一种羟苯水杨胺羟基化物、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种羟苯水杨胺羟基化物、制备方法及其应用 (Hydroxyl benzene salicylamine hydroxylate, preparation method and application thereof ) 是由 裘云庆 楼燕 于 2018-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及羟苯水杨胺羟基化物,所述羟苯水杨胺羟基化物可通过抑制RR酶而抑制乙肝病毒DNA复制,本发明还介绍了羟苯水杨胺羟基化物的制备方法,有助于解决目前对RR酶具有抑制作用的药物分子仍然比较少见的技术问题。(The invention relates to a hydroxyl benzene salicylamine hydroxylate which can inhibit the replication of hepatitis B virus DNA by inhibiting RR enzyme, and also discloses a preparation method of the hydroxyl benzene salicylamine hydroxylate, which is helpful for solving the technical problem that the existing drug molecules with the inhibiting effect on RR enzyme are still rare.)
技术领域
本发明涉及羟苯水杨胺羟基化物，该化合物具有如下结构式：
本发明还涉及羟苯水杨胺羟基化物的制备及其应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎(乙肝)仍是严重威胁我国人民健康的重要传染病之一，是引发我国原发性肝癌的主要因素。我国人群HBsAg携带率近7.2％，全世界约有3.5亿人遭受HBV感染。现有研究表明抑制HBV DNA的复制可以阻止乙肝病情进展、减缓甚至逆转肝纤维化和肝硬化并降低肝癌的发生率。目前国际抗HBV治疗指南推荐的核苷(酸)类似物治疗仍存在较多不良反应和较高的耐药率和病毒变异缺陷。此外，现有药物不能完全清除乙肝病人的肝细胞核内的cccDNA(covalently closed circular DNA)，而cccDNA在患者体内持续存在是慢性HBV感染难以得到治愈的主要原因，事实上，核苷(酸)类似物引起的HBV变异和耐药是全球乙肝治疗史上的难题，也是攻克乙肝的重要障碍。
目前已有研究认为以宿主细胞中的蛋白为靶点的药物比直接作用于病毒本身药物的耐药发生率明显降低，并且以宿主细胞中的蛋白为药物靶点可以避免核苷(酸)类似物的线粒体毒性。因此，在HBV复制周期中寻找病毒-宿主细胞相互作用位点作为新的抗病毒靶标，从而开发既能清除cccDNA又能降低耐药发生率的新的抗HBV治疗方案是目前乙肝治疗及乙肝相关性肝癌防治亟需解决的关键问题，具有重要的临床意义和社会意义。
核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RR)是人体细胞DNA合成和修复的关键酶，其功能是将核糖核苷酸(Ribonucleotide triphosphates，NDPs)还原为脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide triphosphates，dNDPs)，后者进一步被激酶磷酸化为dNTPs，为DNA合成提供原料。HBV自身无编码RR酶的基因，而成年人肝脏中大部分正常肝脏细胞处于静止状态，dNTPs浓度很低。HBV(无RR基因)通过HBx蛋白抑制肝细胞调节因子x1(RFX1)与RRM2的启动子结合或激活DNA损伤通路的Chk1-E2F1途径从而激活宿主肝细胞RR酶表达和酶活性，被异常激活的RR酶可提供足量DNA合成原料，保证HBV复制和肝癌细胞增殖对DNA原料的需求，因而RR酶是乙型肝炎及相关肝癌发生发展的关键因子蛋白，是抗乙型肝炎药物的新的靶标分子。RR酶抑制剂可切断HBV DNA复制原料供给，遏制双链松弛环状分子rcDNA(relaxed circular DNA)合成，可阻止肝细胞内HBV大量复制，有望从源头上有效抑制HBVcccDNA形成，从而减轻肝组织炎性损伤、阻止肝炎发生发展和向肝癌转变。
发明内容
虽然目前已经发现RR酶是乙型肝炎及相关肝癌发生发展的关键因子蛋白，但对RR酶具有抑制作用的药物分子仍然比较少见，本发明为此提供了一种对RR酶具有抑制作用的药物分子，该分子为羟苯水杨胺羟基化物，其结构式如下：
本发明发现，该分子采用SimBioSys公司的分子对接软件eHiTS(Version 12.0,SimBioSys Inc.,Canada)分析显示，eHiTS_Score值(eHiTS_Score对应的是log(Kd)(解离常数取对数)，值越负代表小分子化合物的结合能力越强，如-6相当于μM、-9相当于nM；数值相差为1，结合能力相差10倍)为-3.807。
此外，羟苯水杨胺羟基化物还具有极强的抑制乙肝病毒DNA复制的功能，从而可用于制备治疗乙肝的药物，具体的，所述羟苯水杨胺羟基化物用于制备防治肝炎(尤其是乙型肝炎)的药物。
所述药物可以制备成适应各种给药形式的剂型。
本发明还提供了一种制备羟苯水杨胺羟基化物的方法，该方法包括：
a、将中间体溶解，并加入催化剂，形成第一混合物的步骤；
b、第一混合物加氢完全反应生成羟苯水杨胺羟基化物的步骤；
所述催化剂为钯碳、兰尼镍、四氯化锡、三氯化铁中的一种，所述中间体为：
通常b步骤的反应收率可达80％以上。所述a步骤将中间体溶解，并加入催化剂，通常a步骤中所选用的溶剂能够溶解中间体即可，一般为二氯甲烷、甲醇、乙醇、叔丁醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环，优选甲醇。
所述催化剂的各种规格均可用于对中间体的加氢反应，所述催化剂一般优选钯碳。所述b步骤的反应温度控制在0℃-50℃。
本领域技术人员可以采用各种合成路线合成中间体，但在本发明中，所述中间体由化合物A及化合物B反应生成，所述化合物A为：
所述化合物B为：
其中X为Cl、Br或I。
对于化合物A及化合物B，本领域技术人员可自行查阅技术文件合成，本发明不再叙述。
所述中间体的合成步骤包括：
c、化合物A与化合物B混合溶解，形成第二混合物的步骤；
d、第二混合物完全反应生成中间体的步骤。
通常d步骤的反应收率可达70％以上，c步骤中所选用的溶剂为非极性溶剂，不能使用醇类等极性溶剂。所述非极性溶剂可以是二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、乙腈、二氧六环中的至少一种，优选二氯甲烷、四氢呋喃。
所述c步骤还包括在化合物A与化合物B混合成第二混合物的过程中，对第二混合物冷却的步骤，以抑制副产物的形成。在本发明的部分实施例中，所述对第二混合物冷却的步骤能够使第二混合物的温度保持在-15℃～35℃，优选-15℃～15℃。
为使化合物A与化合物B能够顺利反应，所述c步骤还包括向第二混合物添加不含氢的有机碱的步骤，在该步骤中，依然对第二混合物进行冷却，使得添加所述有机碱的第二混合物的温度控制在15℃以下，以便在保持反应效率的同时尽量降低副产物的生成。在本发明的部分实施例中，所述有机碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选三乙胺。
一般的，化合物A、化合物B以及有机碱的摩尔投料比为1:1-3:1-3，优选1:1-2:1-2。
理论上讲，本领域技术人员可以采用其他合成路线合成本发明所述的羟苯水杨胺羟基化物，但本发明所提供的合成方法却具有显著的技术效果：
1、原料便宜，成本低廉，采购非常方便，合成化合物A及化合物B的原料，技术人员均可参照技术文件选用市售产品作为初始原料；
2、b步骤和d步骤的反应均很充分，副产物不容易生成，事实上，b步骤和d步骤的反应收率均在70％以上；
3、所得副产物均具有一定的水溶性，可通过简单的水洗萃取即可使中间体及所述羟苯水杨胺羟基化物得以纯化，降低了纯化成本。
附图说明
图1为实施例1中中间体的LC/MS谱图；
图2为实施例5中羟苯水杨胺羟基化物的核磁谱图；
图3为实施例5中羟苯水杨胺羟基化物的LC/MS谱图；
图4为实施例5中羟苯水杨胺羟基化物的HPLC谱图；
图5为实施例10所述RRM2的3D结构图；
图6为实施例11所述各药物对HBV DNA的影响图表。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施进一步详细的描述。
A、有关羟苯水杨胺羟基化物的制备工艺
本部分中，化合物B为
1、关于中间体的制备
实施例1
室温下，在反应釜中加入二氯甲烷(20L)，将化合物A(5.00kg，16.37mol，1.0eq)，化合物B(8.08kg，32.75mol，2.0eq)依次加入到反应釜中，降温至0～5℃，滴加4-二甲氨基吡啶(4.00kg，32.75mol，2.0eq)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，保温反应1h，中控反应完全，往反应液中加入水(10L)，二氯甲烷萃取，直接浓缩，得到黄色油状物7.85kg，摩尔收率93％，所得产品不用纯化，直接用于下一步。
EI-MS[M+1]＝516.3，见图1。
实施例2
室温下，在反应釜中加入四氢呋喃(400mL)，将化合物A(100.00g，0.33mol，1.0eq)，化合物B(162.81g，0.66mol，2.0eq)，依次加入到反应釜中，降温至0～5℃，滴加三乙胺(66.66g，0.66mol，2.0eq)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，保温反应2h，中控反应完全，往反应液中加入水(200ml)，浓缩，二氯甲烷萃取，再次浓缩，得到黄色油状物147.91g，摩尔收率87.6％，所得产品不用纯化，直接用于下一步。
实施例3
室温下，在反应釜中加入乙腈(400mL)，将化合物A(100.00g，0.33mol，1.0eq)，化合物B(162.81g，0.66mol，2.0eq)，依次加入到反应釜中，降温至0～5℃，滴加N,N-二异丙基乙胺(128.0g，0.99mol，3.0eq)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，保温反应2h，中控反应完全，往反应液中加入水(200ml)，浓缩，二氯甲烷萃取，再次浓缩，得到黄色油状物151.77g，摩尔收率89.2％，所得产品不用纯化，直接用于下一步。
实施例4
室温下，在反应釜中加入二氯甲烷(1200mL)，将化合物A(100.00g，0.33mol，1.0eq)，化合物B(162.81g，0.66mol，3.0eq)，依次加入到反应釜中，降温至0～5℃，滴加4-二甲氨基吡啶(120.95g，0.99mol，3.0eq)的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，保温反应2h，中控反应完全，往反应液中加入水(200ml)，二氯甲烷萃取，再次浓缩，得到黄色油状物148.35g，摩尔收率87.2％，所得产品不用纯化，直接用于下一步。
2、关于羟苯水杨胺羟基化物的制备
实施例5
室温下，反应釜中加入甲醇(100L)，然后依次加入实施例1-4所得的中间体(7.85kg，15.22mol，1.0eq)，钯碳(785g，10％)，充入氢气，保持0.2MPa压力，室温反应10h，反应完毕后，过滤，滤液浓缩至干，获得粉色固体3.20kg，摩尔收率85.6％。
核磁谱图见图2。
EI-MS[M+1]＝246.3，见图3。
羟苯水杨胺羟基化物的HPLC，见图4。
实施例6
室温下，反应釜中加入四氢呋喃(800mL)，然后依次加入实施例1-4所得的中间体(100g，0.19mol，1.0eq)，兰尼镍(5g，5％)，充入氢气，保持0.2MPa压力，50℃反应24h，反应完毕后，过滤，滤液浓缩至干，获得粉色固体38.67g，摩尔收率81.3％。
实施例7
室温下，反应釜中加入甲醇(1L)，然后依次加入实施例1-4所得的中间体(100g，0.19mol，1.0eq)，钯碳(10g，10％)，充入氢气，保持0.2MPa压力，室温反应5h，反应完毕后，过滤，滤液浓缩至干，获得粉色固体39.14g，摩尔收率82.3％。
实施例8
室温下，反应釜中加入叔丁醇(300mL)，然后依次加入实施例1-4所得的中间体(100g，0.19mol，1.0eq)，钯碳(1g，1％)，充入氢气，保持0.2MPa压力，室温反应10h，反应完毕后，过滤，滤液浓缩至干，获得粉色固体36.48g，摩尔收率78.3％。
实施例9
室温下，反应釜中加入甲醇(1L)，然后依次加入实施例1-4所得的中间体(100g，0.19mol，1.0eq)，钯碳(10g，10％)，充入氢气，保持0.2MPa压力，室温反应5h，反应完毕后，过滤，滤液浓缩至干，获得粉色固体39.14g，摩尔收率82.3％。
B、有关羟苯水杨胺羟基化物在抑制RR酶及乙肝病毒DNA复制方面的作用
1、羟苯水杨胺羟基化物在抑制RR酶方面的作用
实施例10
羟苯水杨胺(Osalmid)及其衍生物分子对接计算
(1)通过SimBioSys公司的分子对接软件eHiTS(Version 12.0,SimBioSys Inc.,Canada)，预测4个化合物与靶标RRM2结合能力大小。
所述4个化合物为：
(2)分子对接方法
小分子的准备：使用OpenBabel 2.3.0将2D小分子转换3D结构，以进行分子对接研究。
靶标及活性口袋定义：RRM2的晶体结构是从PDB库中获得(PDB code:3OLJ)，其活性口袋的定义参照Xia Liu等发表在Biochemical Pharmacology上的文章，即将F244、D271、R330和E334所在区域定义为活性位点。
分子对接方法：使用来自Wiley的eHiTS软件进行分子对接研究。eHiTS是一款精确、快速的柔性分子对接软件。eHiTS会对靶标进行自动预处理；并且对接的小分子只需是3D结构即可，不必是能量最低构象。对接时的精确度参数-accuracy设为6，即最高精确度进行分子对接。分别将羟苯水杨胺及其衍生物对接到此位点以评估其与RRM2结合能力的强弱。
(3)化合物的结合能力打分
4个小分子的对接打分如下，并依据结合能力强弱进行了排序：
Name
eHiTS-Score
OH-1.mol
-3.807
Osalmid.mol
-2.885
OH-2.mol
-2.424
HU.mol
-2.289
注：eHiTS软件通过eHiTS_Score来评价小分子化合物与靶标的结合能力大小。eHiTS_Score对应的是log(Kd)(解离常数取对数)，值越负代表小分子化合物的结合能力越强，如-6相当于μM、-9相当于nM；数值相差为1，结合能力相差10倍。
2、羟苯水杨胺羟基化物在抑制乙肝病毒DNA复制方面的作用
实施例11
羟苯水杨胺羟基化物体外抗HBV活性实验。
1.实验材料
(1)细胞株：HepG 2.2.15细胞(稳定转染HBV基因，可以稳定进行HBV基因组复制和表达，本实验室保藏。
(2)主要试剂：羟苯水杨胺羟基化物(OH-1，杭州核素化学技术有限公司)、羟苯水杨胺(Osalmid，北京百灵威科技有限公司)、拉米夫定(3-TC，北京百灵威科技有限公司)，羟基脲(HU，北京百灵威科技有限公司)，乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)
(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司7500Fast)
2.实验方法：
(1)细胞培养：
HepG 2.2.15及A64细胞培养于DMEM高糖培养基(添加10％胎牛血清、1％青链霉素、400μg/ml的G418，2mmol/L谷氨酰胺)，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO2环境下培养。待细胞生长到70％～80％时，用含有EDTA的胰酶消化传代。
(2)测定药物对HepG 2.2.15细胞培养上清中HBV DNA的抑制作用：
将羟苯水杨胺羟基化物用去除G418的DMEM培养基配制成HepG 2.2.15细胞以5*104个/mL密度铺24孔板，每孔加500μL细胞悬液，置CO2孵箱37℃培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除培养液，加入含药培养基500μL/孔，每个浓度3个复孔。于培养第4、6、8天收集培养基上清检测HBV DNA含量。取5μL细胞培养上清加入5μL样本释放剂，充分混匀后室温孵育10min后加入38μL反应液、2μL酶混合液、0.2μL内标，按以下条件进行扩增：50℃2min、94℃5min预变性后94℃15s、57℃30s并采集信号重复40个循环。通过于标准品Ct值的比值仪器自动计算HBV DNA定量结果。
3.统计学分析：
实验数据用SPSS 13.0软件处理，结果以表示，多个样本均数的比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，p＜0.05为统计学差异显著。
4.实验结果：
与空白组对照组比较，羟苯水杨胺羟基化物在10μM剂量在加药后第4、6、8天对HBV拷贝数有明显抑制作用(P＜0.01)，且随作用时间的延长而增强。其抑制作用优于原型羟苯水杨胺，低于拉米夫定。
表1各药物对HepG 2.2.15细胞培养上清HBV DNA的影响(n＝3，)
与对照组相比，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001
以上所述仅为本发明的具体实施例，并非对本案设计的限制，凡依本案的设计关键所做的等同变化，均落入本案的保护范围。
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