可以改变，但包含功能铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可以定义为例如包含残基D231(铰链结构域的残基-对应于下表1中的D234)至CH3结构域的羧基末端的P476，分别地L476(对于IgG4)，其中编号是根据Kabat的。经由肽接头彼此融合的两个Fc部分或Fc单体定义本发明的抗体构建体的第三结构域，该第三结构域也可以被定义为scFc结构域。
IgG铰链区可以使用表1中列出的Kabat编号通过类比来鉴定。设想第三结构域的铰链结构域/区包含对应于根据Kabat编号的D234至P243的IgG1序列段的氨基酸残基。同样设想，第三结构域的铰链结构域/区包含IgG1铰链序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:191)(对应于如下表1所示的区段D234至P243-也设想所述序列的变异，只要铰链区仍然促进二聚化)或由其组成。在优选的实施例中，抗体构建体的第三结构域中CH2结构域的Kabat位置314处的糖基化位点通过N314X取代去除，其中X是除Q之外的任何氨基酸。所述取代优选为N314G取代。在更优选的实施例中，所述CH2结构域另外包含以下取代(根据Kabat的位置)：V321C和R309C(这些取代在Kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。
表1：铰链区的氨基酸残基的Kabat编号
在一些实施例中，铰链结构域/区包含以下或由其组成：IgG2亚型铰链序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:192)、IgG3亚型铰链序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:193)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:194)和/或IgG4亚型铰链序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:195)。IgG1亚型铰链序列可以是以下一种EPKSCDKTHTCPPCP(如表1和SEQ ID NO:196所示)。因此，在双特异性抗体的上下文中也设想了这些核心铰链区。
IgG CH2和IgG CD3结构域的位置和序列可以使用表2中列出的Kabat编号通过类比来鉴定：
表2：IgG CH2和CH3区的氨基酸残基的Kabat编号
在一个实施例中，第一或两个Fc单体的CH3结构域中强调的粗体氨基酸残基是缺失的。
如果使用接头将第一结构域与第二结构域融合或将第一结构域或第二结构域与第三结构域融合，则接头优选具有足以确保第一和第二结构域中的每一个都能够彼此独立地保持其差异结合特异性的长度和序列。对于连接双特异性抗体构建体中至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，仅包含少量氨基酸残基例如12个氨基酸残基或更少的肽接头是优选的。因此，12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4个、3个、2个或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。
特别优选的“单个”氨基酸“肽接头”是Gly。因此，肽接头可以由单个氨基酸Gly组成。在优选的实施例中，肽接头的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser(SEQ ID NO:197))或其聚合物(即(Gly4Ser)x，其中x是1或更大(例如2或3)的整数)。在另一个优选的实施例中，肽接头具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser(SEQ IDNO:197))或其聚合物(即(Gly4Ser)x，其中x是5或更大(例如5、6、7、8等或更大)的整数)。在某些实施例中，x优选为6((Gly4Ser)6)。肽接头的特征(包含不存在二级结构的促进)在本领域是已知的并且描述于例如以下文献中：Dall'Acqua等人(Biochem.[生物化学](1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol[分子免疫学](1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB[美国实验生物学学会联合会](1995)9(1),73-80)。不促进任何二级结构的肽接头是优选的。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor,New York[纽约冷泉港],2001)。
用于第一结构域和第二结构域融合的肽接头的优选实施例具有Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的氨基酸序列，即Gly4Ser(SEQ ID NO:197)。用于融合第二结构域和第三结构域的肽接头的优选接头实施例是(Gly)4-接头，分别是G4-接头。
第三结构域的多肽单体(“Fc部分”或“Fc单体”)彼此融合的肽接头优选包含至少25个氨基酸残基(25、26、27、28、29、30等)。更优选地，该肽接头包含至少30个氨基酸残基(30、31、32、33、34、35等)。接头还优选包含多达40个氨基酸残基、更优选多达35个氨基酸残基、最优选恰好30个氨基酸残基。此类肽接头的优选实施例的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser(SEQ ID NO:197))或其聚合物(即(Gly4Ser)x，其中x是5或更大(例如6，7或8)的整数)。该整数优选为6或7，该整数更优选为6。
在一些优选的实施例中，双特异性抗体的第三结构域是具有氨基至羧基顺序的HLE结构域：
铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
在某些实施例中，第三结构域的一个或优选地每个(两个)多肽单体的CH2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。如本领域已知的，术语“半胱氨酸二硫桥”是指具有通用结构R-S-S-R的官能团。该连接也称为SS键或二硫桥，并且通过偶联半胱氨酸残基的两个硫醇基团衍生。对于双特异性抗体，特别优选将在成熟抗体构建体中形成半胱氨酸二硫桥的半胱氨酸引入对应于309和321(Kabat编号)的CH2结构域的氨基酸序列中。
在一个实施例中，去除CH2结构域的Kabat位置314中的糖基化位点。优选通过N314X取代实现糖基化位点的去除，其中X是除Q之外的任何氨基酸。该取代优选为N314G取代。在更优选的实施例中，所述CH2结构域另外包含以下取代(根据Kabat的位置)：V321C和R309C(这些取代在Kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。
假定与例如本领域中已知的双特异性异质Fc抗体构建体相比双特异性的优选特征可以尤其涉及在CH2结构域中引入上述修饰。因此，优选的是，双特异性抗体的第三结构域中的CH2结构域包含Kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥和/或Kabat位置314处的糖基化位点如上所述通过N314X取代去除，优选通过N314G取代去除。
在进一步优选的实施例中，双特异性抗体的第三结构域中的CH2结构域包含Kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥，并且Kabat位置314处的糖基化位点通过N314G取代去除。
在某些实施例中，双特异性抗体的第三结构域以氨基至羧基顺序包含以下或由其组成：DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:191)(即铰链)-CH2-CH3-接头-DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:191)(即铰链)-CH2-CH3。在一个优选实施例中，上述双特异性抗体的肽接头的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO:197)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为5或更大的整数(例如5、6、7、8等或更大)，优选为6((Gly4Ser)6)。抗体可以进一步包含上述取代N314X、优选N314G，和/或其他取代V321C和R309C。
双特异性抗体还可以包含另外的结构域，这些结构域例如有助于分离分子或涉及该分子的适应性药代动力学特征。有助于分离抗体构建体的结构域可以选自肽基序或辅助性地引入的部分，这些部分可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类另外的结构域的非限制性实施例包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、几丁质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签以及其变体(例如StrepII-标签)和His标签的肽基序。本文披露的所有双特异性抗体都可以包含His-标签结构域，该His-标签结构域通常称为分子的氨基酸序列中的优选5个、且更优选6个His残基(六组氨酸)的连续His残基重复序列。His标签可以位于例如抗体构建体的N-或C-末端，它优选位于C-末端。最优选地，六组氨酸标签(HHHHHH)(SEQ ID NO:198)经由肽键与双特异性抗体的C-末端连接。另外，PLGA-PEG-PLGA的缀合物系统可以与聚组氨酸标签组合用于持续释放应用和改善的药代动力学特征。
在某些实施例中，双特异性抗体包含第一结构域和第二结构域，其中：
(i)第一结构域包含两个抗体可变结构域，并且第二结构域包含两个抗体可变结构域；
(ii)该第一结构域包含一个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域；
(iii)该第一结构域包含两个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域；或者
(iv)该第一结构域包含一个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域。
因此，第一和第二结构域可以是各自包含两个抗体可变结构域如VH和VL结构域的结合结构域。包含两个抗体可变结构域的这种结合结构域的实例在上文中描述，并且包含例如上文所述的Fv片段、scFv片段或Fab片段。可替代地，这些结合结构域中的一个或两个可以仅包含单个可变结构域。这种单结构域结合结构域的实例在上文进行了描述并且包括例如仅包含一个可变结构域(它可能是VHH、VH或VL)的纳米抗体或单可变结构域抗体，其独立于其他V区或结构域特异性地结合抗原或表位。
在一些优选的实施例中，双特异性抗体包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中第一结构域与CD70结合，第二结构域与人CD3结合，并且第三结构域是具有氨基至羧基顺序的HLE结构域：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。在其他优选的实施例中，双特异性抗体包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中第一结构域与选自以下的肿瘤抗原结合：CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、BCMA或PSMA，第二结构域与人CD3结合，并且第三结构域是具有氨基至羧基顺序的HLE结构域：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。在优选的实施例中，第一结构域和第二结构域通过肽接头与第三结构域融合。优选的肽接头已在上文描述并且特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为1或更大的整数(例如，2、3、4、5、6或7)。
在一些实施例中，双特异性抗体的特征在于具有选自以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:37至41； CD33
(b)SEQ ID NO:51和52； EGFRvIII
(c)SEQ ID NO:62、63和64； MSLN
(d)SEQ ID NO:74至82 CDH19
(e)SEQ ID NO:103和104 DLL3
(f)SEQ ID NO:17、113和114 CD19
(g)SEQ ID NO:92和93 FLT3
(h)SEQ ID NO:124和125 CDH3
(i)SEQ ID NO:135和136 BCMA
(j)SEQ ID NO:146至151、161至168和176至181PSMA或
(k)SEQ ID NO:188至190 CD70
任何前述双特异性抗体可以或可以不具有第三结构域，该第三结构域是半衰期延长的(HLE)结构域，其优选是scFc结构域或异质Fc结构域或白蛋白结合结构域。结合人CD3的双特异性抗体的第二结构域可以连接至HLE结构域的N-末端或C-末端(例如，经由如上所述的接头)。
在一些实施例中，该双特异性抗体是CD70xCD3双特异性抗体，其包含与CD70结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一个实施例中，该第一结构域与CD70结合并且具有如SEQ ID NO:182至187中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO9至14中所描绘的CDR。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该CD70xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是CD19xCD3双特异性抗体，其包含与CD19结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一个实施例中，该第一结构域与CD19结合并且具有如SEQ ID NO:1至6中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在另一个实施例中，该第一结构域与CD19结合并且具有如SEQ ID NO:105至107和109至111中所描绘的CDR，第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR，并且进一步包括HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该CD19xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施例中，CD19xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是BCMAxCD3双特异性抗体，其包含与BCMA结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与BCMA结合并且具有如SEQ IDNO:126至131中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有如SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该BCMAxCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ IDNO:132的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该BCMAxCD3双特异性抗体包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施例中，该BCMAxCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是CD33xCD3双特异性抗体，其包含与CD33结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与CD33结合并且具有如SEQ IDNO:29至31和34至36中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该CD33xCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQID NO:27或28的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该CD33xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施例中，该BCMAxCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是EGFRvIIIxCD3双特异性抗体，其包含与EGFRvIII结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与EGFRvIII结合并且具有如SEQ ID NO:42至47中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该EGFRvIIIxCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该EGFRvIIIxCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是MSLNxCD3双特异性抗体，其包含与MSLN结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与MSLN结合并且具有如SEQ IDNO:53至58中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该MSLNxCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该MSLNxCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该MSLNxCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是CDH19xCD3双特异性抗体，其包含与CDH19结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与CDH19结合并且具有如SEQ IDNO:65至70中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该CDH19xCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该CDH19xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:74-82中任一项的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该CDH19xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是DLL3xCD3双特异性抗体，其包含与DLL3结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与DLL3结合并且具有如SEQ IDNO:94至99中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该DLL3xCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该DLL3xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是FLT3xCD3双特异性抗体，其包含与FLT3结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与FLT3结合并且具有如SEQ IDNO:83至88中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该FLT3xCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该FTL3xCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是CDH3xCD3双特异性抗体，其包含与CDH3结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与CDH3结合并且具有如SEQ IDNO:115至120中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID No:9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该CDH3xCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该CDH3xCD3双特异性抗体包含SEQ IDNO:125的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，该双特异性抗体是PSMAxCD3双特异性抗体，其包含与PSMA结合的第一结构域和与CD3结合的第二结构域。在一些实施例中，该双特异性抗体进一步包含HLE结构域(第三结构域)。在一个实施例中，该第一结构域与PSMA结合并且具有如SEQ IDNO:137至142中所描绘的CDR，该第二结构域与CD3结合并且具有SEQ ID NO 9至14中所描绘的CDR。在一个实施例中，该PSMAxCD3双特异性抗体包含VH和VL，其中该VH包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且该VL包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该PSMAxCD3双特异性抗体包含SEQ IDNO:146至151、161至168和176至181中任一个的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施例中，该PSMAxCD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
本文披露的双特异性抗体可以通过本领域已知的方法制备。例如，双特异性抗体可以通过WO 2008/119657和WO 2017/134140中披露的方法制备。
在一些实施例中，该双特异性抗体是双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质。先前已经描述了双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质。参见，例如，国际公开号WO 2017/040344；美国专利公开号2015/0079088。“双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质”或“掩蔽的双特异性结合蛋白质”应理解为是指结合两种不同的抗原或表位的掩蔽的抗原结合蛋白质。“掩蔽的抗原结合蛋白质”是包括与抗原结合结构域(AB)偶联(例如通过共价键或接头)的掩蔽结构域(MD)的蛋白质，使得MD的偶联抑制或降低AB与其抗原的结合。MD进一步包含蛋白质识别位点(PR)，该蛋白质识别位点包括蛋白质或蛋白酶的底物或结合位点，使得当蛋白质或蛋白酶结合和/或裂解该蛋白质识别位点时，AB结构域结合抗原或增加或诱导AB结构域与抗原的结合。掩蔽的抗原结合蛋白质先前已经描述于例如国际公开号WO 2017/040344、美国专利号9540440、美国公开号20150118254、美国专利号9127053、美国专利号9517276、和美国专利号8563269中。对于技术人员将是显而易见的是，在一些实施例中，由于蛋白酶对PR的裂解，掩蔽的抗原结合蛋白质可以缺乏MD，这导致至少MD的释放(例如，其中MD未通过共价键(例如半胱氨酸残基之间的二硫键)与该掩蔽的抗原结合蛋白质连接)。
在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质是Probody(如描述于，例如Polu KR和Lowman HB.Expert Opin Biol Ther.[生物疗法的专家意见]2014年8月；14(8):1049-53；或Desnoyers LR等人,Sci Transl Med.[科学转化医学]2013年10月16日；5(207))或ProTIA前药(如描述于，例如Schellenberger V.Amunix unveils next-generationimmuno-oncologic cancer therapy platform.[Amunix公司公布了下一代免疫肿瘤癌症疗法平台]https://biopharmadealmakers.nature.com.2016年9月版,B20；还参见http://www.amunix.com/technology/pro-tia/)。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质从N-末端到C-末端具有如下的结构排列：MD-AB或AB-MD。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质包括连接肽(LP)，并且该掩蔽的抗原结合蛋白质从N-末端到C-末端具有如下的结构排列：MD-LP-AB或AB-LP-MD。
当掩蔽的抗原结合蛋白质在天然状态下处于存在抗原的情况下时，与当掩蔽的抗原结合蛋白质处于活性状态时(即，当蛋白质或蛋白酶与PR结合和/或除去或移位MD时)AB与抗原的结合相比，AB与抗原的结合减少或被抑制。当与不与MD缔合的AB的结合相比时(即，当掩蔽的抗原结合蛋白质处于活性状态时)，当在体外和/或体内结合测定中测量时，该掩蔽的抗原结合蛋白质在天然状态下结合抗原的能力降低，例如，降低了至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或甚至约100％。
在一些实施例中，该蛋白质识别位点(PR)作为蛋白酶(优选细胞外蛋白酶)的底物起作用。可以基于蛋白质或蛋白酶来选择PR，该蛋白质或蛋白酶由接近表达抗原的细胞的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生和/或由与掩蔽的抗原结合蛋白质的AB的所希望抗原共定位于组织中的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生。在一些实施例中，该蛋白酶是u型纤溶酶原激活剂(uPA，也称为尿激酶)、豆荚蛋白和/或蛋白裂解酶(也称为MT-SP1或MTSP1)。在一些实施例中，该蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)。在一些实施例中，该蛋白酶是描述于Rawlings,N和Salvesen,G.Handbook of Proteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册](第三版).爱思唯尔公司(Elsevier),2013.ISBN:978-0-12-382219-2中的蛋白酶之一。
在一些实施例中，双特异性抗原结合蛋白质的一种抗体或其抗原结合片段(AB1)结构域对靶抗原具有特异性，并且另一种抗体或其抗原结合片段(AB2)结构域对另一种靶抗原具有特异性。在一些实施例中，双特异性抗原结合蛋白质的一种抗体或其抗原结合片段(AB1)结构域对靶抗原的表位具有特异性，并且另一种抗体或其抗原结合片段(AB2)结构域对相同靶抗原的另一个表位具有特异性。
术语“抗体片段”、“其抗体片段”或“抗原结合抗体片段”应理解为是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”或“其抗原结合片段”是指与抗原结合的完整抗体的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、线性抗体、scFv、和单链抗体。
双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包括至少一个包含蛋白质识别位点(PR)的掩蔽结构域(MD)，其中MD抑制或降低AB与抗原的结合。该至少一个MD包含蛋白质识别位点(PR)，该蛋白质识别位点包括蛋白质或蛋白酶的底物或结合位点，使得当蛋白质或蛋白酶结合和/或裂解该蛋白酶识别位点时，AB结构域结合抗原或结合增加。对于双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质，该掩蔽的抗原结合蛋白质优选包含两个MD(例如MD1和MD2)，其降低每个抗原结合结构域(AB1和AB2)结合其各自的抗原或表位的能力。
本文提供的掩蔽双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质在循环中是稳定的并且在预期的疗法和/或诊断位点被激活，但在正常(即健康)组织中不被激活。当处于活性状态时，该掩蔽的抗原结合蛋白质和/或双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质展现出与抗原的结合，所述结合至少与相应的未修饰的抗体或双特异性或多特异性抗原结合蛋白质(即，不包含掩蔽结构域的对应抗体(counterpart))与抗原的结合相当。
在多个实施例中，本文描述的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质结合人CD3。例如，在多个方面，双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质通过T细胞上的CD3ε的接合来激活T细胞。也就是说，抗体激动、刺激、激活和/或增强CD3介导的T细胞激活。CD3的生物学活性包括，例如T细胞激活以及通过T细胞受体(TCR)的CD3与抗原结合亚基之间的相互作用的其他信号传导。
本文披露的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质任选地与CD3ε结合，其中结合常数(Kd)≤1μM，例如，在一些实施例中，≤100nM、≤10nM、或≤1nM。
在多个方面，该双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质结合表皮生长因子受体(EGFR)。本文披露的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质任选地与人EGFR结合，其中结合常数(Kd)≤1μM，例如，在一些实施例中，≤100nM、≤10nM、或≤1nM。
在优选的实施例中，该掩蔽的双特异性或多特异性抗原结合蛋白质结合CD3和EGFR二者。
在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质是异源二聚体，使得它包括作为Fab(例如IgG Fab)的抗原结合结构域和作为scFv的抗原结合结构域。例如，在示例性实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质包含结合一个靶标(例如EGFR)的重链和轻链(例如IgG重链和轻链)以及结合第二靶标(例如，T细胞表面抗原例如CD3)的scFv结构域。单链抗体(scFv)是抗原结合蛋白质，其中VL和VH区通过接头(例如，通常长度为约15至约20个氨基酸的氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白质链，其中该接头足够长以允许蛋白质链在自身上回折并形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等人,1988,Science[科学]242:423-26和Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA 85:5879-83)。适用于scFv的接头的实例是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:199)。其他示例性接头含有至少4-5个氨基酸，范围为从约4个残基至约20个残基。
掩蔽的抗原结合蛋白质的示例性形式包含(i)含有scFv的两条重链，该scFv可操作地附接在一条或两条重链的N-末端附近，和(ii)两条轻链，其与重链缔合以形成抗原结合结构域，其中该scFv结合CD3并且Fab部分结合EGFR。在这个实例中，该抗原结合蛋白质包含三个(或四个)抗原结合结构域，其典型地结合两种或更多种不同的抗原(或表位)。适于将scFv连接至重链可变区的接头的实例是GGGGS(SEQ ID NO:197)。示例性接头含有至少1个具有4-5个氨基酸的合适接头。
掩蔽的抗原结合蛋白质包含与抗体(AB)偶联(例如，通过共价键或另一种形式的附接)的掩蔽结构域(MD)。掩蔽结构域(MD)包含掩蔽肽(或掩蔽多肽)(MP)和蛋白质识别位点(PR)。掩蔽肽(或掩蔽多肽)可以是一段氨基酸，其妨碍抗原结合结构域与其抗原的结合。通常，采用长度为5-15个氨基酸的短序列的掩蔽肽，但也考虑了更短和更长的序列(即掩蔽多肽)。掩蔽结构域进一步描述于，例如国际公开号Wo 2017/040344；美国专利公开号2015/0079088(通过引用以其整体并入，并且特别是关于与结合EGFR的抗体一起使用的掩蔽结构域的披露内容)和美国专利公开号2016/0194399(通过引用以其整体并入，并且特别是关于与结合CD3的抗体一起使用的掩蔽结构域的披露内容)中。
在一些实施例中，该掩蔽肽(或掩蔽多肽)(MP)通过蛋白质识别位点(PR)附接到抗原结合结构域(AB)，该蛋白质识别位点任选地是更大接头序列的一部分(即，将MP连接到抗原结合蛋白质的一段氨基酸)。PR作为蛋白质或蛋白酶(优选细胞外蛋白酶)的底物(或结合位点)起作用。可以基于蛋白质或蛋白酶来选择PR，该蛋白质或蛋白酶由接近表达靶标的细胞的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生和/或由与掩蔽的抗原结合蛋白质的至少一种AB的所希望靶标共定位于组织中的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生。在一些实施例中，该蛋白酶是u型纤溶酶原激活剂(uPA，也称为尿激酶)、豆荚蛋白和/或蛋白裂解酶(也称为MT-SP1或MTSP1)。在一些实施例中，该蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)。在一些实施例中，该蛋白酶是描述于Rawlings,N和Salvesen,G.Handbook of Proteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册](第三版).爱思唯尔公司(Elsevier),2013.ISBN:978-0-12-382219-2中的蛋白酶之一。可替代地，MP通过不可裂解的蛋白质结合结构域与抗原结合蛋白质偶联。在这方面，PR任选地是氨基酸序列，该氨基酸序列在与例如蛋白质或蛋白酶相互作用时构象改变，使得MP的位置被调整并且AB可自由地结合靶标。
在本披露的多个方面，双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含构建体的每个抗原结合部分(例如AB1、AB2、AB3等)的MD。例如，包含两个Fab部分和两个scFv的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质可以包含两组MD，这两组MD可独立地是相同或不同的。为了说明，双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含(i)结合CD3的两个scFv和附接到每个scFv的MD1(对于每个scFv，任选地是相同的MD)，和(ii)结合EGFR的两个Fab部分和附接到每个Fab的MD2(对于每个Fab，任选地是相同的MD)。在多个方面，MD1和MD2的PR包含相同的蛋白质识别序列，允许在与蛋白酶接合后在相同环境中释放每个结合区的MD。MD可以附接在抗原结合结构域的N-末端或C-末端，只要MD能够妨碍抗原结合结构域与靶标的结合，并且一旦释放MD接头不会干扰结合。当抗原结合结构域是Fab时，MD可以与重链可变区或轻链可变区可操作地连接。在双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含具有与重链融合的Fab抗原结合结构域和scFv二者的完整抗体(即“堆叠”构象)的情况下，与Fab抗原结合结构域缔合的MD优选地与轻链可变区融合。
在一些实施例中，双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质中的一个AB结构域(例如AB1)与T细胞表面配体(例如CD3)接合，并任选地采用scFv的形式。与CD3接合的示例性掩蔽的抗原结合蛋白质包括但不限于国际公开号WO 2017/040344、美国专利公开号20160194399。
在一些实施例中，抗原结合蛋白质中的一个AB结构域(例如AB2)与肿瘤抗原(例如EGFR)接合。与EGFR接合的示例性掩蔽的抗原结合蛋白质包括但不限于美国专利公开号20150079088中披露的那些抗体。
在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)被修饰以改变抗体的等电点。例如，在一些实施例中，一个或两个掩蔽结构域中的一个或多个带负电荷的pH敏感氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)被带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)取代。在一些实施例中，替换抗体的一个或多个掩蔽部分中的天冬氨酸可以增加pI。在一些实施例中，一个或两个掩蔽结构域中的一个或多个带负电荷的pH敏感氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)被除去或被中性氨基酸取代。
虽然本披露的掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)在本文中通常被描述为包含完整抗体结构，但是本披露还考虑使用缺少传统的两条重链/两条轻链结构的至少一部分的抗原结合抗体片段。用作掩蔽的抗原结合蛋白质的片段包含与如上所述的掩蔽结构域(MD)可操作地连接的抗原结合结构域(AB)。例如，在一些实施例中，该抗原结合蛋白质包含通过合适的接头(例如，足够长度以允许每个scFv结合其靶标的氨基酸区段)连接的两个scFv。一个或两个scFv附接到MD；当两个scFv附接到MD时，MD可以是相同或不同的(即，尽管在多个方面MP和/或PR是不同的，但优选地PR是相同的)。
本文披露的掩蔽的双特异性抗体可以通过本领域已知的方法制备，例如，如国际公开号WO 2017/040344；美国专利公开号2015/0079088；和美国专利公开号2016/0194399中所述的方法。
表3列出了本文披露的序列。
表3
通过参考以下实例将更完全地理解本发明。然而，这些实例不应被解释为限制本发明的范围。
实例
实例1：在冷冻条件下(-20℃)储存时，BiTE分子的聚集增加
将包含各1mg/mL的HLE BiTE(MSLNxCD3、CD19xCD3、CD33xCD3、BCMAxCD3和DLL3xCD3)的并且pH值为pH 4.2的组合物装入5mL小药瓶中，并在-20℃下储存一个月。一个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定组合物中HMW聚集体(例如，双特异性抗体二聚体)的水平。SE-UHPLC使用尺寸排阻超高效分析柱基于其流体力学体积来分离溶液中的蛋白质。高分子量(聚集体峰)早于单体和较低分子量的峰洗脱。将组分等度洗脱，通过UV检测进行检测，整合，并且将结果报告为高分子量、主峰和低分子量峰的相对峰面积百分比。如图1所示，储存后各组合物中的HMW聚集体水平均增加。
实例2：BiTE分子聚集与pH和温度的关系
将包含浓度为1mg/mL的DLL3xCD3 HLE BiTE并且pH值为4.2、4.8或6.3的组合物装入5mL小药瓶中，并且在-20℃下储存1个月。一个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平并且结果如图2A所示。储存过程中形成的HMW聚集体似乎是pH依赖性的(图2A)。
同样，将包含浓度为1mg/mL的DLL3xCD3 HLE BiTE的组合物装入5mL小药瓶中并且在-10℃、-20℃、-30℃、-40℃和-70℃储存一个月。一个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平并且结果如图2B所示。当BiTE储存在-10℃、-20℃、-30℃时，HMW聚集体水平增加，当BiTE储存在低于包含BiTE的组合物的Tg'(-32℃)的温度下时，观察到HMW聚集体水平几乎没有增加(图2B)。
实例3：将解冻的BiTE保持在15℃与30℃之间的温度下降低了聚集水平
将包含浓度为1mg/mL、5mg/mL和13mg/mL的DLL3xCD3 HLE BiTE的组合物装入5mL小药瓶中，并且在-20℃下储存12个月。12个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平。将解冻的组合物在室温下再保持24小时，并且使用SE-UHPLC再次分析HMW聚集体水平。在保持期后，HMW聚集体水平降低至5％以下(图3A)。
在第二系列实验中，将包含浓度为0.5mg/mL和2mg/mL的EGFRvIIIxCD3 BiTE的组合物装入5mL小药瓶中，并且在-20℃下储存一个月。一个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平。将解冻的组合物在室温下再保持24小时，并且使用SE-UHPLC再次分析HMW聚集体水平。在保持期后，HMW聚集体水平降低至5％以下(图3B)。
在第三系列实验中，将包含浓度为1mg/mL的HLE BiTE(MSLNxCD3、CD19xCD3、CD33xCD3、CDH19xCD3、BCMAxCD3、DLL3xCD3、FLT3xCD3、PSMAxCD3和CD70xCD3)中每一种的组合物装入5mL小药瓶中，并且在-20℃下储存一个月。一个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平。将解冻的组合物在室温下再保持24小时，并且使用SE-UHPLC再次分析HMW聚集体水平。在保持期后，各组合物中的HMW聚集体水平降低至1％以下(图3C)。
在第四系列实验中，将包含浓度为1mg/mL的HLE BiTE(CD33xCD3和DLL3xCD3)中的每一种的组合物装入5mL中，并且在-30℃下储存18个月。18个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平。将解冻的组合物在室温下再保持24小时，并且使用SE-UHPLC再次分析HMW聚集体水平。在保持期后，各组合物中的HMW聚集体水平降低至0.4％以下(图3D)。
实例4：将解冻的BiTE保持在15℃与30℃之间的温度下不影响BiTE的稳定性属性
将包含浓度为13mg/mL的DLL3xCD3 HLE BiTE的组合物装入5mL小药瓶中，并且在-20℃下储存12个月。12个月后，将组合物在室温下解冻，并且将解冻的组合物在室温下再保持24小时。在24小时保持期后，分析几种稳定性属性，并且结果如表4所示。
通过基于细胞的生物测定法测量HLE BiTE分子的效力，该生物测定法通过癌细胞系中的发光损失来测量细胞死亡。通过比较测试样品响应与参考标准物的响应(相对效力)，可以确定测试样品的生物活性。
使用还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)测量BiTE分子的剪切。rCE-SDS基于还原和变性条件下的流体动力学大小来分离蛋白质。将蛋白质变性，还原，且注射到填充有聚合物凝胶基质的裸熔融石英毛细管中。在毛细管上施加电压并且基于其流体动力学大小来将SDS包被的蛋白质分离；较小尺寸的蛋白质比较大尺寸的蛋白质迁移得更早。将蛋白质使用光电二极管阵列(PDA)检测器检测，整合，并且将结果报告为低分子量、主峰和高分子量峰的相对峰面积百分比。
使用阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)测量BiTE分子的电荷变体。在适当的pH下，使用增加离子强度的流动相梯度洗脱蛋白质的电荷变体。具有较少正表面电荷的蛋白质比具有较多正表面电荷的蛋白质洗脱得更早。将洗脱的电荷变体通过UV检测来检测，整合，并且将主峰、酸性峰和碱性峰的结果报告为总峰面积的百分比。
如表4所示，保持解冻的BiTE对稳定性属性没有负面影响，而在保持期之后HMW的水平降低。
表4
HMW-高分子量物质，RP-相对效力，MP-主峰，LMW-低分子量物质
实例5：在冷冻条件下储存后BiTE分子的HMW水平降低与保持时间和保持温度的关系
将包含各1mg/mL HLE BiTE(CD33xCD3和DLL3xCD3)和2mg/mL的BiTE(EGFRvIIIxCD3)的组合物装入5mL小药瓶中，并且在-20℃下储存一个月。一个月后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)分析以确定组合物中HMW聚集体(例如，双特异性抗体二聚体)的水平。
将解冻的组合物在各种温度下保持长达96小时的最长保持时间，并且通过SE-UHPLC在不同时间点分析HMW聚集体水平。在各种温度下，HMW聚集体水平降低至CD33xCD3和DLL3xCD3 HLE BiTE和EGFRvIIIxCD3 BiTE的初始冷冻前水平所需的保持时间是相同的，并且如图4所示。
实例6：苄醇(BA)的稳定作用。
将包含各1mg/mL HLE BiTE(CD19xCD3、CD33xCD3、BCMAxCD3、DLL3xCD3和EGFRvIIIxCD3)的组合物装入5mL中，并且在-20℃下，在BA存在和不存在下储存四周。四周后，将组合物在室温下解冻，并且立即通过SE-UHPLC分析以确定HMW聚集体的水平。储存期间BA的存在稳定了BiTE(图5)。
本申请中引用的所有参考文献通过引用并入本文
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