利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法
阅读说明：本技术 利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法 (Method for producing recombinant human-like collagen and host cell protein by using pichia pastoris ) 是由 郝东 王俊 何华斌 周浩 魏文培 宗奕珊 侯增淼 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法,利用菌株Pichia pastoris-col3-6于发酵培养过程中进行甲醇诱导,获得的发酵液经离心、过滤除菌、超滤脱盐浓缩、离子交换层析和超滤脱盐、冻干,得到重组类人胶原蛋白和目标宿主蛋白,本发明在保持发酵生产重组类人胶原蛋白的高产率、高收率及高纯度的同时,解决了工业化大规模生产毕赤酵母表达的重组类人胶原蛋白的高成本问题。(The invention discloses a method for producing recombinant human-like collagen and host cell protein by using Pichia pastoris, wherein a strain Pichia pastoris-col3-6 is used for carrying out methanol induction in the fermentation culture process, and the obtained fermentation liquor is subjected to centrifugation, filtration sterilization, ultrafiltration desalination concentration, ion exchange chromatography, ultrafiltration desalination and freeze-drying to obtain the recombinant human-like collagen and target host protein.)
技术领域
本发明属于蛋白工程技术领域，具体涉及毕赤酵母表达的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的分离纯化方法。
背景技术
胶原蛋白是体内含量最多的一种蛋白质，约占人体蛋白质的25％～33％，其广泛分布于人体各个组织器官，如皮肤、骨骼、角膜、血管等，尤其在皮肤等组织中，含有大量的胶原蛋白，胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能具有重要作用。重组胶原蛋白以其低毒性、低抗原性、低免疫性、能引导细胞再生和生物相容性较好等优点，而广泛应用于生物医药、化妆品、食品等行业中。
蛋白Maker采用多种经纯化的已知分子量蛋白质制成，被广泛应用于生物学实验中用以监控其它蛋白质在凝胶电泳中的迁移，并识别这些蛋白质的分子量大小。毕赤酵母自身表达的宿主细胞蛋白性质稳定，可以作为蛋白Maker的潜在原料。
目前毕赤酵母表达的重组类人胶原蛋白在纯化过程中，因设备、人员及生产运行的投入，导致重组类人胶原蛋白生产成本较高。同时，对生产过程中毕赤酵母表达的宿主细胞蛋白未能有效利用(原因包括宿主细胞蛋白在发酵液中的含量有限，通常被当作纯化中的杂质进行处理，例如，中国专利CN108027032A)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，包括以下步骤：
将毕赤酵母发酵液中的菌体细胞分离去除后进行超滤，将超滤产物进行离子交换层析，分别得到毕赤酵母发酵产生的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白。
优选的，所述毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法具体包括以下步骤：
1)将毕赤酵母发酵液离心，将离心所得上清液依次进行过滤除菌、超滤脱盐，将经超滤脱盐得到的含有重组类人胶原蛋白的浓缩液与超滤系统的残留蛋白(成分包括宿主细胞蛋白)回收液混合，得到混合料液；
2)通过离子交换层析将混合料液中的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白分离。
优选的，所述毕赤酵母选自野生型或突变型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌。
优选的，所述毕赤酵母选自菌株Pichia pastoris-col3-6(属于基因工程菌)，该菌株的保藏编号为CGMCC No.20458，所述菌株经发酵产生的发酵液蛋白成分包括分子量为91.3KD的重组类人胶原蛋白和分子量为65KD的宿主细胞蛋白。
优选的，所述毕赤酵母发酵液的制备方法包括以下步骤：将毕赤酵母于发酵培养基中进行培养和重组类人胶原蛋白的诱导表达，得到毕赤酵母发酵液。
优选的，所述毕赤酵母发酵液的制备方法具体包括以下步骤：将接种于发酵培养基的毕赤酵母培养至达到一定菌体密度，在后续培养中通过将发酵培养基的碳源替换为甲醇进行甲醇诱导，培养条件包括：pH4.8～5.2、温度25～30℃，及溶氧控制在30％。
优选的，所述超滤脱盐采用6～15KD超滤膜，所述浓缩液的电导率低于1ms/cm；所述回收液是利用纯化水循环回收超滤系统残留蛋白而得到。
优选的，所述离子交换层析采用的离子交换柱填料选自以琼脂糖凝胶为基质的弱阳离子交换剂。
优选的，所述步骤2)具体包括以下步骤：用氢氧化钠调节混合料液的pH值至 6.0～6.5，得到离子交换层析原液，用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠调节离子交换层析原液的 pH值为6.0～6.5后进行上样；上样结束后，先以pH值为6.0～6.5、含有0.04～0.06mol/L NaCl的8～10mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液洗脱宿主细胞蛋白，再以pH值为6.0～6.5、含有0.08～0.1mol/L NaCl的8～10mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗杂液进行洗脱，最后以pH 值为6.0～6.5、含有0.3～0.4mol/L NaCl的8～10mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液洗脱重组类人胶原蛋白。
优选的，所述毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法还包括以下步骤：经过步骤2)后，将经过洗脱得到的重组类人胶原蛋白溶液及宿主细胞蛋白溶液分别采用6～15KD超滤膜进行超滤脱盐，然后进行真空冷冻干燥，得到重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白。
本发明的有益效果体现在：
本发明在分离纯化毕赤酵母发酵液中的重组类人胶原蛋白过程中，不添加其他工艺手段，即可同时获取高纯度宿主细胞蛋白，以副产品(宿主细胞蛋白可作为蛋白Marker)产生的价值大幅度降低重组类人胶原蛋白的生产成本，适用于工业化大规模生产。本发明在保持发酵生产重组类人胶原蛋白的高产率、高收率及高纯度的同时，解决了工业化大规模生产毕赤酵母表达的重组类人胶原蛋白的高成本问题。
进一步的，本发明采用的毕赤酵母菌株Pichia pastoris-col3-6不仅可以稳定的发酵生产重组类人胶原蛋白，而且与其它已知的毕赤酵母菌株相比，可以在发酵中产生含量较高的宿主细胞蛋白。
进一步的，本发明通过控制超滤膜的分子截留量，可以降低浓缩液电导率，提高重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的稳定性和分离效率。
进一步的，本发明经一步离子交换层析即可同时获取两种高纯度蛋白质，其中重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的回收率均达到70％以上，纯度均达95％以上。同时，经离子交换层析两种蛋白质均完全脱色，适合于工业化大规模生产。
进一步的，本发明纯化过程中使用的液体试剂均采用无机盐配制，成分简单、价格低廉。
附图说明
图1为重组类人胶原蛋白结构设计图：其中含1011个氨基酸的蛋白序列全长、理论分子量(MW)及等电点(PI)。
图2为菌株Pichia pastoris-col3-6的发酵液纯化产物SDS-PAGE电泳检测图；其中，泳道1：蛋白Marker，泳道2：重组类人胶原蛋白(115KD，与理论分子量相比，电泳表征误差导致电泳图中分子量偏高)，泳道3：目标宿主蛋白(65KD)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)发酵菌种获取
本发明基于前期载体、基因工程菌种构建(载体转化的毕赤酵母宿主菌为GS115)及发酵测试实验，获得了一株可发酵生产重组类人胶原蛋白和目标宿主蛋白(65KD宿主细胞蛋白)的毕赤酵母菌种(记为菌株Pichia pastoris-col3-6)。所述重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如图1所示。
上述菌株Pichia pastoris-col3-6已于2020年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号)，保藏编号为CGMCC No.20458，分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
(二)发酵和蛋白纯化
本发明将菌种于发酵培养过程中进行重组类人胶原蛋白的诱导表达，获得的发酵液经离心并收集离心所得上清液后进行过滤除菌、超滤脱盐浓缩、离子交换层析和超滤脱盐、冻干，得到重组类人胶原蛋白和目标宿主蛋白，具体步骤如下：
1)菌种(菌株Pichia pastoris-col3-6)经培养和诱导表达后出罐，将出罐后的发酵液利用大容量冷冻离心机离心去除菌体，收集上清液；
其中，培养和诱导表达条件为：以无机盐BSM培养基作为底料，使用10L发酵罐进行发酵(pH5.0、温度29.0℃，且溶氧控制在30％左右)，在底料中甘油消耗完毕(通常此时菌体湿重应达到180～210mg/mL)后通过流加甲醇诱导40～50小时，即可出罐；
2)将上清液经0.22μm中空纤维膜过滤去除残留菌体及机械杂质，收集滤出液；
3)将滤出液经10KD超滤膜超滤脱盐至电导率低于1ms/cm，体积浓缩至0.5L左右，得浓缩液，用300mL纯化水循环回收超滤系统残留蛋白，得回收液，充分混合浓缩液和回收液后用稀氢氧化钠溶液调节混合料液的pH值至6.4，作为离子交换层析原液备用；
4)将原液进行离子交换层析纯化(离子交换柱填料为CM Sepharose FF)：以pH 值为6.4的10mmol/L磷酸盐缓冲液中的缓冲对(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠)，将离子交换层析原液的pH值调节至6.4作为上样液，上样结束后，先用10倍柱体积pH值为6.4 的洗脱液(具体为含有0.06mol/L氯化钠的pH为6.4的10mmol/L的磷酸盐缓冲液)洗脱，收集洗脱组分为目标宿主蛋白的溶液，再用10倍柱体积的pH值为6.4的洗杂液(具体为含有0.08mol/L氯化钠的pH为6.4的10mmol/L的磷酸盐缓冲液)洗脱，最后用 10倍柱体积的pH值为6.4的洗脱液(具体为含有0.3mol/L氯化钠的pH为6.4的 10mmol/L的磷酸盐缓冲液)洗脱，收集洗脱组分为重组类人胶原蛋白的溶液；
5)用10KD的超滤膜对离子交换层析收集的重组类人胶原蛋白溶液和目标宿主蛋白溶液分别进行超滤脱盐并浓缩；
6)将步骤5)得到的浓缩液分别真空冷冻干燥，得到重组类人胶原蛋白(图2，115KD) 和目标宿主蛋白(图2，65KD)。
经检测，本发明纯化获得重组类人胶原蛋白的回收率达到70％以上，纯度达到95％以上，目标宿主蛋白的回收率达到70％以上，纯度达到95％以上。利用双缩脲法测定纯化之后的蛋白浓度，结果表明菌株Pichia pastoris-col3-6的重组类人胶原蛋白表达量可达到4.8g/L，尽管目标宿主蛋白的表达量低于重组类人胶原蛋白，但与GS115发酵产物相比目标宿主蛋白的表达提高了1g/L。
总之，与现有纯化方法相比，本发明成本低、工艺简单，获得的纯品蛋白完全脱色，适合于工业化大规模生产。
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