一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用
阅读说明：本技术 一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用 (Preparation and application of monoclonal antibody of spore wall protein of nosema enteromorpha ) 是由 冯耀宇 蒙西南 肖立华 李娜 郭亚琼 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用。基于重组蛋白EbSWP1制得的单克隆抗体对于检测毕氏肠微孢子虫具有良好的特异性,不与虾肝肠微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、大肠杆菌等发生反应。本发明制备的单克隆抗体可与荧光素标记物偶联制得免疫荧光抗体,利用该抗体与环境、粪便中的毕氏肠微孢子虫做直接免疫荧光反应,可以快速、灵敏、准确地检验毕氏肠微孢子虫。与实验室最常用的PCR检测方法相比,本发明的免疫荧光检测方法操作简便,耗费时间短,且检测准确度高,以PCR结果为参考,本发明检测方法的准确率高于85％,该方法简便、快速、灵敏、准确的特点使其适用于基层检测应用。(The invention discloses a preparation method and application of a monoclonal antibody of spore wall protein of nosema peelii. The monoclonal antibody prepared based on the recombinant protein EbSWP1 has good specificity for detecting the Microsporidium Pediculus, and does not react with the shrimp liver intestine Microsporidium Pediculus, rabbit encephalitozoon Microsporidium Pekinensis, Escherichia coli and the like. The monoclonal antibody prepared by the invention can be coupled with a fluorescein marker to prepare an immunofluorescence antibody, and the antibody can be used for carrying out direct immunofluorescence reaction with the enterosporidium parvum in the environment and excrement, so that the enterosporidium parvum can be quickly, sensitively and accurately detected. Compared with the most common PCR detection method in laboratories, the immunofluorescence detection method disclosed by the invention is simple and convenient to operate, short in consumed time and high in detection accuracy, and the accuracy of the detection method is higher than 85% by taking a PCR result as a reference.)
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体及其在毕氏肠微孢子虫检测中的应用。
背景技术
微孢子虫(Microsporidia)是真核细胞内专性寄生的机会性单细胞病原体，能感染多种哺乳动物及鸟类，严重危害公共卫生安全。在所有微孢子虫虫种中，毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)是人患微孢子虫病中最常见的虫种，其易感人群包括艾滋病人、器官移植患者、癌症病人，甚至还包括健康的小孩和老人，能够导致免疫缺陷或低下者长期致死性腹泻，也能够导致免疫功能正常者剧烈的自限性腹泻。由于微孢子虫的尺寸很小，临床快速诊断微孢子虫感染仍存在困难。
目前，实验室常用的微孢子虫诊断方法有PCR法、常规染色法和电子显微镜法。然而，这些方法主要用于研究型实验室和一些政府公共卫生实验室的毕氏肠微孢子虫检测，很少应用于临床诊断实验室。基于PCR的检测方法准确度高，且具有进一步鉴定虫种和基因型的突出优势，但PCR检测耗费的时间和成本较高。常规的染色法：KMnO4-甲基紫法、抗酸的三色染色法、荧光染色剂Calcofluor M2R染色法及Chromotrope 2R染色法等，这些方法操作较PCR法更为简单，但特异性很低，且不能将微孢子虫鉴定到种。电子显微镜又分为扫描电子显微镜和透射电子显微镜，是一种极为准确的鉴定方法，由于它能够使得实验者观察到极丝和其它具有物种特性的超微结构，因此被认为是微孢子虫虫种鉴定的金标准，通常被用于虫体入侵、细胞定位等研究，但电子显微镜的操作繁琐、费用高、耗时长，设备昂贵以及需要更为专业的操作人员，也不适用于常规检测。
免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项标记免疫技术，该技术具有操作便捷，图像直观，结果便于评价等优点，常用于临床检测，而提供一种特异性好、灵敏度高的检测抗体是该方法能否适用于基层检测毕氏肠微孢子虫的关键。虽然现有技术中也有一些免疫检测试剂盒，例如美国Waterborne公司的Bienusi-GloTM试剂盒可通过直接荧光免疫检测毕氏肠微孢子虫，其所使用的抗体源于孢子虫孢壁外的抗原决定簇，但其特异性不强，会出现非特异性染色，且价格昂贵，因此需要提供特异性更强的毕氏肠微孢子虫免疫检测方法。中国专利CN 103728458 A公开了兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用，但目前还未见有关于毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白，及其用于毕氏肠微孢子虫检测中的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为克服上述现有毕氏肠微孢子虫检测方法在基层检测应用中的不便，提供一种可快速准确的检测毕氏肠微孢子虫的抗体和方法。
本发明的第一个目的是提供一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述孢壁蛋白SWP1的基因。
本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种重组表达菌株。
本发明的第五个目的是提供一种重组蛋白。
本发明的第六个目的是提供一种单克隆抗体。
本发明的第七个目的是提供一种免疫荧光抗体。
本发明的第八个目的是提供所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述重组表达菌株、所述重组蛋白、所述单克隆抗体、所述免疫荧光抗体在制备诊断或检测毕氏肠微孢子虫感染试剂或试剂盒中的应用。
本发明第九个目的是提供一种诊断或检测毕氏肠微孢子虫感染的试剂盒。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白基因EbSWP1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种含有上述基因的重组表达载体。
本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的重组表达菌株。
本发明还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白由所述重组表达载体或重组表达菌株经诱导表达后获得。
本发明还提供了一种单克隆抗体，该抗体以所述重组蛋白为免疫原制备得到。
本发明还提供了一种免疫荧光抗体，该免疫荧光抗体由所述单克隆抗体偶联荧光素标记物得到。
另外，本发明还提供了一种诊断或检测毕氏肠微孢子虫感染的试剂盒，含有上述单克隆抗体或免疫荧光抗体。
优选地，所述重组表达菌株为大肠杆菌。
优选地，所述荧光素标记物为异硫氰基荧光素(FITC，激发光下显绿色)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1、其编码基因及重组蛋白EbSWP1，利用重组蛋白EbSWP1制备的毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的特异性良好，不与虾肝肠微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、大肠杆菌等发生反应。所述单克隆抗体可与荧光素标记物偶联制得免疫荧光抗体。利用该抗体与环境、粪便中的毕氏肠微孢子虫做直接免疫荧光反应，可以快速、灵敏、准确地检验毕氏肠微孢子虫感染。利用本发明所述免疫荧光抗体检测毕氏肠微孢子虫感染，完成全部操作仅需2个小时，时间远少于实验室最常用的PCR检测方法，且准确率高，该抗体用于牛粪便样品检验时，以PCR结果为参考，其准确率大于85％，其简便、快速、灵敏、准确的特点使其可适用于基层检测毕氏肠微孢子虫感染。
附图说明
图1为重组蛋白检测结果图。
图2为利用偶联了FITC的毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体荧光免疫检测毕氏肠微孢子虫的镜检结果示意图。
图3为Bienusi-GloTM(现有的国外商品化试剂)染色结果。
图4为荧光染色剂Calcofluor M2R染色结果。
图5为Chromotrope 2R染色结果(需要专业人员辨认镜检结果)。
图6为直接免疫荧光与非特异微生物的直接免疫荧光反应结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1毕氏肠微孢子虫的孢壁蛋白SWP1重组蛋白的制备
1、孢壁蛋白SWP1基因的克隆转化及蛋白诱导表达
发明人前期发现了一种毕氏肠微孢子虫的孢壁蛋白SWP1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码基因EbSWP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白SWP1的基因EbSWP1全长，所用引物由生工生物有限公司(中国上海)合成，其序列为：
SWP1-F 5'-CGGGATCCTATCAAGAAACAAAAAGATATATTG-3'(下划线标为BamH I限制酶位点)；
SWP1-R 5'-TTGTCGACATTAAATTTTTCAAGATGGTTTC-3'(下划线为Sal I限制酶位点)；
反应体系如表1所示
表1
PCR循环包括一个98℃的循环，持续30s；35个周期，分别为98℃10 s，55℃30 s和72℃30 s；一个72℃的循环5分钟。PCR使用PhusionTM高保真DNA聚合酶(货号530L；Thermo，Waltham，MA，美国)扩增。使用TaKaRaMiniBEST DNA片段纯化试剂盒(货号9761；TaKaRa，东京，日本)纯化PCR产物。
把重组EbSWP1-pCold I载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并在补充有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养。通过向培养物中添加1mM异丙硫基-β-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白EbSWP1的表达，并在15℃，180rpm下培养12h。
2、重组蛋白的检测
使用SDS-PAGE和抗His-tag抗体的蛋白质印迹分析检查表达结果。
BL21(DE3)培养物通过离心收集，并通过在冰上超声处理进行裂解，离心裂解物，并将产生的上清液通过0.45μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜滤器(Millipore，Billerica，MA，美国)过滤，将滤液在室温下装载到含有Ni-NTA His-bind树脂的柱子上，用250mM咪唑缓冲液从树脂洗脱重组蛋白EbSWP1，并使用SDS-PAGE和Western blot进行分析。
将40μL纯化的蛋白质添加到10μL的蛋白质添上样缓冲液中，然后在预热温度为100℃的金属浴中孵育10分钟，以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完成后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜进行转移，薄膜转移完成后，用5％脱脂奶粉封闭2小时，使用5％脱脂奶粉以适当的比例稀释小鼠抗his标签单克隆抗体，然后将一抗在4度在下孵育过夜，第二天回收一抗，并添加TBST并洗涤3次，每次5分钟，用适当比例的5％脱脂奶粉稀释HRP标记的山羊抗小鼠，并在室温下孵育PVDF膜1小时。孵育完成后，回收二抗，并添加TBST并洗涤3次，每次5分钟，最后，加入1mL TMB彩色显影液以使PVDF膜显色。如附图1所示，诱导后出现了新的蛋白条带，与预期大小相符；Western blot分析结果出现了单一蛋白条带，且大小与预期相符，表明成功获得重组蛋白EbSWP1。
实施例2毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备
1、将三只5周大的雌性BALB/c小鼠以2周的间隔免疫五次(皮下注射)，每1mL含有200μgSWP1重组蛋白以1:1的比例用弗氏完全佐剂乳化进行第一次接种，并用弗氏不完全佐剂进行后续免疫。用间接ELISA监测小鼠的免疫水平。融合之前，给小鼠腹腔注射溶于100μLPBS的100μgSWP1蛋白作为冲击免疫，3天后收集脾细胞，并与SP2/0细胞融合。
2、准备饲养细胞(提前0.5～1天开始)
(1)准备2只6周龄balb/c小鼠提前12h禁食；
(2)断颈处死，放进75％酒精中泡湿毛发；
(3)剪开腹部皮肤，无菌注射10mL不完全DMEM；
(4)轻按，晃动小鼠；
(5)抽出腹水；
(6)重复2-5，1000rpm离心5min加入10mL HAT计数；
(7)稀释成4×5×104个/mL；
(8)每孔100μL铺5个板；
3、SP2/0细胞收集
(1)融合前扩大培养，准备10个25cm2的flask，每个flask里有5mL培养液；
(2)不完全培养基洗两次，吹下来，1000rpm离心5min，计数；
(3)10mL不完全DMEM重悬，计数；
4、脾细胞准备
(1)准备3个平皿，每个平皿里有10mL不完全培养基；
(2)对免疫完成的小鼠进行眼球采血，断颈处死；75％泡3～5min；
(3)左侧卧剪开腹部皮肤，剪开腹膜，无菌取脾脏；
(4)脾脏在第一个平皿里用镊子剔除结缔组织；
(5)在第二个平皿里冲洗数次；
(6)在第三个平皿里用针管内芯研磨；
(7)将磨好的脾细胞悬液过200目一次性细胞筛，计数；
5、细胞融合
(1)脾细胞与SP2/0细胞混合：SP2/0:脾细胞＝1:5；
(2)补加不完全培养基至30mL，1000rpm离心5min；
(3)吸净上清，叩击管底使细胞松散；
(4)将含有细胞的离心管置于37℃水浴锅内，加1mL 37℃预热50％PEG-1500，边转动边加入，45s加完，静置10s；
(5)加入30mL无血清DMEM，边转动边加入，第1min 1mL，第2min 2mL，第3min 3mL，逐渐加快；
(6)37℃水浴10min；
(7)以1000rpm离心5min，弃上清，用10mL吸管轻吹数次，使大的细胞团块分散，加HAT至50mL；
(8)分装进96孔板，每孔100mL；
6、单克隆细胞筛选
(1)融合5天后，对长出细胞的孔进行半数换液；
(2)融合7天后，对长出细胞的孔全部换液，第二天每孔抽50μL进行ELISA检测；
(3)对ELISA阳性的孔扩大培养，并使用有限稀释法筛选出单个克隆；
(4)连续筛选两次后，用得到的单克隆细胞培养液上清进行间接免疫荧光实验，检测抗体效果，定株；
实施例3毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体偶联FITC
(1)制备溶于0.1M碳酸钠缓冲液(pH＝9)的待交联蛋白样品，浓度≥2mg/mL；
(2)溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1mg/mL的溶液(于标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光)；
(3)对于1mL蛋白溶液加入50μL FITC溶液，可按照每次5μL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；
(4)待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8h；
(5)加入NH4Cl使其终浓度至50mM，4℃终止反应2h；
(6)加入二甲苯青至浓度0.1％，甘油至浓度5％；
(7)使用脱盐离心柱进行脱盐；
(8)于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1％防腐剂。
实施例4毕氏肠微孢子虫的检测
用实施例3中制备得到的免疫荧光抗体分别对牛和猴子中采集到的样本进行检测，并分别用Bienusi-GloTM(现有的国外商品化试剂)检测试剂盒、Calcofluor M2R染色方法、Chromotrope 2R染色方法和巢氏PCR方法对同批样本进行检测，对上述方法的毕氏肠微孢子虫检测结果进行分析和比对。
1、直接荧光免疫分析
(1)将样品薄且均匀地涂布在高吸附玻片上，等待自然晾干；
(2)玻片充分干燥后，火焰固定3次，每次1s；
(3)1％BSA-PBS，37℃湿盒孵育30min；
(4)倾倒或吸弃玻片上的1％BSA-PBS，加入5倍稀释的抗体，37℃湿盒孵育1h；
(5)用PBS清洗玻片3次，置于摇床，每次3～5min；
(6)将玻片上的液体晾至接近干燥，滴加抗淬灭封片剂；
(7)指甲油在盖玻片周围涂一圈。
(8)尽快观察，如果实在不能立刻观察，放进避光湿盒中4℃保存。
直接荧光免疫分析检测结果如附图2所示，图中绿色部分为直接免疫荧光染色的毕氏肠微孢子虫，长宽约为0.8～1.5μm。背景干净，无非特异染色，说明制备得到的免疫荧光抗体特异性好。(Bar＝2μm)
2、Bienusi-GloTM试剂盒检测
(1)将样品薄且均匀地涂布在高吸附玻片上，等待自然晾干；
(2)玻片充分干燥后，火焰固定3次，每次1s；
(3)滴加Bienusi-Glo(1×)，37℃湿盒孵育1h；
(4)用PBS清洗玻片3次，置于摇床，每次3～5min；
(5)将玻片上的液体晾至接近干燥，滴加抗淬灭封片剂；
(6)指甲油在盖玻片周围涂一圈；
(7)尽快观察，如果实在不能立刻观察，放进避光湿盒中4℃保存。
Bienusi-GloTM试剂盒检测结果如附图3所示，结果显示其出现非特异染色，图中被染色的物质长宽大于2μm，不是毕氏肠微孢子虫，说明该试剂盒特异性不强。
3、Calcofluor M2R染色方法
(1)取少量样品悬液，在载玻片上薄薄地涂一层，自然晾干后使用4％多聚甲醛固定；
(2)1:1滴加适量的Calcofluor M2R染剂和10％KOH溶液；
(3)1min后倾倒去溶液，滴加抗淬灭封片剂并封片；
Calcofluor M2R染色方法检测结果如附图4所示，由图可见所有真菌均被染色，无法分辨出毕氏肠微孢子虫，该方法不适用于检测环境样品。
4、Chromotrope 2R染色方法
(1)取少量样品悬液，在载玻片上薄薄地涂一层，自然晾干后火焰固定；
(2)无水甲醇中浸泡5分钟；
(3)装有Chromotrope染剂的染缸置于37℃水浴锅中，玻片插入染缸中浸泡90min；
(4)使用90％酸性酒精(995.5mL 90％乙醇+4.5mL冰醋酸)涮洗10秒；
(5)使用95％酒精涮10秒；
(6)95％酒精中浸泡5分钟；
(7)使用100％酒精浸泡5分钟；
(8)使用100％酒精浸泡再5分钟；
(9)使用二甲苯或二甲苯替代品浸泡10分钟；
(10)使用二甲苯或二甲苯替代品再浸泡10分钟；
(11)中性树胶封片剂封片。
Chromotrope 2R染色方法检测结果如附图5所示，毕氏肠微孢子虫为大小约0.8～1.5μm的卵圆形，中间或一端为粉红色，在实际操作中，Chromotrope 2R染色后的毕氏肠微孢子虫并不容易观察，需专业人员镜检辨认。
5、巢氏PCR检测
使用基于内部转录间隔区(ITS)的巢式PCR方法分别对牛和猴子中采集的样本进行鉴定，所用引物对为：
Eb-ITS-F1：GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT
Eb-ITS-R1：TATGCTTAAGTCCAGGGAG
Eb-ITS-F2：AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
Eb-ITS-R2：AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
巢式PCR所使用的酶为DreamTaq PCR Master Mix(2X)，其PCR反应体系如表2所示
表2
PCR Primary Mix
n＝1
Secondary Mix
n＝1
Water
19.5
Water
18
Fermentas Mix(2X)
25
Fermentas Mix(2X)
25
BSA(10mg/ml)
2
F2(10μM)
2.5
F1(10μM)
1.25
R2(10μM)
2.5
R1(10μM)
1.25
Total
48
Total
49
Primary PCR Product
2
DNA
1
巢式PCR程序如下：
第一轮：94℃5min；35cycles at 94℃45s,55℃45s，68℃1min；68℃for 7min
第二轮：94℃5min；35cycles at 94℃45s,55℃45s，68℃1min；68℃for 7min
分别计算直接免疫荧光、Chromotrope 2R和巢氏PCR方法检测样品的阳性率，并将直接免疫荧光检测结果与Chromotrope 2R和巢氏PCR检测结果进行比对，计算其直接免疫荧光敏感度，如表3所示。
表3
如表3所示，利用本发明免疫荧光抗体直接免疫荧光分析与Chromotrope 2R检测结果相比，其准确率可高于100％，与巢氏PCR检测结果相比，直接免疫荧光分析的准确率高于85％。
实施例5免疫荧光抗体的特异性检测
用实施例3制备所得免疫荧光抗体分别对虾肝肠微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和大肠杆菌进行直接免疫荧光分析，观察其是否能被本发明所述免疫荧光抗体染色，直接免疫荧光分析步骤同实施例4。
特异性检测结果如附图6所示，左图A是虾肝肠微孢子虫的直接免疫荧光的结果，左图B是兔脑炎微孢子虫的直接免疫荧光的结果，左图C是大肠杆菌的直接免疫荧光的结果，对应右图为微分干涉显微镜(DIC)下拍摄的微生物，结果显示没有非特异染色，表明本发明所得免疫荧光抗体的特异性好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种毕氏肠微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 228
<212> PRT
<213> 毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)
<400> 1
Met Tyr Gln Glu Thr Lys Arg Tyr Ile Glu Arg Lys Leu Lys Lys Ile
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Tyr Thr Lys Leu Pro Asp Gly Tyr Glu Asp Ile Glu Ile
20 25 30
Arg Tyr Arg Lys Val Arg Asp Glu Ile Gly Ile Leu Gln Asn Val Val
35 40 45
Asn Gly Leu Thr Tyr Tyr Glu Tyr Gly Gly Thr Val Met Lys Asn Val
50 55 60
Ala His Trp Ala Asn Ile Val Gly Glu Ser Thr Asn Ile Asn Ala Ile
65 70 75 80
Lys Arg Glu Asp Ile Tyr Thr Asn Thr Ser Thr Val Gly Met Gln Leu
85 90 95
Ala His Thr Val Ser Asp Lys Ser Leu Lys Glu Val Cys Thr Glu Phe
100 105 110
Ser Thr Ala Tyr Glu Asn Ile Ala Ile Glu Lys Arg Lys Met Asn Glu
115 120 125
Lys Met Glu Asp Val Thr Asp Glu Leu Asn Asn Leu Lys Lys Lys Cys
130 135 140
Lys Gln Ile Asp His Gln Arg His Ile Val Lys Asn Ile Arg Tyr Asp
145 150 155 160
Leu Glu Glu Leu Leu Gln Ser Asn Val Tyr Lys Glu Asp Ile Lys Asn
165 170 175
Arg Leu Glu Lys Lys Leu Glu Ser Asn Gly Lys Glu Ile Gln Glu Gln
180 185 190
Met Thr Asp Phe Val His Leu Ser Met Ile Asn Gly Ile Ile Val Lys
195 200 205
Ile Ala Lys Ile His Lys Glu Phe Cys Glu Ala Ala Gly Asn His Leu
210 215 220
Glu Lys Phe Asn
225
<210> 2
<211> 687
<212> DNA
<213> 毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)
<400> 2
atgtatcaag aaacaaaaag atatattgaa agaaaactaa aaaaaataga atatatctac 60
acaaaattac ctgatggata cgaagacatt gaaattaggt atagaaaggt acgtgatgaa 120
atagggatac ttcagaatgt ggtaaatgga ttaacatatt atgaatatgg aggaactgta 180
atgaaaaatg ttgcacactg ggcaaatatt gttggggaaa gtactaatat caatgcaata 240
aagcgcgaag atatatatac aaatacttct acagttggaa tgcagctggc acacactgtt 300
agtgataagt cactgaaaga agtttgtaca gaattttcta cagcgtatga aaatattgct 360
atagaaaaac gaaaaatgaa tgaaaagatg gaggatgtga cagacgaatt aaataacctt 420
aaaaaaaaat gcaagcaaat tgatcatcag cgacatattg ttaaaaatat taggtatgat 480
ttagaggaat tattacaaag caacgtttac aaagaagata ttaaaaatcg tcttgaaaaa 540
aaacttgaaa gtaatggcaa agagattcaa gaacaaatga cagactttgt tcatctttct 600
atgattaatg gaattatagt taaaatagcg aaaatacata aagaattttg tgaagcagcg 660
ggaaaccatc ttgaaaaatt taattaa 687
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