嵌合蛋白、其生产方法和用途，以及核酸分子、表达盒、表达载体、宿主细胞、用于诊断利什曼病的组合物、用于诊断利什曼病的试剂盒和体外诊断利什曼病的方法
阅读说明：本技术 嵌合蛋白、其生产方法和用途，以及核酸分子、表达盒、表达载体、宿主细胞、用于诊断利什曼病的组合物、用于诊断利什曼病的试剂盒和体外诊断利什曼病的方法 (Chimeric proteins, methods for their production and use, as well as nucleic acid molecules, expression cassettes, expression vectors, host cells, compositions for diagnosing leishmaniasis, kits for di) 是由 O·P·D·M·内托 A·M·雷森德 D·D·H·C·塔瓦雷斯 W·J·T·多斯桑托斯 A· 于 2020-02-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及嵌合蛋白、以及其用途和生产方法,所述嵌合蛋白包括用于诊断内脏利什曼病的天然婴儿利什曼原虫的蛋白级分。本发明还涉及核酸、表达盒、表达载体、宿主细胞、用于诊断内脏利什曼病的组合物、用于诊断内脏利什曼病的试剂盒、诊断内脏利什曼病的方法和疫苗组合物。(The present invention relates to chimeric proteins, including protein fractions of natural infant leishmania for diagnosis of visceral leishmaniasis, as well as uses and methods of production thereof. The invention also relates to nucleic acids, expression cassettes, expression vectors, host cells, compositions for diagnosing visceral leishmaniasis, kits for diagnosing visceral leishmaniasis, methods of diagnosing visceral leishmaniasis, and vaccine compositions.)
技术领域
本发明涉及诊断医学和生物技术领域。具体地，本发明涉及用于在人、狗和其他脊椎动物宿主中的婴儿利什曼原虫的诊断应用的多肽，更具体地是嵌合蛋白。
背景技术
利什曼病(Leishmaniasis)是由属于锥虫科(Trypanosomatidae)和利什曼原虫属(Leishmania)的鞭毛原生动物引起的传染性寄生虫病。
这些原生动物具有异源生命周期，交替生活在脊椎动物宿主(包括人和其他野生和/或家养哺乳动物，例如狗)和媒介双翅昆虫(vector dipterous insects)中，后者属于白蛉属(Phlebotomus)和罗蛉属(Lutzomyia)(PACE,2014)。
目前，已知的利什曼原虫大约有30个种，其中10种存在于旧大陆(the OldWorld)，另外20种存在于新大陆(the New World)，其中大约20种能够引起皮肤和/或内脏利什曼病。
利什曼原虫属的原生动物在功能和形态两方面具有两种非常不同的进化形式，即前鞭毛体(promastigotes)和无鞭毛体(amastigotes)。
无鞭毛体形式存在于脊椎动物宿主中，呈现球形至卵形形状。它们是固定的、强制性的细胞内形式，这是因为它们具有位于鞭毛囊内的、主要作为内吞作用和胞吐作用的部位的短鞭毛。它们在单核吞噬系统的细胞液泡中发育，因此它们是适应这种环境的低pH的嗜酸细胞。
前鞭毛体形式存在于媒介(无脊椎动物宿主)的肠道中，并随着长度的变化而拉长。它们是细胞外的鞭毛虫形式，可以表现为前期前鞭毛体(procyclic promastigotes)，定义为更多的卵形、移动和复制细胞，或作为感染性形式的后期前鞭毛体(metacyclicpromastigotes)，更长且没有增殖能力。(KAYE；SCOTT,2011；MURRAY等人,2005)。
利什曼病具有作为媒介的属于节肢动物门、昆虫纲、双翅目、蛾蚋科、白蛉亚科的无脊椎动物。已知有两个属，白蛉属(存在于旧大陆)和罗蛉属(存在于新大陆)(AKHOUNDI等人,2016；READY,2013)。
利什曼原虫寄生虫的生命周期分为两个阶段，第一阶段在脊椎动物宿主(哺乳动物)中，第二阶段在无脊椎动物宿主(沙蝇)中。该周期开始于受感染的雌性沙蝇蚊从脊椎动物宿主(狗或人)摄取血液时。在摄取血液的同时，昆虫将寄生虫的后期前鞭毛体(感染形式，位于媒介的气门瓣(stomatal valve)中)与其唾液成分一起反刍。
后期前鞭毛体接着被在接种部位发现的不同类型的免疫系统细胞吞噬，在那里它们分化成无鞭毛体形式。该周期完成于被无鞭毛体感染的巨噬细胞被另一只沙蝇吞食时，在那里它们将经历不同的发育阶段，直到它们恢复到后期形式。这些阶段中的每一个都以形态和功能变化为特征，以确保在媒介内存活。
在分化步骤之后，后期前鞭毛体将迁移到气门瓣以接种到另一个脊椎动物宿主中并继续周期(KAMHAWI,2006；KAYE；SCOTT,2011)。
利什曼病被认为是主要的被忽视的疾病，主要影响来自发展中国家的个体。流行发生在非洲、亚洲、地中海、欧洲西南部以及南美洲和中美洲的热带和亚热带地区。该疾病在98个国家流行，其中72个是发展中国家，每年登记的新病例超过100万(ALVAR等人,2012)。
该疾病可分为两种主要形式，它们根据症状和临床形式而不同，并且与不同的利什曼原虫的种有关。皮肤利什曼病(Cutaneous Leishmaniasis,LC)的特征是皮肤病变可扩散到粘膜，而在内脏利什曼病(Visceral Leishmaniasis,LV)中，寄生虫寄居在诸如脾脏、淋巴结、骨髓和肝脏等内脏器官中。由杜氏利什曼原虫(L.donovani)和婴儿利什曼原虫(L.infantum)引起的VL具有比LC低的发病率，但如果不治疗，则是一种更严重和致命的形式(CHAPPUIS等人,2007)。
家犬在流行地区的VL的流行病学中起主要作用，因为它是该疾病的主要家养宿主(reservoir)。这种重要性来自如下事实：Calazar(该疾病的俗名)在犬类中比在人中更普遍，并且人病例通常先于犬类病例。(QUINNELL；COURTENAY,2009)。
利什曼病的免疫学和发病机制是复杂的，并且与涉及宿主抗性和易感性的大量遗传和细胞因素有关。一段时间以来，已知对寄生虫感染的控制似乎取决于与Th1应答相关的CD4+T淋巴细胞和激活巨噬细胞的白细胞介素(IL)IL-12、IL-18、IL-27相关的免疫应答。如IL-12、IFN-γ还通过增加Th1应答的产生来产生有效的应答。
另一方面，与细胞因子如IL-10和IL-4相关的Th2应答维持寄生虫的持续存在，因此VL感染的发展将取决于由脊椎动物宿主产生的应答。如果与Th1应答相比Th2应答增加，则巨噬细胞的失活会导致宿主无法控制感染。
最近已经观察到，其他类型的免疫系统细胞，例如称为Th17的那些细胞，似乎也在定义脊椎动物宿主如何对利什曼病的病原体感染作出反应方面发挥关键作用(SRIVASTAVA等人,2016)。
关于利什曼病免疫应答的知识已经随着实验模型例如小鼠的使用，和对人类细胞的研究而得到增强，但对其如何在狗中发生知之甚少。
VL的临床症状与全身感染相关，包括长期持续发热、食欲不振、体重减轻、疲劳、咳嗽、腹痛、水肿和腹泻，以及脾脏、肝脏和淋巴结肿大、全血细胞减少症、贫血和高丙种球蛋白血症。
在它们的早期阶段，这些症状很容易与其他疾病的症状相混淆，导致疾病的诊断延迟并使其治疗复杂化(SINGH；SUNDAR,2015；SRIVASTAVA等人,2011；SRIVIDYA等人,2012)。
犬类VL诊断对于整个疾病的控制也是极其相关的点，因为临床健康的狗可被感染，并且即使在某些临床症状明显的情况下，这些也可导致病理学的错误识别(GOMES等人,2008；NOLI；SARIDOMICHELAKIS,2014)。
在狗中，VL演化缓慢且发病隐匿，是一种全身性严重疾病，其临床表现取决于由感染的动物表达的免疫应答类型。
感染的狗的临床表现呈现一系列临床特征，范围从明显的健康状态到严重的终末期。最初，寄生虫存在于咬伤部位，但后来发生内脏感染和通过真皮扩散。感染引起的脱发暴露了大面积广泛寄生的皮肤(PALTRINIERI等人,2016；SARIDOMICHELAKIS,2009)。
在人和狗二者中确认VL诊断的金标是在通过内脏器官例如骨髓和脾脏的活检而获取的材料中鉴定利什曼原虫寄生虫。然而，这种方法不灵敏、劳动强度大，并且需要侵入性程序(CHAPPUIS等人,2007；SRIVASTAVA等人,2011；SUNDAR；RAI,2002)
分子检测是最近基于PCR技术的变化而开发的，虽然它们根据所使用的方法可显示出不同的敏感性和特异性结果，但总的来说，它们具有最小的侵入性是相当令人满意的，但都需要不适合现场使用的设备(DE RUITER等人,2014)。
然而，VL的特征在于高丙种球蛋白血症或抗利什曼原虫抗体的大量产生，这有利于使用免疫学技术来检测这些抗体。在这些技术中，以下技术脱颖而出：IIF(间接免疫荧光)、DAT(直接凝集试验)、蛋白质免疫印迹(Western-Blot)、ELISA(酶免疫分析)和快速检测。
IIF具有相当大的敏感性，但特异性低，其中在低滴度下观察到与其他疾病例如恰加斯病、疟疾和血吸虫病的交叉反应。它的应用需要高水平的技能、经验以及专业的、高成本的设备。此外，血清的连续稀释使大量样本的筛查变得费力，这也是一种不太适合大规模流行病学研究的反应。
DAT基于对与血清中的抗利什曼原虫抗体反应的利什曼原虫前鞭毛体的直接凝集的检测，导致前鞭毛体的凝集，并且构成了一种易于进行的技术。然而，抗原的标准化和质量控制存在困难。
DAT的局限性之一是需要较长的孵育时间(18小时)以及必须对血清或血浆进行多次稀释，这使得试验费力且不适合筛选大量样品。
ELISA检测是一种现代方法，允许在短时间内进行大量检测，是最广泛用于VL免疫诊断的方法。该检测敏感性高，允许检测低抗体滴度，但会在检测亚临床或无症状病例时不准确，这是因为ELISA检测在VL、尤其是犬类VL的诊断中的性能不仅与所使用的抗原的类型有关，也与被测狗的临床状态有关。
ELISA的快速替代方案并使用最少的基础设施是快速免疫色谱检测，其基于硝化纤维素膜免疫色谱，其中使用固定在纸上的重组抗原(rK39)(BOELAERT等人,2004；等人,2011；CHAPPUIS等人,2007；METTLER等人,2005；SRIVASTAVA等人,2011；SUNDAR；RAI,2002)。
重组rK39抗原是来自婴儿利什曼原虫的39个氨基酸的肽，已被鉴定为对人VL诊断具有高吸引力(SINGH等人,1995)。基于rK39的快速检测在人VL识别检测中显示出高敏感性和特异性(SUNDAR等人,1998)。
因此，该检测开始被视为VL控制程序中的有前途的工具，因为它需要少量外周血并且快速进行和读取(在10到20分钟之间)并且可以在现场条件下使用(CHAPPUIS等人,2006,2007；GOMES等人,2008)。
然而，在世界不同国家，例如在非洲大陆，使用rK39的研究之间存在差异，并显示出明显不同的结果。这些数据表明，抗原的敏感性可能因使用它的区域而异(BOELAERT等人,2014；SRIVASTAVA等人,2011)。
在巴西，K39诊断性能被认为仅对于确认疑似犬类VL病例的感染是合理的(QUINNELL等人,2013)。最近，巴西使用了另一种基于重组rK28抗原的免疫色谱快速检测，该抗原是一种合成基因，由杜氏利什曼原虫haspb1和rK39的几个重复序列融合产生，并使用ELISA作为验证方法(PATTABHI等人,2010)。
该检测是用来自三个州(巴伊亚州(Bahia)、北里奥格兰德州(Rio Grande doNorte)和米纳斯吉拉斯州(Minas Gerais))的感染该疾病的狗的血清进行的，并且在有症状的狗中表现出高敏感性，但在无症状狗中表现出较低的敏感性(FRAGA等人,2016)。
在由本发明的一些作者进行的且与本发明直接相关的先前工作中，尝试鉴定具有用于VL血清学诊断的潜力的婴儿利什曼原虫的新多肽(Oliveira等人,2011；Magalhaes等人,2017)。
然后通过用来自受该疾病影响的动物和人类患者的血清筛选婴儿利什曼原虫cDNA表达文库来鉴定新抗原。作为该筛选的结果，并且在对用来自婴儿利什曼原虫和硕大利什曼原虫(L.major)基因组数据库的序列获得的克隆进行序列同源性分析之后，鉴定了编码五种不同蛋白质的克隆，命名为Lci1至Lci5。
然后将这些的片段在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达，然后使用来自受该疾病影响的动物和人类的血清的ELISA测定来评价衍生的重组蛋白在VL诊断中的潜力。
这些分析得出的一个重要结果是，检测人VL的最有效抗原并不是犬类VL的最佳抗原，反之亦然。(OLIVEIRA等人,2011)。
然后在用于诊断感染婴儿利什曼原虫的狗的快速免疫色谱检测中评价了两种产生的重组蛋白(Lci1A和Lci2B)，可以验证这两种抗原与基于rK28蛋白的检测合作将敏感性从88％增加到93.5％，表明抗原的组合是VL诊断的优异替代方案(FRAGA等人,2014)。
等人(2017)随后在新的表达文库筛选中鉴定了第二组新的婴儿利什曼原虫抗原，这次使用来自感染该病原体的患者的基因组文库和一组血清。鉴定了七种新抗原(Lci6至Lci12)，其中五种尚未在利什曼原虫中正确表征。
其中六种的片段在大肠杆菌中表达，并且还评价了各自的重组蛋白在人和犬类VL诊断中的潜力。这些都被认为不能满足人VL诊断(等人,2017)。
等人进一步评价了在早期独立进行的婴儿利什曼原虫cDNA文库筛选中鉴定的另一种蛋白质(CAMPOS等人,2008)，然后将其命名为Lci13，证实该蛋白质被认为不能满足人VL诊断。
专利申请PI 0900961-2涉及用于利什曼病诊断的13种不同的利什曼原虫抗原(Lci1至Lci13)。然而，由于没有一种新鉴定的抗原被证明对人和犬类形式的VL的诊断均有效，并且发现可用的血清学检测对犬类VL的诊断不够有效，因此我们寻求替代方案来开发用于诊断人和狗的VL的独特系统。
此外，用于早期和快速用于确认内脏利什曼病(VL)并适用于人和犬类宿主样本二者的简单诊断方法将是支持对抗和控制该疾病的重要工具。
目前，没有可用于犬类VL诊断的优质血清学检测。在进行的一项荟萃分析(meta-analysis)研究(PEIXOTO；DE OLIVEIRA；ROMERO,2015)中，可以确定用于诊断CVL的主要血清学方法(ELISA和DPP)中使用的抗原不是高度准确的。这项研究还强调了改进、提高质量和实施新检测来诊断这种疾病的必要性。
缺乏可靠的诊断方法在监测流行地区方面造成了很大的差距，因为对检测的大部分需求都针对这些地区的狗。由于这个问题，CVL的可靠诊断需要一组血清学和分子检测(ELISA、IFAT、PCR和qPCR)，这是一种非常昂贵的做法(BOURDEAU等人,2014)。如果没有对狗的疾病进行诊断和控制，就不可能期望它在人类中得到成功控制。
在这点上，应该澄清的是，在单个分子中组合多个抗原决定簇的重组蛋白(嵌合蛋白)的开发可产生极好的提案，因为它促进了诊断检测的标准化，并且已经有研究表明，与在同一试验中使用多个分子相比，包含多个抗原的单个分子可以使抗原决定簇更好地分布在ELISA板上(CAMUSSONE等人,2009)。
1990年代的开创性工作和最近的研究强调了嵌合蛋白在诊断婴儿利什曼原虫感染方面的潜力(BOARINO等人,2005；FARIA等人,2015；SOTO等人,1998)。然而，迄今为止，这些分子在临床中的使用，特别是用于犬类VL诊断，仍然受到限制和/或没有导致疾病诊断质量的显著提高。
可以看出，没有现有技术文献教导用于人或狗的VL诊断的单一工具。针对现有技术中VL诊断的上述问题，本发明提供了三种重组蛋白的选择，选择在人或犬类VL诊断中的最佳性能以及具有高敏感性和特异性的包含多种抗原决定簇的嵌合蛋白的后续开发。
在此处提供的本发明的描述中，本发明的优点将是显而易见的。
发明内容
本发明旨在提供用于人和狗的VL诊断的多肽。
多肽呈嵌合多肽构建体的形式，其包含用于VL诊断的有效蛋白的抗原区域。
特别地，本发明涉及用于人和狗的VL诊断的合成嵌合蛋白的生产。
在第一个实施方案中，本发明提供包含用于VL诊断的有效蛋白抗原区域的嵌合蛋白。
在第二个实施方案中，本发明提供编码所述嵌合蛋白的核酸分子及其简并序列。
在第三个实施方案中，本发明提供包含所述核酸分子的表达盒。
在第四个实施方案中，本发明提供包含所述核酸分子或所述表达盒的表达载体。
在第五个实施方案中，本发明提供包含所述核酸分子、所述表达盒或所述表达载体的宿主细胞。
在第六个实施方案中，本发明提供一种生产所述嵌合蛋白的方法，包括以下步骤：
用包含如上限定的前述核酸分子的表达载体转化宿主细胞，
培养所述宿主细胞以产生嵌合蛋白；和
从所述细胞或从所述细胞周围的培养基中分离所述嵌合蛋白。
在第七个实施方案中，本发明提供一种内脏利什曼病诊断组合物，其包含一种或多种如上限定的嵌合蛋白。
在第八个实施方案中，本发明提供一种内脏利什曼病诊断试剂盒，其包含一种或多种嵌合蛋白或如上限定的组合物。
在第九个实施方案中，本发明提供一种或多种嵌合蛋白在内脏利什曼病诊断中的用途。
在第十个实施方案中，本发明提供一种诊断内脏利什曼病的方法，包括以下步骤：
从人或狗血清样品中，将一种或多种嵌合蛋白与人或狗血清样品接触，
使用免疫学检测技术检测在上一步中形成的嵌合蛋白/抗体复合物。
附图说明
图1是嵌合蛋白Q1和Q5的示意图。示出完整的嵌合体。在(Q1)中显示Lci12-2-3-13区域，在Q5中显示Lci12-2-3区域，两侧是用于截短的XbaI/HindIII酶位点和SalI/XhoI位点以及侧接NcoI位点的pSS-gIII优化标签。
图2指嵌合基因亚克隆的确认。可以观察到显示基因Q1COM、Q1NN、Q1SX和Q5的1％琼脂糖凝胶，通过双酶XbaI/HindIII的消化，完整嵌合基因(以红色显示)以表1所示的预期大小释放。从而确认亚克隆。使用的标记是Ladder1Kb plus。注意：Q1COM被酶ScaI/XbaI/HindIII消化，因为插入片段与载体大小相同，因此使用ScaI进行额外的消化，导致质粒裂解为两个片段，并允许将所示插入片段可视化。
图3指嵌合蛋白的表达。可以看到显示嵌合蛋白在表2中描述的大小的大肠杆菌Rosetta细胞中表达的SDS-PAGE凝胶。
图4指嵌合蛋白的蛋白质免疫印迹。可以观察到抗组氨酸单克隆抗体对嵌合蛋白的识别。蛋白质的反应以其预测的大小显示为红色。
图5指通过亲和色谱纯化重组嵌合蛋白Q1SX和Q5。该图显示Q1SX和Q5蛋白通过亲和色谱的纯化图谱，以红色突出显示。
图6指Q1SX嵌合蛋白与VL血清的间接ELISA。散点图和条形图显示VL阳性的50份人和40份狗血清针对Q1嵌合蛋白的敏感性和特异性。水平线代表反应的截止。
图7指Q5嵌合蛋白与VL血清的间接ELISA。散点图和条形图显示VL阳性的50份人和40份狗血清针对Q5嵌合蛋白的敏感性和特异性。散点图显示针对Q5的人和狗的血清。水平线代表反应的截止。
图8指Q5嵌合蛋白与LTA血清的间接ELISA。散点图显示ATL阳性50份人血清针对Q5嵌合蛋白的交叉反应。水平线代表反应的截止。
图9指Q5嵌合蛋白与HIV和HIV+/VL+共感染血清的间接ELISA。散点图显示HIV阳性人血清的交叉反应性以及共感染(VL+HIV)针对嵌合Q5蛋白的敏感性和特异性。散点图显示针对Q5的阳性和阴性人类血清。水平线代表反应的截止。
具体实施方式
除非有不同的限定，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属主题的技术人员所理解的含义相同。用于描述本发明的术语旨在仅描述特定实施方案，并不旨在限制教导的范围。除非另有说明，否则描述性报告和权利要求中使用的所有表示数量、百分比和比例以及其他数值的数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另有说明，否则描述性报告和权利要求中显示的数值参数是近似值，可根据要获得的特性而变化。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如FundamentalVirology,第2版,vols.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe,编辑.)Handbook of ExperimentalImmunology,Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑.,Blackwell ScientificPublications)；T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前版本)；Sambrook,等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑.,Academic Press,Inc.)。
本发明的多肽在敏感性和特异性方面表现出再现性。这表明开发的蛋白质可以长时间保持稳定，维持其反应能力。储备缓冲液的组成可有利于其稳定性、蛋白酶抑制剂的使用、缓冲液中变性剂的存在、或者甚至是它们的氨基酸序列。当对诊断应用感兴趣时考虑稳定的蛋白质。
如本申请通篇所用，术语“氨基酸”表示可由核酸直接编码或以前体形式编码的α-氨基基团。单个氨基酸通过由称为密码子或碱基套组(suit of bases)的三个核苷酸组成的核酸编码。各氨基酸由至少一个密码子编码。由不同密码子编码相同氨基酸的事实称为“遗传密码的简并性”。本申请使用的术语“氨基酸”表示天然存在的α-氨基酸，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。
术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可以互换使用，并且是指通过肽键连接的氨基酸的聚合物，而不管构成该链的氨基酸残基的数量如何。如本文所用，多肽包括其“变体”或“衍生物”，是指在其氨基酸序列中相对于参考多肽包括变异或修饰例如取代、缺失、添加、或化学修饰的多肽。化学修饰的实例是糖基化、PEG化、PEG烷基化、烷基化、磷酸化、乙酰化、酰胺化等。多肽可以使用重组DNA技术从克隆的核苷酸序列人工产生，或者可以使用已知的化学合成反应来制备。
更具体地，本发明的术语多肽也可以理解为抗原、多抗原或多表位抗原，它们由不同表位的连接组成，这些表位可以或可以不通过柔性或刚性的配体(接头)连接，特异于单一病原体或不同的病原体。
在第一个实施方案中，本发明提供包含天然婴儿利什曼原虫蛋白的级分(fraction)的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白是从已经描述的13种称为Lci蛋白(Lci1至Lci13)中的三种的抗原组合中产生的，选择用于呈现人VL诊断(Lci2)或犬类(Lci3和Lci12)的最佳结果。
这些蛋白是从化学合成的基因产生的，这些基因经历了多个亚克隆步骤，并且由这三种抗原蛋白的相同片段的剪接组成。
为嵌合构建体选择的三种蛋白(Lci2、Lci3和Lci12)彼此之间没有序列同源性，但具有相似的结构，由多个拷贝的小基序(Lci2-39氨基酸；Lci3-14氨基酸；Lci12-8氨基酸)重复多次，两侧是非重复区域，如(等人,2017；OLIVEIRA等人,2011)所述。
嵌合构建体中包括的各Lci的抗原区域的选择基于大小、溶解度和免疫原性潜力标准。然后优化各个编码序列以在大肠杆菌中表达并拼接成序列，考虑以下参数：阅读框(reading phase)、密码子频率、mRNA二级结构、GC含量分布和限制性位点。
在嵌合蛋白的抗原区域之间包括小的间隔区，旨在促进所得重组蛋白的折叠条件。还包括合成基因的5'末端以及编码蛋白末端的区域的优化序列，例如：pRBS-SD1+6AA-核糖体结合位点和Shine-Dalgarno序列；pSS-gIII-用于优化表达的噬菌体包膜蛋白的N末端序列；t7标签肽-N末端序列，用于稳定和优化表达；ET-6His-在C末端引入的多组氨酸序列(六个)以允许纯化蛋白；和翻译终止密码子。
限制性酶位点也沿着构建体在关键点处添加至合成基因，以允许在必要时通过包括或排除一些序列并允许进一步操纵它们的结构来容易地修饰这些基因。这些基因产生了具有2845和1986bp预测大小的嵌合构建体Q1(SEQ ID NO:1、3、和5)和Q5(SEQ ID NO:7)(图1)。
这些不同之处在于Q5构建体包括Lci3蛋白的额外重复片段，Q1构建体中不存在，而原始Q1构建体在基因的3'末端具有的特征是编码第四种抗原蛋白Lci13的C末端区域的片段。拥有商业合成的基因构建体，然后将它们亚克隆到细菌表达载体pRSETa中，通过限制性酶对XbaI/HindIII的消化，释放预期大小的DNA片段(图2)并通过测序分析确认亚克隆。
仅对于Q1构建体(SEQ ID NO:1)，使用仅存在于合成基因中的内部限制性位点对克隆到质粒pRSETa中的片段进行消化，以产生该基因的截短变体，其中去除编码蛋白选定部分的不同片段。
该步骤的目标是扩大合成的嵌合蛋白的数量，以了解哪些可能的替代物和抗原组合增强了原核系统中的蛋白表达。
用酶NcoI进行第一次消化，该酶在编码表达优化肽pSS-gIII的基因的N末端区域释放75bp片段。
在质粒构建体的纯化和重新连接之后，该片段丢失并且所得嵌合基因稍小，编码其中该肽不存在的截短的Q1蛋白(Q1NN-SEQ ID NO:4)。
使用等效策略，使用SalI/XhoI酶从完整基因(SEQ ID NO:1)进行第二次消化。由于这些酶的限制性位点是互补的，这种消化的主要片段产物的连接导致产生嵌合基因(SEQID NO:5)，其中去除了编码Lci13的1155bp片段(Q1SX-SEQ ID NO:6)。
图2还显示消化含有由嵌合Q1基因(SEQ ID NO:1)产生的两个截短构建体的质粒后产生的片段，每个片段的大小总结于表1中。
表1
主名称
插入大小(以pb计)
蛋白大小(kDa)
Q1
2845
102
Q1NN
2734
99
Q1SX
1690
60
Q5
1960
98
在第二个方面，本发明提供编码所公开嵌合蛋白的核酸分子。
本发明的核酸分子非限制性地由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQID NO:7、或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:7、或其编码相同多肽的简并序列具有至少90％的同一性的序列表示。
术语“简并核苷酸序列”表示与编码给定多肽的参考核酸分子相比时包括一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(例如，GAU和GAC都编码Asp)。
本领域技术人员会认识到，基于本申请中提供的信息和现有技术的公知常识，完全支持简并性。例如，遗传密码的简并性(即不同的密码子可以编码相同的氨基酸)是本领域公知的，并且由每个密码子编码的氨基酸的身份已经很好地确立。
基于现有技术中公知和确立的信息，本领域技术人员够鉴定不改变所得氨基酸序列的核苷酸取代。因此，当拥有基因的核苷酸序列和编码蛋白的氨基酸序列二者时，本领域技术人员将容易地识别编码具有相同氨基酸序列的相同蛋白的简并。
在第三个方面，本发明提供包含根据本发明的核酸的表达盒。将所述表达盒置于引起本发明多肽表达的条件下。
表达盒还可包含其表达所必需的序列，例如与表达系统相容的启动子、增强子和终止子序列。此外，表达盒可包含间隔子序列、配体序列和合适的限制性位点。此外，表达盒还可包含编码组氨酸尾的序列。
在第四个方面，本发明提供一种包含根据本发明的核酸分子或表达盒的表达载体。所述载体可用于转化宿主细胞并允许根据本发明的核酸在所述细胞中表达。
有利地，表达载体包含能够表达核酸分子的调控元件和能够使其在根据本发明的宿主细胞中选择的元件。根据期望表达的宿主细胞选择这些元件的方法是本领域技术人员公知的并且广泛地描述于文献中。
载体可以通过本领域技术人员公知的经典分子生物学技术构建。适合在宿主细胞中表达的表达载体的非限制性实例是质粒以及病毒或细菌载体。
在第五个方面，本发明提供使用本发明的核酸、表达盒或载体瞬时或稳定转化/转染的宿主细胞。核酸分子、表达盒或载体可以以附加体的形式或染色体的形式包含在细胞中。
宿主细胞可以是细菌细胞、酵母、丝状真菌、原生动物、昆虫、动物和植物细胞。
在第六个方面，本发明提供一种用于生产本发明嵌合蛋白的方法，包括以下步骤：用包含所述核酸分子或表达盒的表达载体转化宿主细胞，培养所述宿主细胞以用于嵌合蛋白(体内表达系统)的生产；从所述细胞或从所述细胞周围的培养基中分离所述嵌合蛋白。
特别合适的表达系统包括微生物，例如用噬菌体、质粒或粘粒的重组DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV[花椰菜花叶病毒]；烟草花叶病毒、TMV[烟草花叶病毒])或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统或动物细胞系统。也可以使用无细胞翻译系统来产生本发明的多肽。
将编码本发明的重组或合成蛋白的核酸分子、表达盒或载体引入宿主细胞可以通过许多标准实验室手册例如Davis等人Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989)中描述的方法来完成。
在一个优选的方面，本发明的不同重组蛋白的表达是使用产生的嵌合构建体的质粒DNA进行的，该质粒DNA被转化到大肠杆菌细胞中，在重组蛋白的生长和表达期后，将来自表达不同蛋白的细胞的总细菌提取物在SDS-PAGE凝胶上分级(见图3)。
然后将上述转化或转染的宿主细胞在合适的营养培养基中在允许本发明的重组蛋白表达的有利条件下生长。用于培养细胞的培养基可以是任何适合培养宿主细胞的常规培养基，例如含有适当补充剂的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可从商业供应商处获得，或者可以根据公开的配方(prescription)(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。由细胞产生的本发明的蛋白然后可以通过常规程序从细胞或培养基中回收，所述常规程序包括通过离心或过滤将宿主细胞与培养基分离，使用盐例如硫酸铵从上清液或滤液中沉淀含水蛋白级分，通过各种色谱方法例如离子交换色谱、排阻色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱或相似的方法纯化，这取决于所讨论的多肽的类型。
然后使用例如生物化学领域常用的方法，例如HPLC、SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹、pH梯度等电聚焦、圆二色性，来纯化和生化表征获得的嵌合蛋白。通过这些方法，可以确定特征例如嵌合蛋白的表达产量；二级结构特征的确定，以及特征的确定对开发内脏利什曼病诊断组合物重要的其他特征等。
在一种模式中，用本发明的核酸分子转化宿主细胞是通过表达载体完成的。在具体的模式中，载体是pRSETa，转化的宿主细胞是E.coli RosettaTM2。表1显示由获得的不同嵌合基因编码的各重组蛋白的预期分子量。在四种评价的构建体中，只有Q1SX(SEQ ID NO:5)和Q5构建体(SEQ ID NO:7)允许在总细菌提取物中表达清晰可辨的条带。
步骤(b)中指示的宿主细胞培养条件是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，在抗生素存在下在LB培养基中在搅拌下进行培养。在具体的培养中，抗生素是氨苄青霉素和氯霉素。培养可以在不同的温度下进行不同的时间。在具体的模式中，可以在约35℃至约37℃的温度下进行培养约4至约6小时。在优选的实施方案中，在搅拌下在37℃下进行培养6小时。
步骤(b)中提到的嵌合蛋白的生产可以用本领域已知的任何技术进行。在一个实施方案中，在获得足够的光密度后，通过向培养基中加入IPTG来实现本发明嵌合蛋白表达的诱导。
为了证实Q1蛋白的各种截短体的表达，然后对各自的细菌提取物进行蛋白质免疫印迹分析，其中评价通过针对每种蛋白中存在的多组氨酸序列的商业单克隆抗体对这些蛋白的识别。
如图4所示，所有三种Q1蛋白构建体都被单克隆抗体识别，证实了它们的表达，而Q1SX(SEQ ID NO:5)的表达水平高于其它的表达水平，与其在SDS-PAGE凝胶上的可视化相容。
同样，针对多组氨酸序列的商业抗体也识别Q5蛋白(SEQ ID NO:8)。根据表达分析，扩增表达Q1SX和Q5蛋白的大肠杆菌培养物以大规模表达这些蛋白，并通过镍树脂上的亲和色谱进行纯化。图5显示Q1SX和Q5蛋白纯化的代表性SDS-PAGE凝胶。
纯化的Q1SX和Q5蛋白通过与SDS-PAGE上确定量的BSA进行比较来定量，并用于ELISA测定，旨在评价它们在人和犬类VL诊断中的潜力。然后用来自证实感染婴儿利什曼原虫的个体的人血清、来自健康对照的血清、来自证实VL感染狗的血清及其各自的健康对照评价各蛋白。
步骤(c)中提到的嵌合蛋白的分离可以用本领域已知的任何技术进行。在一个实施方案中，通过色谱技术实现纯化。在一个具体实施方案中，纯化通过镍树脂亲和色谱进行。非限制性实例包括亲和色谱法、离子交换、其他亲和或吸附方法、离子对、反相、和分子排阻。
在第七个方面，本发明提供一种组合物，其包含一种或多种根据本发明的嵌合蛋白。
在一个特定方面，该组合物用作用于内脏利什曼病诊断的试剂。
在第八个方面，本发明提供一种内脏利什曼病诊断试剂盒，其包含一种或多种嵌合蛋白或本发明限定的组合物。
任选地，该试剂盒还包括使用说明。
此外，该试剂盒还可以包括用于检测抗原/抗体复合物的装置，其可以包括能够产生可检测信号的信号发生器。
检测装置可以是本技术中已知的那些。检测装置的非限制性实例可以是由与能够产生可检测信号的信号发生化合物偶联的抗体组成的缀合物。
在第九个方面，本发明提供所述嵌合蛋白在内脏利什曼病诊断中的用途。
在第十个方面，本发明提供一种诊断内脏利什曼病的方法，包括通过使用免疫学检测技术从人或狗血清样品中检测嵌合蛋白/抗体复合物。
本发明的嵌合蛋白的评价已经证明，从利用人和狗的血清的嵌合蛋白Q1的ELISA结果来看，如图6所示，它对人血清具有(76％)的敏感性和(100％)的特异性，然而，狗血清的结果显示(99％)的敏感性和(100％)的特异性。
Q5嵌合蛋白的ELISA结果显示对人血清的敏感性为81％，而狗血清的结果保持99％的敏感性(图7)。
基于对Q5蛋白获得的最佳结果，将所述蛋白用于新的ELISA测定以评价其与来自外皮利什曼病患者的血清的交叉识别。这些血清的结果显示8％的非特异性反应(图8)。
然后评价来自共感染VL和HIV的患者的血清，显示98％的敏感性和100％的特异性(如图9所示)并且仅对HIV阳性患者没有反应。表2显示使用Q5和Q1SX蛋白的上述组的所有血清的分析结果，显示评价的血清的敏感性、特异性和血清量。
表2
Q1和Q5蛋白的ELISA结果显示各试验组中使用的血清量以及各组中显示的敏感性和特异性。分为狗和人。还检测了阴性血清以计算各值。
实施例
实施例1
嵌合基因的生物信息学方法、化学合成和亚克隆
所选蛋白(Lci2、Lci3和Lci12)序列中线性B细胞表位的存在的预测通过程序BCPred12进行(EL-MANZALAWY；DOBBS；HONAVAR,2008)。使用Gendesigner程序(WELCH等人,2011)设计了为在大肠杆菌中表达而优化的嵌合基因序列，并由GenScript公司(GenScript,Piscataway,New Jersey,USA)(Q1蛋白)和Thermo(Life Tech,Paulo,Brazil)(Q5蛋白)进行商业合成。
这些基因已被克隆到商业载体pUC57中，侧翼是酶XbaI/HindIII的限制性位点。为了亚克隆到细菌表达载体pRSETa(Thermo Life Tech,Paulo,Brazil)，嵌合基因通过用限制性酶XbaI/HindIII双重消化回收，并亚克隆到pRSETa载体的相同位点。
在将Q1基因第一次亚克隆到pRSETa载体之后，进行该基因的两个截短反应。第一个反应是用酶NcoI消化，引起编码pSS-gIII肽的片段切除，第二个反应是用SalI/XhoI酶对，切除编码Lci13蛋白C末端区域的片段。所有最终构建体通过限制性酶消化和测序来确认。
实施例2
重组蛋白的表达和纯化
为了表达嵌合蛋白，将源自pRSETa载体的质粒构建体转化到感受态E.coliRosettaTM2细胞(Merck Millipore)，然后在37℃下在补充氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的固体LB培养基(Luria Bertani)上选择。
转化细胞的克隆在具有相同浓度抗生素的液体LB培养基中生长，并通过添加IPTG至终浓度为0.1mM、在600nm处光密度(D.O)为0.6至0.8来诱导重组蛋白的表达。
在用考马斯蓝R-250染色凝胶后，使用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE 15％)使结果可视化。为了获得重组蛋白，将诱导后获得的细胞沉淀重悬在20mL裂解缓冲液中并平衡(100mM磷酸钠，10mM Tris，8M尿素，20mM咪唑-pH8.0)并通过在4℃下以1分钟间隔、分5次脉冲30秒来超声溶解。
在5000rpm离心10分钟后，通过与Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)孵育，然后在相同缓冲液和在pH6.0的变性缓冲液(100mM磷酸钠，10mM Tris，8M尿素、30mM咪唑)中洗涤，并在pH4.5的变性缓冲液中以1M咪唑洗脱。如所述在SDS-PAGE凝胶上评价等分试样。
实施例3
蛋白质免疫印迹分析
对于蛋白质免疫印迹分析，嵌合蛋白在15％SDS-PAGE凝胶上分级并转移至PVDF膜(Immobilon-P)，在补充有5％脱脂牛奶和1％Tween-20的TBS缓冲液(20mMTris，500mM NaCl，pH7.5)中封闭。
然后将膜与针对靶蛋白的抗体/血清以1:3000和1:1000的最终稀释度在含有5％牛奶和1％Tween-20的TBS缓冲液中孵育。用1％TBS/Tween-20洗涤后，用过氧化物酶标记的兔抗IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories)进行新的孵育，在含有5％牛奶和1％Tween-20的TBS缓冲液中按1:10000稀释。
进一步洗涤后，将膜暴露在1.2mM鲁米诺、0.4mM碘苯酚和0.03％过氧化氢的溶液中2分钟。然后将这些膜干燥并暴露于放射自显影胶片1和5分钟，然后使胶片显影。
实施例4
使用的人血清
最初，组装由两个不同血清组组成的一组人血清。第一组由获自为黄热病疫苗项目设立的IAM病毒学和实验治疗实验室(LAVITE)血清库中对照组的50份血清组成。这些血清来自生活在内脏利什曼病非流行区(累西腓市的市区)的健康个体，由Rafael Dhália博士友情提供。
第二组由来自具有临床和实验室诊断(通过寄生虫学检查确认)的内脏利什曼病患者的50份血清组成。该信息由来自皮奥伊联邦大学(the Federal University of Piauí)的Carlos Henrique Costa博士友情提供。
如下所述，所有人血清在批准使用后由适当的伦理委员会收集：来自皮奥伊联邦大学的伦理委员会(the ethics committee of the Federal University of Piauí)(0116/2005)批准使用来自VL患者的血清；阴性对照的血清被纳入卫生部伦理委员会(theethics committee of the Ministry of Health)批准的研究(25000.119007/2002-03)。
还使用来自皮肤利什曼病患者的血清，包括在项目CAEE0014.0.095.000-05中，经CPqAM-FIOCRUZ伦理委员会批准(03/08/2008)。
最后，Zulma Medeiros博士提供来自Centro de Pesquisas Aggeu伦理委员会-FIOCRUZ批准的项目(CAEE:53495816.0.0000.5190)的合并共感染(HIV/VL)患者的血清和仅HIV感染患者的血清，也在本方案中进行了评价。
实施例5
使用狗血清
对来自Jequié-BA的内脏利什曼病流行区的大约一百只驯养或流浪狗进行研究。
收集血样，并从那里获得血清的等分试样并储存在-20℃。对于这些动物中的一些，根据之前描述的方法(BARROUIN-MELO等人,2006)，进行脾脏的抽吸穿刺并且抽吸物用于培养和检测利什曼原虫。
我们还使用来自与Valéria Pereira博士合作提供的患VL的狗的90份血清。所有的狗都根据奥斯瓦道·克鲁兹基金会(Oswaldo Cruz Foundation)的动物实验指南进行处理。
本研究狗血清的使用得到动物使用伦理委员会(the Ethics Committee onAnimal Use)的批准(CPqGM-FIOCRUZ,Ceua,协议N.040/2005和CPqAM-FIOCRUZ,Ceua,协议27/2016)。
实施例6
间接酶免疫分析
定量后，将重组蛋白用于微量滴定板的致敏，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(NaCO3，0.05M；pH9.6)中稀释到浓度为400ng(婴儿利什曼原虫寄生虫的总提取物为1μg，用作反应对照)每孔，每孔体积为100μl，并在4℃的潮湿室中保持16小时。
在用PBS(NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 10mM，KH2PO4 1.8mM)洗涤后，用PBS加10％脱脂牛奶进行封闭，然后用PBS加0.05％Tween-20进一步洗涤。然后用人和犬类血清进行孵育，分别以1:2500和1:900的稀释度在含有10％牛奶的PBS Tween-20中稀释。
用缀合物--过氧化物酶连接的抗人IgG或抗犬IgG再次进行洗涤和孵育步骤后，在室温下在潮湿室中分别以1:10000和1:1200的稀释度进行1小时。
进一步洗涤后，在暗室中在0.01％浓度(300μl)的色原OPD(邻苯二胺)和过氧化氢(以4％浓度，3μl)的存在下在柠檬酸-磷酸盐缓冲液(Na2HPO4、C6H8O7、0.1M、pH:5.0)中反应30分钟进行显影，然后用硫酸(2.5M的H2SO4)终止反应。读数是在Benchmark PlusMicroplate Manager 5.2(BIO-RAD)中的490nm滤器中进行的。
实施例7
间接ELISA结果的统计分析
使用MedCalc软件(版本12.3)(MedCalc Software,Ostend,Belgium)估计敏感性、特异性、阳性和阴性预测值和置信区间的参数。
对于变量与其决定因素之间的关联，卡方检验用于与疾病诊断和试验结果相关的复式表(2x2)中。
敏感性由已知患病个体(阳性寄生虫)中通过试验检测到的阳性百分比给出，特异性由非疾病个体中的阴性百分比给出。
使用GraphPad Prism软件(GraphPad Prism version 6.00for Windows,GraphPad Software,La Jolla California USA)获得散点图。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种嵌合蛋白，其特征在于，包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8组成的组的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
2.核酸分子，其特征在于，包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7及其编码分别由SEQ ID NO:2、4、6或8所限定的相同氨基酸序列的简并序列组成的组的序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，进一步包含：
抗原区域之间的间隔区，
在合成基因的5'末端以及编码蛋白末端的区域的优化序列，例如：pRBS-SD1+6AA，
核糖体结合位点和Shine-Dalgarno序列，
pSS-gIII，
t7标签肽，
ET-6His；或
翻译终止密码子；
或这些的组合。
4.表达盒，其特征在于，包含可操作地连接至启动子和转录终止子的、序列选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7及其简并序列组成的组的核酸分子。
5.表达载体，其特征在于，包含序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7及其简并序列组成的组的核酸分子，或如权利要求4所限定的表达盒。
6.宿主细胞，其特征在于，包含序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7及其简并序列组成的组的核酸分子，或如权利要求4所限定的表达盒，或如权利要求5所限定的表达载体。
7.用于生产嵌合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)用包含序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7及其简并序列组成的组的核酸分子的表达载体转化宿主细胞，
(b)培养所述宿主细胞以生产嵌合蛋白；和
(c)从所述细胞或从所述细胞周围的培养基中分离所述嵌合蛋白。
8.用于诊断利什曼病的组合物，其特征在于，包含一种或多种如权利要求1所限定的嵌合蛋白。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述诊断仍然可以对来自狗或人的样品进行。
10.用于诊断内脏利什曼病的试剂盒，其特征在于，包含一种或多种如权利要求1所限定的嵌合蛋白或如权利要求8所限定的组合物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，还包括使用说明。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测抗原/抗体复合物的装置，所述装置可以包括能够产生可检测信号的信号发生器。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述诊断可以对来自狗或人的样品进行。
14.一种或多种如权利要求1所限定的嵌合蛋白、如权利要求8或9所限定的组合物、或如权利要求10至13中任一项所限定的试剂盒的用途，其特征在于，其用于诊断利什曼病。
15.体外诊断利什曼病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供一种或多种如权利要求1所限定的嵌合蛋白或如权利要求8或9所限定的组合物以及人或狗血清样品，
(b)在足以形成抗体/抗原复合物的条件下将所述一种或多种嵌合蛋白或所述组合物与待测生物样品接触足够的时间；和
(c)通过能够在该抗原/抗体复合物的存在下产生可检测信号的检测技术检测在前一步骤中形成的嵌合蛋白/抗体复合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自包括唾液、尿液、血清或血液的组。
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