一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法
阅读说明：本技术 一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法 (Method for producing isomaltooligosaccharide by multi-enzyme coupling ) 是由 吴敬 王蕾 陈晟 易子玲 魏贝贝 于 2021-02-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法,属于生物技术领域。本发明所将淀粉加入水或缓冲液中进行糊化和液化,得到液化淀粉溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至液化液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液去除未反应的底物及产物中的直链寡糖部分得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖。本发明主要解决了原料使用成本高,操作工艺流程复杂,产品纯度低等问题,优势体现在包含非功能性成分含量低,无其他副产物。(The invention discloses a method for producing isomaltooligosaccharide by multi-enzyme coupling, belonging to the technical field of biology. Adding starch into water or buffer solution for gelatinization and liquefaction to obtain liquefied starch solution; adding synthetase and starch debranching enzyme into the liquefied solution to perform synthetic reaction to obtain intermediate reaction solution; sequentially adding alpha-amylase and alpha-glucosidase and/or glucoamylase to the intermediate reaction solution to remove unreacted substrates and straight-chain oligosaccharide parts in the products to obtain a treated reaction solution; and adding dextran hydrolase into the treated reaction solution for hydrolysis reaction to obtain isomaltooligosaccharide. The invention mainly solves the problems of high use cost of raw materials, complex operation process flow, low product purity and the like, and has the advantages of low content of non-functional components and no other by-products.)
技术领域
本发明涉及一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法，属于生物技术领域。
背景技术
低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharide，IMO)又称为异麦芽低聚糖、异麦芽寡糖、分支低聚糖等，它属于淀粉糖的一种，主要成分为含有一个或多个α-1,6糖苷键的寡聚葡萄糖。IMO不易被人体消化酶利用，具有低血糖指数特征，可用于糖尿病患者的健康糖替代品。此外，IMO还可被肠道益生菌特别是双歧杆菌分解利用，产生短链脂肪酸，抑制肠道有害菌，因此作为一种重要的功能性低聚糖，IMO广泛应用于食品等行业。由于低聚异麦芽糖属于非消化性的一种低聚糖，并且，低聚异麦芽糖具有低血糖、预防龋齿、促进益生菌生长、提高人体免疫力等多种生理功能，因此，它被人体食用后，可以在促进肠道内双歧杆菌生长的同时，起到很好的益生作用。
低聚异麦芽糖的聚合度通常在2～10之间，主要功能成分是异麦芽糖、潘糖、异潘糖和异麦芽三糖。它是由日本研究者首先发现、开发商品化的生产技术并应用于食品开发当中，其广泛存在于马铃薯、大麦、小麦等农作物中，也存在于一些如清酒、酱油、蜂蜜此类发酵产品中，于1985年推入市场销售，我国在1994年也开始投入对低聚异麦芽糖的研发工作当中，并将其投入工业化生产进入我国市场，同时美国、欧洲等地的许多国家也都在大力开发低聚异麦芽糖的应用潜能。
目前，有关于低聚异麦芽糖的生产方法围绕生物酶转化主要有三大类，其中，第一类是以淀粉质原料进行加工生产，主要涉及步骤有原料的液化、糖化以及利用如α-葡萄糖苷酶类进行转苷反应制备低聚异麦芽糖，但是，利用此方法生产低聚异麦芽糖的得率低，后续产品分离成本高(具体可见参考专利CN1721545A低聚异麦芽糖糖化转苷生产工艺、CN104131051A一种低聚异麦芽糖的制备方法等)；第二类是以高浓度的葡萄糖溶液作为原料，通过聚合从而逆合制备低聚异麦芽糖，但是，此方法使用的原料成本较高，并且，由于现有的聚合酶效率较低，使用此方法生产低聚异麦芽糖的得率也较低(具体可见参考专利CN108546724A高纯度低聚异麦芽糖及其制备方法等)；第三类就是以蔗糖作为原料，使用葡聚糖蔗糖酶首先合成右旋糖酐类葡聚糖随后通过水解制备低聚异麦芽糖，但是，利用此方法生产低聚异麦芽糖需要蔗糖原料，相对于淀粉质原料来说成本较高，此外，该方法只能利用蔗糖中的葡萄糖部分，因此低聚异麦芽糖对蔗糖的理论得率不超过50％(具体可见参考专利WO2016029198A1PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ISOMALTOOLIGOSACCHARIDES等)。
上述缺陷均大大限制了低聚异麦芽糖市场的进一步发展。因此，急需找到一种得率高且成本低的生产低聚异麦芽糖。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种得率高且成本低的生产低聚异麦芽糖。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供一种生产低聚异麦芽糖的方法，所述方法为将淀粉加入水或缓冲液中进行糊化和液化，得到液化淀粉溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至液化液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液去除未反应的底物及产物中的直链寡糖后得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖；所述淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉和/或红薯淀粉；
或者，所述方法为将麦芽糊精加入水或缓冲液中的到糊精溶液；将合成酶和淀粉脱支酶添加至糊精溶液中进行合成反应得到中间反应液；将α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶和/或糖化酶依次添加至中间反应液去除未反应的底物及产物中的直链寡糖后得到处理后反应液；再将右旋糖酐水解酶添加至处理后反应液进行水解反应得到低聚异麦芽糖。
所述合成酶是4,6-α-葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.-)、右旋糖酐糊精酶(EC2.4.1.2)中的一种或两种。所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述淀粉脱支酶能够催化水解淀粉链分支点处1,6-β-D-糖苷键的酶，可选用：普鲁兰酶、异淀粉酶。
所述合成反应的温度为25～55℃、pH为4～7.5、时间为12～24h。
在本发明的一种实施方式中，当合成酶为4,6-α-葡萄糖基转移酶时，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶在液化淀粉溶液中的添加量为100～5000U/g淀粉。
在本发明的一种实施方式中，当合成酶为右旋糖酐糊精酶时，所述右旋糖酐糊精酶在液化淀粉溶液中的添加量为5～100U/g麦芽糊精或淀粉。
在本发明的一种实施方式中，当淀粉脱支酶是普鲁兰酶时，普鲁兰酶在液化淀粉溶液中的添加量为10～100U/g麦芽糊精或淀粉。
所述α-淀粉酶是指1,4-D-葡聚糖水解酶，可选用高温淀粉酶。所述糖化酶是指α-1,4-葡萄糖水解酶。
所述去除未反应的底物及产物中的直链寡糖的反应过程中，以经第一步合成反应后的淀粉或麦芽糊精为底物时，使用高温淀粉酶和糖化酶进行处理；高温淀粉酶的反应温度和时间分别为90-100℃、30-60min，糖化酶的反应温度和时间分别为50-70℃反应30-60min。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶在中间反应液中的添加量为不少于1000U/g麦芽糊精或淀粉。
在本发明的一种实施方式中，将α-葡萄糖苷酶添加至中间反应液进行中间处理反应时，所述α-葡萄糖苷酶在中间反应液中的添加量为1～20U/g麦芽糊精或淀粉。
在本发明的一种实施方式中，将糖化酶添加至中间反应液进行反应时，所述α-葡萄糖苷酶在中间反应液中的添加量为不少于660U/g麦芽糊精或淀粉。
所述右旋糖酐水解酶包含右旋糖酐酶(EC 3.2.1.11)和/或异麦芽三糖右旋糖酐酶(EC3.2.1.95)。所述异麦芽三糖右旋糖酐酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述水解反应的温度为30～70℃、pH为3.5～7、时间为2～8h。
在本发明的一种实施方式中，当右旋糖酐水解酶为右旋糖酐酶时，所述右旋糖酐酶在处理后反应液中的添加量为5～500U/g麦芽糊精或淀粉。
在本发明的一种实施方式中，当右旋糖酐水解酶为异麦芽三糖右旋糖酐酶时，所述异麦芽三糖右旋糖酐酶在处理后反应液中的添加量为10～200U/g麦芽糊精或淀粉。
本发明还提供了利用上述方法制备得到的低聚异麦芽糖。
本发明上述制备低聚异麦芽糖的方法还可以进一步用于制备含有低聚异麦芽糖的产品，例如用于糖尿病患者的健康糖替代品，例如用于控制血糖、预防龋齿、促进益生菌生长、提高人体免疫力的产品。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种得率高且成本低的生产低聚异麦芽糖的方法，此方法为以廉价的淀粉或麦芽糊精为原料，将淀粉先经4,6-α-葡萄糖基转移酶和/或右旋糖酐糊精酶处理，再经右旋糖酐酶和/或异麦芽三糖右旋糖酐酶处理以生产低聚异麦芽糖，其中，α-4,6-葡聚糖基转移酶可以淀粉或淀粉降解物为底物合成具有连续或间断连续α-1,6-键的右旋糖酐类葡聚糖，右旋糖酐糊精酶可以淀粉或淀粉降解物为底物合成具有连续α-1,6-键的右旋糖酐，右旋糖酐酶可以水解具有连续α-1,6-键的葡聚糖并生成以异麦芽糖为主的具有不同聚合度低聚异麦芽糖混合物，异麦芽三糖右旋糖酐酶可以识别具有连续α-1,6-键葡聚糖的非还原端并水解生成异麦芽三糖；利用此方法生产低聚异麦芽糖的得率可高达73％。
(2)本发明提供了一种生产低聚异麦芽糖的方法，利用此方法制备得到的低聚异麦芽糖平均聚合度在2～3、IMO含量60～81％，因此，利用此方法制备低聚异麦芽糖分离纯化步骤简单。
(3)IMO中异麦芽三糖或潘糖等三糖含量是体现低聚异麦芽糖功能性的主要成分，其含量高低反映了产品质量的好坏，也影响产品的价格和应用前景。本发明提供了一种生产低聚异麦芽糖的方法，通过改变右旋糖酐酶和异麦芽三糖右旋糖酐酶的配比可调节IMO中三糖和二糖的比率，异麦芽三糖的比率最高可达90％，因此，利用此方法制备低聚异麦芽糖质量佳，应用前景大。
附图说明
图1合成步骤右旋糖酐产物钙柱HPLC检测图谱。其中，7.385min处及5.377min处出峰为三糖及以上有效右旋糖酐，8.550min处为异麦芽糖，10.588min处为葡萄糖，其他小峰及几乎无出峰处为体系中的杂质。
图2降解步骤氨基柱HPLC检测图谱，其中3.511min处为溶剂峰(乙腈)，9.854min处为异麦芽三糖出峰，其他小峰为杂质或极微量的寡糖。
图3合成步骤加入4,6-α-葡聚糖转移酶及普鲁兰酶时，使用1H NMR核磁氢谱对产生的右旋糖酐进行键型检测，5.4ppm左右为α-1,4，4.99ppm附近为α-1,6，二者比例为1：8.31。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli JM109及BL21(DE3)感受态细胞为实验室自制得到；下述实施例中涉及的；下述实施例中涉及的pET-20b(+)质粒、pET-15b(+)质粒合成自上海捷瑞公司；下述实施例中涉及的磷酸柠檬酸缓冲液按照表格配置；下述实施例中涉及的麦芽糊精购自菏泽天邦公司；下述实施例中涉及的木薯淀粉购自菏泽天邦公司；下述实施例中涉及的普鲁兰酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；下述实施例中涉及的高温α-淀粉酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；下述实施例中涉及的α-葡萄糖苷酶购自山东隆科特酶制剂有限公司；下述实施例中涉及的糖化酶购自山东隆科特酶制剂有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。
TB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉24g/L、甘油5g/L、K2HPO4·3H2O 16.43g/L、KH2PO4 2.31g/L。
MD固体培养基：葡萄糖20g/L，琼脂糖20g/L，YNB 13.4g/L。
YPD培养基：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L。
BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，YNB 13.4g/L，硫酸铵10g/L，K2HPO4·3H2O3g/L，KH2PO4 11.8g/L。
BMGY培养基：BMMY基础上添加甘油10g/L。
下述实施例中涉及的制备方法如下：
α-4,6-葡聚糖基转移酶的制备方法如下：
合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的α-4,6-葡聚糖基转移酶的基因。
使用限制性内切酶NdeⅠ和Hind III对合成得到的基因与pET-15b(+)质粒进行酶切后，使用T4连接酶将得到的两个酶切产物连接，得到重组质粒pET-15b(+)-gtfb；将重组质粒pET-15b(+)-gtfb转化入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞中，得到重组大肠杆菌JM109/pET-15b(+)-gtfb；将重组大肠杆菌JM109/pET-15b(+)-gtfb划线于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液进行质粒提取；随后按相同操作转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-15b(+)-gtfb涂布于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落，即稳定适合发酵的转化子；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液，将种子液以5％(v/v)的接种量转接至TB液体培养基(含有0.4μmol/L氨苄青霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养2h后，于25℃恒温培养箱中继续诱导发酵12h，得到发酵液；将发酵液于4℃的条件下离心20min，所得上清液即为粗酶液。
异麦芽三糖右旋糖酐酶的制备方法如下：
合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的异麦芽三糖右旋糖酐酶的基因；使用限制性内切酶NcoⅠ和Hind III对合成得到的基因与pET-20b(+)质粒进行酶切后，使用T4连接酶将得到的两个酶切产物连接，得到重组质粒pET-20b(+)-imtd；将重组质粒pET-20b(+)-imtd转化入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞中，得到重组大肠杆菌JM109/pET-20b(+)-imtd；将重组大肠杆菌JM109/pET-20b(+)-imtd涂布于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液进行质粒提取；随后按相同操作转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-20b(+)-imtd涂布于LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，得到单菌落，即稳定适合发酵的转化子；将单菌落接种至于LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养8～10h，将得到种子液，将种子液以5％(v/v)的接种量转接至TB液体培养基(含有0.4μmol/L氨苄青霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养2h后，于25℃恒温培养箱中继续诱导发酵48h，得到发酵液；将发酵液于4℃的条件下离心20min，所得上清液即为粗酶液。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
反应液中右旋糖酐含量和得率的检测方法：
采用高效液相色谱(HPLC)法检测反应液中右旋糖酐的含量；使用安捷伦1260HPLC色谱仪，示差折光检测器，Waters Ca色谱柱，检测柱温为80℃，流动相是纯净水，以0.5mL/min的流速、进样量为10μL的样品进样检测；
其中，反应液中右旋糖酐得率的计算公式为：得率＝测得三糖及以上聚合度产物峰面积之和/产物总峰面积×100％。
反应液中异麦芽糖、葡萄糖、异麦芽三糖含量、得率及键型的检测方法：
采用高效液相色谱(HPLC)法检测反应液中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量；使用安捷伦1260HPLC色谱仪，示差折光检测器，Agilent ZORBAX NH2(4.6×250mm)色谱柱，检测柱温35℃，流动相是70％～78％乙腈，以0.8mL/min的流速、进样量为10μL的样品进样检测；
其中，反应液中异麦芽糖、葡萄糖、异麦芽三糖得率的计算公式为：得率＝各产物峰面积/标样峰面积×标样浓度/底物浓度×100％。
利用AVANCE III 400MHz数字NMR核磁共振光谱仪(Bruker BiospinInternational AG)测定抗性糊精的键型比例。准确称取30～40mg样品溶于500μL D2O(D,99.9％)中，漩涡震荡至彻底溶解后用移液器打入核磁管中进行测定，温度为60℃。将三甲基甲硅烷基丙酸(TMSP0.03％)溶解在样品中作为内标。
α-4,6-葡聚糖基转移酶酶活的检测方法：碘液显色法检测：底物配制：1g/L直链淀粉母液：40mg的直链淀粉加入2mL的蒸馏水充分润湿，加入2mL的2M的NaOH溶液，漩涡振荡充分溶解；用时取500uL的直链淀粉母液加250uL的2M的HCl溶液，然后加入3250μL的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 7.0)配成0.125％的底物。
鲁戈碘液：0.26g碘与2.60g碘化钾溶于10mL的容量瓶中(提前3天配制，确保碘完全溶解)；用时取100μL的鲁戈碘液，加入50μL的2M的HCl溶液然后补水到26mL配成碘显色液。
反应时，取200uL的底物于1.5mL离心管中，35℃温浴10min。加入200μL的GtfB酶液35℃反应10min，反应结束后取200μL反应液加入到3800μL的碘显色液中显示5min，分光光度计测定660nm下的吸光度。对照用缓冲液代替酶液，空白取200μL的缓冲液加入到3800μL的碘显色液中显示5min。
α-4,6-葡聚糖基转移酶酶活的定义：在37℃条件下单位时间吸光值下降一个百分点定义为一个酶活单位。
酶活(U/mL)＝[100×D(稀释倍数)×(A对照-A实验)]/[10min×0.1mL×(A对照-A空白)]。
异麦芽三糖右旋糖酐酶酶活的检测方法：使用DNS法检测酶活，先配制1％的葡聚糖2万底物，取1ml于具塞试管中，随后加入0.9ml缓冲液置于40℃恒温水浴锅中温浴10min，随后加入0.1ml酶液，反应10min后加入3mlDNS终止反应。将具塞试管放入沸水持续煮沸7min后立即放入冰水混合物中冷却，随后向试管中补充10ml水至体系为15ml，混匀后在540nm下检测吸光值，依据吸光值计算得到酶活。
异麦芽三糖右旋糖酐酶酶活的定义：在40℃条件下，1min内酶水解葡聚糖底物生成的还原糖量为一个酶活力单位(1U)。
DE值(还原值)的检测方法(DNS比色法)：
具体可见参考文献：彦繁鹤,周金梅,吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发.36(02):126-128。
DE值(还原值)的定义：体系中还原糖的量占固形物总量的比值。
实施例1：低聚异麦芽糖的制备
具体步骤如下：
将麦芽糊精加入磷酸缓冲液中，加热溶解，得到浓度为15％的糊精溶液；将4,6-α-葡聚糖转移酶(SEQ ID NO:1)、普鲁兰酶和氯霉素分别按照400U/g麦芽糊精、30U/g麦芽糊精和0.04g/L的添加量添加至糊精溶液中，于37℃、150rpm水浴摇床中反应24h，得到中间反应液；将高温α-淀粉酶按照6000U/g麦芽糊精或淀粉的添加量添加至中间反应液，于95℃下反应30min，随后将pH调节至4.2后，将糖化酶按照750U/g麦芽糊精或淀粉的添加量添加至反应液中，于60℃下反应30min，得到处理后反应液；将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液和氯霉素(防止反应时感染杂菌)分别按照150U/g右旋糖酐和0.04g/L的添加量添加至处理后反应液中，于37℃水浴摇床中反应4h，得到水解反应液。
检测中间反应液中右旋糖酐的含量和得率，经中间处理煮沸离心后，稀释4倍，用滤膜过滤后通过高效液相色谱法检测其中的右旋糖酐；将水解反应液煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测水解反应液中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。
由检测结果可知，中间反应液中右旋糖酐的占比为79％，检测图谱如图1；α-1,6键型占比为88.9％左右，核磁图谱如图3，水解反应液中低聚异麦芽糖得率为79％，并且，水解反应液中产物中有90％以上为异麦芽三糖。
实施例2：低聚异麦芽糖的制备
具体步骤如下：
将木薯淀粉加入适量磷酸缓冲液(50mM pH6.0)中配制为15％的悬浊液待糊化液化，搅拌至其成为悬浊液，加入10U/g淀粉的CGTase，置于85℃水浴锅中，当其全部粘稠时开始计时7min进行液化过程，随后煮沸灭酶10min。将4,6-α-葡聚糖转移酶(SEQ ID NO:1)、普鲁兰酶和氯霉素分别按照400U/g淀粉、20U/g淀粉和0.04g/L的添加量添加至淀粉液化液中，于37℃、150rpm水浴摇床中反应24h，得到中间反应液；将高温α-淀粉酶按照6000U/g淀粉添加量添加到中间反应液中，于95℃下反应30min，随后将pH调节至4.2后，将糖化酶按照750U/g淀粉的添加量添加至反应液中，于60℃下反应30min，得到处理后反应液；将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液和氯霉素分别按照150U/g右旋糖酐和0.04g/L的添加量添加至处理后反应液中，于37℃水浴摇床中反应4h，得到水解反应液。
检测中间反应液中右旋糖酐的含量和得率，经中间处理煮沸离心后，稀释4倍，用滤膜过滤后通过高效液相色谱法(钙柱，下同)检测其中的右旋糖酐；将水解反应液煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法(钙柱，下同)检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。
由检测结果可知，中间反应液中右旋糖酐的得率为72.4％，水解反应液中低聚异麦芽糖得率为77.3％，并且，其中异麦芽三糖占比为90％以上。
图3中5.4nnm左右为α-1,4，5.0nnm左右为α-1,6。
实施例3：低聚异麦芽糖的制备
具体步骤如下：将麦芽糊精加入磷酸缓冲液中，加热溶解，得到浓度为15％的糊精溶液；将4,6-α-葡聚糖转移酶(SEQ ID NO:1)，普鲁兰酶和氯霉素分别按照400U/g麦芽糊精、30U/g麦芽糊精和0.04g/L的添加量添加至麦芽糊精溶液中，于37℃、150rpm水浴摇床中反应24h，得到中间反应液；将高温α-淀粉酶按照6000U/g麦芽糊精添加量添加到中间反应液中，于95℃下反应30min，随后将pH调节至4.2后，将糖化酶按照750U/g麦芽糊精的添加量添加至反应液中，于60℃下反应30min，得到处理后反应液；将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQID NO:2)的粗酶液以及氯霉素分别按照150U/g右旋糖酐和0.04g/L的添加量添加至处理后反应液中，于37℃水浴摇床中反应4h，得到水解反应液。
检测中间反应液中右旋糖酐的含量和得率，经中间处理煮沸离心后稀释，用滤膜过滤后通过高效液相色谱法检测其中的右旋糖酐；将水解反应液煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。
由检测结果可知，中间反应液中右旋糖酐的得率为75.33％，水解反应液中异麦芽三糖产率为78％。
对比例1
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液替换为商品右旋糖酐酶(购自夏盛公司)，且将商品右旋糖酐酶的添加量替换为5000U/g右旋糖酐，得到反应液4。
将反应液4煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。
由检测结果可知，水解反应液中异麦芽糖的得率为50％，几乎未检测到异麦芽三糖。
对比例2
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将异麦芽三糖右旋糖酐酶(SEQ ID NO:2)的粗酶液替换为商品右旋糖酐酶(购自夏盛公司)，且将商品右旋糖酐酶的添加量替换为500U/g右旋糖酐，50℃下反应2h得到水解反应液。
将反应液4煮沸后离心取上清，取上清和纯乙腈1:1(v/v)混合后沉淀2h，沉淀结束后再次离心取上清液，将再次离心得到的上清用滤膜过滤后置于检测瓶中通过高效液相色谱法检测反应液4中异麦芽糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量和得率。
由检测结果可知，反应液4中异麦芽糖的得率为21.5％、异麦芽三糖的得率为28.1％、葡萄糖的得率为1.6％，低聚异麦芽糖得率较低。
序列：
SEQ ID NO:1
QANDGHWYLFTADGTAASRVAKWAGTYYYFDPQTHLRVDDNYVQSQWGDWYMFGKDGRIATGLYKWDKNNQWYYFDPVTYLKVTNKWVDGNYYDEDGAQAISKLVTINNRLYYFDDQGKEISNQFRTIHGDKYYFGNDSAAVTGQQTIDGKVYKFSNYGYLLGNRYGKIENGKLNIYSLADNSLIKTVEAGPWENMAYSMDSNSINNIDGYISYTGWYRPYGTSQDGKTWYPTTVADWRPILMYVWPSKDVQVKFIQYFVNHGYENSNYGLTAGSVKDLSENTASIKLNEVAQNLRYVIEQHVVAAKSTSQLANDINNFITTIPELSKASELSVVNSYGYKPDNSGSVDDDQVIFVNNDSKNQKIGNTSYADSNYRLMNRTINNQNGDNNSDDSPELLVGNDIDNSNPVVQAENLNWEYFLLNYGKFMNYNPNGNFDGFRIDAADNIDADVLDQAAQLINSIYNTKGNQANANDHLIYNEGYHLGAANMLDRKSNPELYMDSGYFYTLENVLGRASDRDDINNLITNSIVNRQNDVSENVATPNWSFVTNHDQRKNLINQIVIDDHPGVADIMSDGYKAEYVNQAWKEFYADQARTDKKYTQYNLPAQYALLLTNKDTVPQVYYGDLYDETDQYMQNKSVYYDAITTLMKARKSYVSGGQSMIKINDHLLTSVRYGKGIIDGNVSMTDILGRNSGIAVVVGNDAQMANQTISINMGKAHANQAYKQLLGTIDSGLTSSDTTIYHTDSNGVLNVTVKGYSNPYVSGYLGVWVPLNGGANITTKASEVTNQSDKTYSSNAALDSHVIYEDFSLFQPEPTSKAEHAYNIIADNASLFNELGITDFWMAPAYTPFNTSRYNEGYSMTDRYNLGTEANLTKYGSGEELSNAIAALHDAGLKVQEDLVMNQMIGFSGQEAVTVTRTDGHAKQLTVDGKTFANQIYFAYTRGGGEGQKNYGGKYLDELQKKYPELFTTKAVSTGVAPDPSVHITEWSAKYQNGTSLQNIGIGLAVKLANGDYAYLNDSNNKAFNTTLPETMSSADYYANIEDD
SEQ ID NO:2
NPTKPVEDAPVTADVGNLHTWWHDNAVYNTDSPTENGEVRRSSFYDVQVAQAHQPDKFFDSFAYMSIPRSGKGKVGYTKEDGAEFSSEANLSMSWSSFEYAKDVWVDVSLKTGQTISSADEVQIRPSSYDFEKKLVDEDTIRIKVPYSDAGYRFSVEFDPQLYTSYNDMSGNSGKLTTVAEGNRPIHTEPMNSMMIFAEPKLQGEEEKRLIPNPSSGSIHYPEEGEVKDLNTVTEEIIYFKPGTYHMGSDYHAVLPPNVKWVYLAPGAYVKGAFRFFHDNQAQYKVTGYGVLSGEQYVYEADTANNYNALSGASNCHVTCVKMLQFESSNIGQQLDLQGVTINEPPYHSFVVYAHEGEKEIGVENFRMNVENYKQVGSWYWQTDGIELYQGGTMKNTFFNANDDVLKMYHSDVTIDNTVIWKNENGPVIQWGWTPRNIDNVNVTDTTVIHNRMYWKDPKYNTCILNSSSHWEDMGSTAKADPNTTVKNMRFENITVEGMTNCAMRIYALSNTENIHVKNLSIDSWNGLDWTSQVSHLKRYTNSAGEKVTIGNEIPDGNGLALENYSVGGEIIEKSGDNWNDYKLGRLGFDGENWDSWNAWKSTP
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种多酶耦合生产低聚异麦芽糖的方法
<130> BAA200816A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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Asp Trp Tyr Met Phe Gly Lys Asp Gly Arg Ile Ala Thr Gly Leu Tyr
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Gln Gln Thr Ile Asp Gly Lys Val Tyr Lys Phe Ser Asn Tyr Gly Tyr
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Leu Leu Gly Asn Arg Tyr Gly Lys Ile Glu Asn Gly Lys Leu Asn Ile
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Thr Thr Ile Pro Glu Leu Ser Lys Ala Ser Glu Leu Ser Val Val Asn
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Val Ile Phe Val Asn Asn Asp Ser Lys Asn Gln Lys Ile Gly Asn Thr
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Asn Gly Asn Phe Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Asp Asn Ile Asp
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Gly Asp Leu Tyr Asp Glu Thr Asp Gln Tyr Met Gln Asn Lys Ser Val
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Asn Gln Ala Tyr Lys Gln Leu Leu Gly Thr Ile Asp Ser Gly Leu Thr
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