具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

按照以下步骤制备医药级增强免疫的绣球菌多糖：

1.离子液体/复合酶体系对原料预处理：

取1kg干燥的绣球菌子实体，通过超微粉碎机将其粉碎至800目；加入10L的1％wt1-丁基-1-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体溶液中并加热到85℃搅拌均匀得到混合液，冷却至45℃，调配pH＝6，再加入质量百分比浓度为0.2％复合酶，所述复合酶按重量份计为特异性内切纤维素酶：溶菌酶＝2:1，将混合液在45℃温度下搅拌1.5h进行酶解，再加入质量百分比浓度为0.3％复合酶，所述复合酶按重量份计为脂肪酶：菠萝蛋白酶＝3:1，将混合液在40℃温度下搅拌1.5h进行酶解，将酶解液离心处理使固液分离，弃去滤液，得到残渣，将固体残渣重复酶解、浸提3次，并将所得残渣合并得到绣球菌粗多糖。

上述步骤中，通过超微粉碎机破碎而产生细胞壁结构上的破坏，促使其多糖内容物析出，再通过复合酶中的特异性内切纤维素酶和溶菌酶在离子液体溶液中进一步对细胞壁结构进行水解，以及通过脂肪酶和菠萝蛋白酶水解绣球菌含有的脂肪和蛋白质，从而提高绣球菌多糖的产率和纯度。

2.离子液体/组合酶体系酶解制备低粘度绣球菌多糖液体：

在步骤1得到的残渣绣球菌粗多糖中，加入15倍体积的0.8％wt三丁基甲基铵双三氟甲基磺酰亚胺盐离子液体溶液中加热到85℃搅拌均匀得到混合液，冷却至50℃，调配pH＝5，再加入质量百分比浓度为0.07％组合酶，所述组合酶按重量份计为右旋糖酐酶:β-葡聚糖苷酶＝1:1，并搅拌均匀得到混合液，将混合液在50℃温度下搅拌进行酶解3h，将酶解液在离心机(转速4000r/min)中离心处理15min，使固液分离，弃去残渣，得到滤液，得低粘度绣球菌多糖液体。

3.浓缩醇沉：

将步骤2中得到的低粘度绣球菌多糖液体浓缩，在90℃温度下灭活10min，然后冷却至室温；加入3倍体积的95％乙醇溶液，静置，过滤得到沉淀。

4.冷冻喷雾干燥：

将步骤3中所得的沉淀在冷冻喷雾干燥机中进行干燥，粉碎至60目，得最终绣球菌多糖粉末产品1。

实施例2

按照以下步骤制备医药级增强免疫的绣球菌多糖：

1.离子液体/复合酶体系对原料预处理：

取1kg干燥的绣球菌子实体，通过超微粉碎机将其粉碎至1000目；加入15L的1％wt四丁基膦四氯铁酸盐离子液体溶液中并加热到85℃搅拌均匀得到混合液，冷却至45℃，调配pH＝6，再加入质量百分比浓度为0.3％复合酶，所述复合酶按重量份计为特异性内切纤维素酶：溶菌酶＝3:1，将混合液在45℃温度下搅拌1.5h进行酶解，再加入质量百分比浓度为0.3％复合酶，所述复合酶按重量份计为脂肪酶：菠萝蛋白酶＝4:1，将混合液在40℃温度下搅拌1.5h进行酶解，将酶解液离心处理使固液分离，弃去滤液，得到残渣，将固体残渣重复酶解、浸提3次，并将所得残渣合并得到绣球菌粗多糖。

上述步骤中，通过超微粉碎机破碎而产生细胞壁结构上的破坏，促使其多糖内容物析出，再通过复合酶中的特异性内切纤维素酶和溶菌酶在离子液体溶液中进一步对细胞壁结构进行水解，以及通过脂肪酶和菠萝蛋白酶水解绣球菌含有的脂肪和蛋白质，从而提高绣球菌多糖的产率和纯度。

2.离子液体/组合酶体系酶解制备低粘度绣球菌多糖液体：

在步骤1得到的残渣绣球菌粗多糖中，加入15倍体积的0.6％wt1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯盐离子液体溶液中加热到85℃搅拌均匀得到混合液，冷却至50℃，调配pH＝5，再加入质量百分比浓度为0.07％组合酶，所述组合酶按重量份计为右旋糖酐酶:β-葡聚糖苷酶＝1:2，并搅拌均匀得到混合液，将混合液在50℃温度下搅拌进行酶解3h，将酶解液在离心机(转速4000r/min)中离心处理15min，使固液分离，弃去残渣，得到滤液，得低粘度绣球菌多糖液体。

3.浓缩醇沉：

将步骤2中得到的低粘度绣球菌多糖液体浓缩，在90℃温度下灭活10min，然后冷却至室温；加入3倍体积的95％乙醇溶液，静置，过滤得到沉淀。

4.冷冻喷雾干燥：

将步骤3中所得的沉淀在冷冻喷雾干燥机中进行干燥，粉碎至60目，得最终绣球菌多糖粉末产品2。

实施例3

按照以下步骤制备医药级增强免疫的绣球菌多糖：

1.离子液体/复合酶体系对原料预处理：

取1kg干燥的绣球菌子实体，通过超微粉碎机将其粉碎至1200目；加入10L的1.5％wt1-丁基-1-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体溶液中并加热到85℃搅拌均匀得到混合液，冷却至45℃，调配pH＝6，再加入质量百分比浓度为0.2％复合酶，所述复合酶按重量份计为特异性内切纤维素酶：溶菌酶＝4:1，将混合液在45℃温度下搅拌1.5h进行酶解，再加入质量百分比浓度为0.3％复合酶，所述复合酶按重量份计为脂肪酶：菠萝蛋白酶＝4:1，将混合液在40℃温度下搅拌1.5h进行酶解，将酶解液离心处理使固液分离，弃去滤液，得到残渣，将固体残渣重复酶解、浸提3次，并将所得残渣合并得到绣球菌粗多糖。

上述步骤中，通过超微粉碎机破碎而产生细胞壁结构上的破坏，促使其多糖内容物析出，再通过复合酶中的特异性内切纤维素酶和溶菌酶在离子液体溶液中进一步对细胞壁结构进行水解，以及通过脂肪酶和菠萝蛋白酶水解绣球菌含有的脂肪和蛋白质，从而提高绣球菌多糖的产率和纯度。

2.离子液体/组合酶体系酶解制备低粘度绣球菌多糖液体：

在步骤1得到的残渣绣球菌粗多糖中，加入15倍体积的0.7％wt三丁基甲基铵双三氟甲基磺酰亚胺盐离子液体溶液中加热到85℃搅拌均匀得到混合液，冷却至50℃，调配pH＝5，再加入质量百分比浓度为0.07％组合酶，所述组合酶按重量份计为β-右旋糖酐酶:β-葡聚糖苷酶＝1:3，并搅拌均匀得到混合液，将混合液在50℃温度下搅拌进行酶解3h，将酶解液在离心机(转速4000r/min)中离心处理15min，使固液分离，弃去残渣，得到滤液，得低粘度绣球菌多糖液体。

3.浓缩醇沉：

将步骤2中得到的低粘度绣球菌多糖液体浓缩，在90℃温度下灭活10min，然后冷却至室温；加入3倍体积的95％乙醇溶液，静置，过滤得到沉淀。

4.冷冻喷雾干燥：

将步骤3中所得的沉淀在冷冻喷雾干燥机中进行干燥，粉碎至60目，得最终绣球菌多糖粉末产品3。

对比实施例1

与实施例1不同的是绣球菌子实体粉碎至200目，其它过程均不变。

对比实施例2

与实施例1不同的是步骤1中用10L的蒸馏水取代10L的1％wt1-丁基-1-甲基吡咯烷双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体溶液，其它过程均不变。

对比实施例3

与实施例1不同的是步骤1中加入的酶为单一的特异性内切纤维素酶，其它过程均不变。

对比实施例4

与实施例1不同的是步骤1中加入的酶为单一的溶菌酶，其它过程均不变。

对比实施例5

与实施例1不同的是步骤2中用15倍体积的蒸馏水取代15倍体积的0.8％wt三丁基甲基铵双三氟甲基磺酰亚胺盐离子液体溶液，其它过程均不变，

对比实施例6

与实施例2不同的是步骤3中加入的酶为单一的右旋糖酐酶，其它过程均不变，得最终绣球菌多糖粉末产品4。

对比实施例7

与实施例2不同的是步骤3中加入的酶为单一的β-葡聚糖苷酶，其它过程均不变，得最终绣球菌多糖粉末产品5。

将上述实施例1、2、3和对比实施例1、2、3、4步骤1所得到的绣球菌粗多糖分别进行称重，计算各自产率，得到数据如下表1所示：

表1

由表1的数据可以看出，实施例1和对比实施例1对比可以看出，绣球菌子实体粉碎的目数越细，其制得绣球菌多糖产品的产率越高，说明超微机械粉碎破坏绣球菌子实体的细胞壁越厉害，使其多糖溶出地更多；实施例1和对比实施例2对比可以看出，离子液体/复合酶体系比纯水/复合酶体系制得绣球菌多糖产品的产率要高很多；实施例1和对比实施例3、对比实施例4对比可以看出，复合酶比单一酶破坏绣球菌子实体的细胞壁效果明显。

将上述实施例1、2、3和对比实施例5、6、7所得到的最终绣球菌多糖粉末产品分别配制成质量百分比浓度为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％的水溶液，通过旋转粘度计测得粘度，得到数据如下表2所示：

表2

由表2的数据可以看出，在水溶液质量百分比浓度相同时，实施例1和对比实施例5对比可以看出，离子液体/组合酶体系比纯水/组合酶体系制得的绣球菌多糖产品粘度降低了许多，可见液体/组合酶体系更有利于绣球菌多糖的酶解反应；实施例1、实施例2和实施例3制得的绣球菌多糖产品比对比实施例6和对比实施例7制得的绣球菌多糖产品粘度降低了许多，说明采用右旋糖酐酶和β-葡聚糖苷酶的组合酶水解效果比单一酶好，产品粘度低，说明分子量较低，更易于人体吸收。

将上述实施例1、2、3和对比实施例6、7所得到的最终绣球菌多糖粉末产品1、2、3和4、5分别配制成质量百分比浓度为0.2％的水溶液，观察水溶液的状态。

经检测由实施例1、实施例2和实施例3制得的绣球菌多糖产品1、2、3的水溶液透明度很高，清澈透明，而由对比实施例6制得的绣球菌多糖产品4的水溶液中有少量悬浮的絮状物，由对比实施例7制得的绣球菌多糖产品5的水溶液透明度不是很好，不是清澈透明的，进一步说明了采用右旋糖酐酶和β-葡聚糖苷酶的组合酶水解制得的绣球菌多糖产品水溶性好，外观清澈透明，更易于受到市场的青睐。

实施例8

一种增强免疫的绣球菌多糖的应用配方，按照重量份数计由下述原料配方按照重量比组成：

绣球菌粉35份、乳清蛋白粉10份、酪蛋白10份、大豆分离蛋白3份、植物脂肪粉30份、低聚果糖3份、菊粉3.3份、针叶樱桃粉1份、接骨木莓粉1.5份、维生素0.2份、矿物质3份。

上述原料绣球菌粉是实施例2制得的绣球菌多糖粉末产品2，其他原料均为常规市售。其中乳清蛋白粉和酪蛋白提供身体所需的优质动物蛋白质，大豆分离蛋白提供优质植物蛋白质，优质动物和植物双蛋白结合提供全面氨基酸组分，是增强免疫力的成分，植物脂肪粉提供优质脂肪来源，低聚果糖和菊粉为膳食纤维来源，绣球菌多糖和针叶樱桃粉、接骨木莓粉为增强免疫力的功能原料，该配方营养全面均衡，各组分协同增效，以达到提高机体免疫力的效果。

制备方法为：先将维生素、矿物质预混均匀，再加入针叶樱桃粉、接骨木莓粉混配均匀，接着加入大豆分离蛋白、低聚果糖、菊粉混配均匀，再加入乳清蛋白粉、酪蛋白混配均匀，最后加入绣球菌粉和植物脂肪粉混配均匀，即得增强免疫的绣球菌多糖的应用配方产品M。

<增强免疫力功效评价试验>

实验选取6周龄雌性小鼠，按体重分为4组。本发明中的绣球菌多糖应用配方产品M的人体推荐剂量为0.5g/kg/d，小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。分别以人体推荐剂量5倍、10倍和30倍作为低、中、高剂量组。采取灌胃法，每日灌胃一次，对照组灌蒸馏水。各组小鼠连续给予产品M 30天后，小鼠自由进食与饮水，保证饲养环境适宜的温度(25±1.0℃)、湿度和安静，测定各项指标。

给药第30天，称体重。处死小鼠，取脾脏和胸腺，称重，并计算脏器系数，脾(胸腺)比值＝脾(胸腺)重量/体重量；同时测量足趾肿胀度，其结果如表3所示。

表3产品M对小鼠胸腺、脾脏质量和足趾肿胀度的影响

由表3可见，经口给予本发明的产品M 30天后，小鼠不同剂量的受试物30天后，与空白对照组相比，各剂量组胸腺、脾脏/体重比值均无显著差异(p>0.05)，说明本发明的产品M服用不会对脾脏和胸腺产生不良刺激，脾脏和胸腺可正常发挥其生理功能。同时，服用本发明的产品M后，低、中、高剂量组的足趾肿胀差值与空白对照组相比有明显差异(p<0.05)，说明产品M能够显著提高机体的细胞免疫能力。

进一步的，给药第30天，每只鼠腹腔内注射1ml20％(V/V)鸡红细胞悬液，取腹腔液滴片后37℃温育30min，固定，染色后显微镜计数巨噬细胞，计算吞噬指数和吞噬率。吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的吞噬细胞数；吞噬率＝吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数/计数的吞噬细胞数×100％，其结果如表4所示。

表4产品M对小鼠吞噬功能的影响

通过小鼠腹腔注射鸡红细胞的吞噬细胞总数，可判断巨噬细胞的吞噬功能。由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的产品M 30天后，低、中、高剂量组吞噬指数和吞噬率均显著高于空白对照组(p<0.05)。

进一步的，给药第30天，检测小鼠NK细胞活性，其结果如表5所示。

表5产品M对小鼠NK细胞活性的影响

由表5可见，服用本发明的产品M后，低、中、高剂量组的NK细胞活性与空白对照组相比有显著性差异(p<0.05)，说明产品M对NK细胞活性有促进作用。

综上所述，本发明提供的一种增强免疫的绣球菌多糖的应用配方，能显著增强机体的免疫力；原料之间的配比合理，在该配比下能够发挥最大的协同作用；同时由于该组合物配方简单，因此该组合物无毒副作用，患者不容易产生依赖性。组合物的制备方法简单，各项参数可控，可大规模生产。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。