一种抗菌肽饲料添加剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种抗菌肽饲料添加剂及其制备方法 (Antibacterial peptide feed additive and preparation method thereof ) 是由 梁键钧 胡浩 王婵尤 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于饲料领域,公开了一种抗菌肽饲料添加剂及其制备方法。所述抗菌肽饲料添加剂,包括以下组分：蛙皮素、果蝇抗菌肽、大豆油、增稠剂、表面活性剂、水。所述抗菌肽饲料添加剂的制备方法,包括以下步骤：(1)将蛙皮素、果蝇抗菌肽和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中,搅拌,制得抗菌肽饲料添加剂。所述抗菌肽饲料添加剂具有很好的稳定性,且抗菌性能优良,尤其适用于作为水产养殖饲料的饲料添加剂。(The invention belongs to the field of feeds, and discloses an antibacterial peptide feed additive and a preparation method thereof. The antibacterial peptide feed additive comprises the following components: bombesin, drosophila melanogaster antibacterial peptide, soybean oil, a thickening agent, a surfactant and water. The preparation method of the antibacterial peptide feed additive comprises the following steps: (1) adding bombesin, drosophila melanogaster antibacterial peptide and thickening agent into water to obtain water phase; mixing soybean oil with a surfactant to obtain an oil phase; (2) and (2) adding the water phase prepared in the step (1) into the oil phase, and stirring to prepare the antibacterial peptide feed additive. The antibacterial peptide feed additive has good stability and excellent antibacterial performance, and is particularly suitable for being used as a feed additive of aquaculture feed.)
技术领域
本发明属于饲料领域，特别涉及一种抗菌肽饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
抗菌肽(antin icrobal peptides)是具有抗菌活性短肽的总称。这类活性肽多数具有强碱性，热稳定性及广谱抗菌等特点。不同抗菌肽在肽链长度、序列组成以及生化结构上都有显著差异，但通常具备两个共同特点：一是抗菌肽属于阳离子多肽；二是抗菌肽具有两亲性结构(亲水性和亲油性)。科学家已相继从细菌，真菌，两栖类，昆虫，植物，哺乳动物和人体内发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。抗菌肽主要包括抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤和增强免疫功能等作用。
在当今水产养殖领域，抗生素的大量使用带来了一系列的不良影响，因此将抗菌肽作为抗生物的替代物正成为行业内追逐的热点。抗菌肽替代抗生素的研究是近几年才发展起来的，虽然取得了一定进展，但还处于探索阶段，距离技术成熟、大规模生产和应用到动物养殖中还有很多需要解决的问题。一是抗菌肽的种类很多，哪些种类作为饲料添加剂时效果好，又比较经济。二是不同种类的抗菌肽之间的相互作用情况。三是抗菌肽在动物体内的含量较少，天然资源匮乏，化学合成的成本太高，目前还无法实现规模化生产；需要从基因工程技术方法方面研究如何大规模生产抗菌肽。四是抗菌肽在动物体内容易被蛋白酶水解，不够稳定，难以到达肠道而被肠道上皮细胞所吸收。
针对上述抗菌肽在饲料领域中所面临的困难，希望提供一种稳定且抗菌性能良好的抗菌肽饲料添加剂。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗菌肽饲料添加剂及其制备方法，所述抗菌肽饲料添加剂具有很好的稳定性，且抗菌性能优良，尤其适用于作为水产养殖饲料的饲料添加剂。
一种抗菌肽饲料添加剂，包括以下组分：蛙皮素、果蝇抗菌肽、大豆油、增稠剂、表面活性剂、水。
本发明在前期实验中发现蛙皮素这类通常用于抗寄生虫、抗肿瘤的抗菌肽运用于水产动物尤其是加州鲈鱼的养殖中，却呈现出较好的抗细菌和抗真菌效果。并且将蛙皮素与果蝇抗菌肽配合使用，能取得比单一抗菌肽更好的抗菌效果，使得加州鲈鱼的养殖在未使用抗生素的条件下也能大大减少疾病的发生，提高成活率。同时，考虑到抗菌肽容易被消化道中的酶降解导致的稳定性差的情况，本发明对抗菌肽进行有效包覆的方面展开研究，采用大豆油、增稠剂、表面活性剂对抗菌肽进行包覆，从而提高了抗菌肽在饲料中和动物消化道中的稳定性。
优选的，按重量份数计，所述抗菌肽饲料添加剂包括以下组分：
更优选的，蛙皮素与果蝇抗菌肽的重量比为1：(0.2-0.4)。实验表明，当蛙皮素与果蝇抗菌肽采用上述重量用量比时，能够取得更佳的抗菌效果。
优选的，所述增稠剂选自果胶、黄原胶、卡拉胶、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠中的至少一种。
优选的，所述表面活性剂选自甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、乙酸甘油酯、酒石酸甘油酯、柠檬酸酯或聚甘油脂肪酸酯中的至少一种。
为保证所述抗菌肽饲料添加剂的安全性，所选用的增稠剂和表面活性剂均为无毒性的可食用组分。
上述抗菌肽饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蛙皮素、果蝇抗菌肽和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；
(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中，搅拌，制得抗菌肽饲料添加剂。
通过上述方法所制得的抗菌肽饲料添加剂为油包水结构，将所述抗菌肽饲料添加剂加入至水产饲料中，也能起到一定的粘合作用，不易使水产饲料发生溃散导致抗菌肽溶于养殖水体中。
优选的，步骤(2)中搅拌的转速为500-800r/min，搅拌的时间25-40min。
一种加州鲈鱼饲料，包括所述抗菌肽饲料添加剂。
优选的，所述抗菌肽饲料添加剂在加州鲈鱼饲料中所占质量分数为1-2.5％。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明发现通过将蛙皮素与果蝇抗菌肽这两种抗菌肽配合使用制得的抗菌肽饲料添加剂，可有效增强水产动物尤其是加州鲈鱼的免疫抵抗力，大大减少疾病的发生。所述抗菌肽饲料添加剂在饲料中的添加可基本替代抗生素的使用，有效控制了抗生素滥用所带来的危害。
同时，该项目的研究成果表明采用大豆油，并通过添加适当量的增稠剂和表面活性剂，可实现对抗菌肽的良好包裹，减少动物体内消化酶对抗菌肽的降解，使其充分发挥功效。因此本司对抗菌肽的包裹技术的相关研究对抗菌肽在水产饲料领域的应用提供了一定的参考。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种抗菌肽饲料添加剂，按重量份数计，包括以下组分：蛙皮素2份，果蝇抗菌肽1份，大豆油3份，增稠剂(羧甲基纤维素钠)2份，表面活性剂(甘油脂肪酸酯)6份，水8份。
本实施例中抗菌肽饲料添加剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将蛙皮素、果蝇抗菌肽和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；
(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中，以800r/min的速度搅拌25min，制得抗菌肽饲料添加剂。
实施例2
本实施例提供一种抗菌肽饲料添加剂，按重量份数计，包括以下组分：蛙皮素3份，果蝇抗菌肽0.5份，大豆油2份，增稠剂(海藻酸钠)2份，表面活性剂(柠檬酸酯)6份，水10份。
本实施例中抗菌肽饲料添加剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将蛙皮素、果蝇抗菌肽和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；
(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中，以500r/min的速度搅拌40min，制得抗菌肽饲料添加剂。
实施例3
本实施例提供一种抗菌肽饲料添加剂，按重量份数计，包括以下组分：蛙皮素4份，果蝇抗菌肽1份，大豆油4份，增稠剂(卡拉胶)3份，表面活性剂(酒石酸甘油酯)6份，水14份。
本实施例中抗菌肽饲料添加剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将蛙皮素、果蝇抗菌肽和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；
(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中，以600r/min的速度搅拌30min，制得抗菌肽饲料添加剂。
对比例1
本对比例提供一种抗菌肽饲料添加剂，按重量份数计，包括以下组分：蛙皮素4份，果蝇抗菌肽1份。
本对比例中抗菌肽饲料添加剂的制备方法，具体包括以下步骤：将蛙皮素与果蝇抗菌肽混合，得到抗菌肽饲料添加剂。
对比例2
本对比例提供一种抗菌肽饲料添加剂，按重量份数计，包括以下组分：蛙皮素5份，大豆油4份，增稠剂(卡拉胶)3份，表面活性剂(酒石酸甘油酯)6份，水14份。
本对比例中抗菌肽饲料添加剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将蛙皮素和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；
(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中，以600r/min的速度搅拌30min，制得抗菌肽饲料添加剂。
对比例3
本对比例提供一种抗菌肽饲料添加剂，按重量份数计，包括以下组分：果蝇抗菌肽5份，大豆油4份，增稠剂(卡拉胶)3份，表面活性剂(酒石酸甘油酯)6份，水14份。
本对比例中抗菌肽饲料添加剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将果蝇抗菌肽和增稠剂加入水中得到水相；将大豆油与表面活性剂混合得到油相；
(2)将步骤(1)制得的水相加入至油相中，以600r/min的速度搅拌30min，制得抗菌肽饲料添加剂。
产品效果测试
有资料显示，加州鲈鱼肠道内的蛋白酶活性最高，且肠道蛋白酶最适pH值约为8。因而本发明选用碱性蛋白酶代替加州鲈鱼的肠道蛋白酶进行体外蛋白水解试验，水解度(DH)是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其中碱性蛋白酶的浓度为3％，水解温度为50℃，水解时间为6小时，pH值控制至8-8.5。水解完成后用OPA(邻苯二甲醛)法测定实施例1-3和对比例3的抗菌肽饲料添加剂的蛋白水解度，OPA(邻苯二甲醛)法的测定原理是邻苯二甲醛在β-巯基乙醇的存在下会和自由α-氨基形成黄色化合物，其在340nm处有特征吸收，用分光光度计可检测其OD值，从而测得水解度数据，具体水解度数据如表1所示：
表1抗菌肽饲料添加剂的水解度
实施例1
实施例2
实施例3
对比例1
对比例2
对比例3
水解度
13.4％
12.7％
12.2％
32.5％
15.6％
14.3％
由表1可知，对比例1中抗菌肽饲料添加剂的水解度要远远大于实施例1-3、对比例2-3的抗菌肽饲料添加剂，表明通过在抗菌肽的基础上加入大豆油，增稠剂和表面活性剂，从而对抗菌肽形成有效包裹，可降低和减少蛋白酶对抗菌肽的水解，提高抗菌肽的稳定性。
将实施例1-3、对比例1-3制得的抗菌肽饲料添加剂分别加入至鲈鱼基础饲料配方(豆饼25％、鸡肉粉10％、鱼粉25％、麸皮15％、面粉15％、鱼油6％、复合维生素2％，无机盐1％、饲料粘合剂1％)中，得到抗菌肽饲料添加剂所占质量分数为1.5％的加州鲈鱼饲料。
将上述制得的加州鲈鱼饲料对加州鲈鱼进行生长养殖试验，采用循环水养殖系统进行生长养殖试验，将市面上购买得到的生长状况基本相同的加州海鲈共600尾，随机分成6组，每组100尾鱼，在相同温度、pH的环境下和不使用任何抗生素的条件下进行生长养殖实验，持续60天；投喂方法和养殖条件均为常规方法和条件。
养殖试验结束后，测定加州鲈鱼的成活率、肝胆和肠道疾病发生率和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性，试验结果如表2所示：
表2加州鲈鱼的成活率、疾病发生率和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性
由表2可以得出：成活率、疾病发生率和超氧化物歧化酶等三个指标所显示的趋势基本保持一致。即实施例1-3效果明显强于对比例1-3；实施例3效果优于实施例1-2；对比例2效果优于对比例3，且对比例3效果优于对比例1。
虽然在实施例1-3中都是采用果蝇抗菌肽与蛙皮素进行配合使用，但相比于实施例1-2，实施例3中蛙皮素与果蝇抗菌肽的重量份数比为一种更优选的配比，因而能够产生更好的抗菌和提高免疫力的效果。
通过对比例2与对比例3进行比较可知，虽然两者所用抗菌肽的重量份数保持一致(均为5份)，但对比例2所取得的效果相比于对比例3要更好，表明将蛙皮素应用至加州鲈鱼的养殖中，可呈现出比果蝇抗菌肽更好的抗细菌和抗真菌效果。而对比例2-3与实施例1-3的比较则显示，果蝇抗菌肽与蛙皮素的配合使用能取得比单独使用明显更好的效果。
通过分析对比例1，可以得出由于对比例1的蛙皮素和果蝇抗菌肽没有进行包覆，因而稳定性较差，被加州鲈鱼摄食后被蛋白酶的水解程度较高，导致抗菌性能较差，也无法有效增强所喂养加州鲈鱼的免疫力。
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