一种钌-青蒿琥酯配合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种钌-青蒿琥酯配合物及其制备方法与应用 (Ruthenium-artesunate complex and preparation method and application thereof ) 是由 李蓉涛 陈毕纯 叶瑞绒 刘丹 陈宣钦 李洪梅 卢俊健 马秀蓉 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种钌-青蒿琥酯配合物及其制备方法与应用,钌-青蒿琥酯配合物可利用钌配合物改善细胞对青蒿琥酯的摄取,进入细胞后,钌配合物与青蒿琥酯协同发挥抗肿瘤作用,本发明研究钌-青蒿琥酯配合物的抗肿瘤活性,发现其具有良好的抗肿瘤活性,相对于传统的有机小分子来说,钌配合物具有多配位构型,可以进行不同配体的修饰,实现其与相应底物的特异性结合。(The ruthenium-artesunate complex can improve the uptake of cells to artesunate by utilizing the ruthenium complex, and after the ruthenium complex and the artesunate enter the cells, the ruthenium complex and the artesunate cooperatively play an anti-tumor role.)
技术领域
本发明涉及一种钌-青蒿琥酯配合物及其制备方法与其抗肿瘤作用，属于化学生物领域。
背景技术
钌配合物为6配位八面体构型，其独特的三维结构能够提供多样的配位模式，因此能与蛋白的三维结构空腔更好地匹配，提高金属配合物对蛋白的选择性；钌多吡啶配合物还具有丰富的光化学和光物理特性，可以方便进行细胞定位和机制研究。1980年Clarke等发现配合物Cl(NH3)5Ru(Ⅲ)对荷瘤大鼠有抗癌活性。Zassinovich等发现含有DMSO配体的cis-[RuCl2(DMSO)4]对小鼠肺癌细胞具有活性，其活性稍弱于顺铂，但其副作用较小。目前NAMI-A、KP1019两个钌配合物已成功进入临床试验。配位饱和的钌多吡啶配合物是另一类被广泛研究的具有抗癌前景的化合物。多吡啶是指具有多齿配位结构的吡啶衍生物，当其与Ru(II)配位后，能通过金属-配体电荷转移赋予配合物光致发光特性。且相关文献已报道钌多吡啶配合物通过DNA损伤和线粒体通路发挥抗肿瘤作用。Gasser等报道了一个带有羧基的钌多吡啶配合物可以特异性的靶向肿瘤细胞线粒体，其抗肿瘤活性与顺铂相当，并且能克服顺铂的耐药性。钌配合物属于离子型化合物，溶解性相比有机化合物会有所提高，对于化合物的亲水亲脂系数以及进入细胞的方式、动力学都会产生很大的影响，能改进细胞对金属配合物的摄取量和摄取模式。
青蒿琥酯是青蒿素的衍生物之一，较青蒿素有较高的抗疟活性。文献报道青蒿琥酯具有抗肿瘤活性。Chulwon等报道了青蒿琥酯能抑制小鼠慢性粒细胞白血病移植瘤模型中肿瘤细胞的生长并诱导肿瘤细胞凋亡。同时，青蒿琥酯可以有效地下调卵巢癌细胞和胶质瘤细胞中的RAD51水平(RAD51为介导癌细胞对DNA损伤剂敏感性的关键蛋白)，进一步增强DNA损伤剂对癌细胞的杀伤力。但是，青蒿琥酯片剂水溶性差，口服具有明显的首过效应和肝药酶诱导作用，生物利用度低；且青蒿琥酯粉针剂在静脉注射后血药浓度很快下降，半衰期仅30分钟左右，体内清除速率快，以上缺点限制了其在多种疾病中的应用。
金属-有机药物配合物可利用金属配合物改善细胞对小分子药物的摄取，甚至解决药物的耐药性问题。郭子健院士等报道了靶向RAD51的四价铂-青蒿琥酯配合物对BRCA突变的卵巢癌和乳腺癌均具有较强的抗肿瘤活性。刘扬中及其团队将阿司匹林键合到四价铂上合成了Asplatin，该化合物能有效克服顺铂的耐药性。钌多吡啶配合物具有较高的脂溶性，将钌多吡啶配合物与青蒿琥酯结合，可提高细胞对青蒿琥酯的摄取量。进入细胞后，钌配合物与青蒿琥酯协同发挥抗肿瘤作用。同时，钌多吡啶配合物具有光化学和光物理特性，可以方便进行细胞定位和机制研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种钌-青蒿琥酯配合物及其制备方法和作为抗肿瘤药物的应用，本发明通过以下技术方案实现上述发明目的。
本发明提供一种钌-青蒿琥酯配合物，化学式为[Ru(DIP)2bpy(4-CH3-4'-CH2OART)](PF6)2，结构如下式I所示：
本发明还提供所述钌-青蒿琥酯配合物的制备方法，具体步骤如下：
S1.将7.6729mmol DIP、3.836mmol RuCl3·nH2O和38.36mmol氯化锂置三颈烧瓶中，加入11mL N,N二甲基甲酰胺，氮气保护下153℃反应8h，反应完成后，将反应液逐滴加入到150mL冰丙酮中，之后，置于4℃冰箱过夜，抽滤，用于4℃预冷的水和丙酮交替洗涤，得到cis-[Ru(DIP)2Cl2]·2H2O；
S2.取0.3144mmol S1得到的cis-[Ru(DIP)2Cl2]·2H2O和0.3144mmol 4-羟甲基-4'-甲基-2-2'-联吡啶置于三颈烧瓶中，加入100mL体积分数75％的乙醇水溶液，氮气保护下85℃反应8h，反应完成后，将反应液充分浓缩至10mL，加入1.2576mmol六氟磷酸铵固体，超声即析出大量沉淀，抽滤，真空干燥，沉淀以乙腈/水/饱和硝酸钠溶液作为洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，得到反应中间体[Ru(DIP)2bpy(4-CH3-4'-CH2OH)](PF6)2，Ru-1；
S3.取0.1592mmol S2中得到的反应中间体与15.92mmol ART、0.2388mmol脱水剂和0.1592mmol催化剂置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL超干二氯甲烷，室温反应3天，反应结束后，反应液浓缩至5mL，然后逐滴滴加到20mL乙醚中，有大量沉淀析出，抽滤，真空干燥，得到的粗产品以二氯甲烷/甲醇溶液作为洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化得到钌-青蒿琥酯配合物[Ru(DIP)2bpy(4-CH3-4'-CH2OART)](PF6)2，Ru-2。
所述脱水剂为二环己基碳二亚胺。
所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
所述乙腈/水/饱和硝酸钠溶液是将乙腈、水、饱和硝酸钠溶液按照体积比100:9:1混合得到。
所述二氯甲烷/甲醇溶液是将二氯甲烷、甲醇按照体积比60:1混合得到。
本发明所述DIP为红菲啰啉；4-羟甲基-4'-甲基-2-2'-联吡啶为bpy(4-CH3-4'-CH2OH)；Ru-1为反应中间体；Ru-2为钌-青蒿琥酯配合物；ART为青蒿琥酯。
本发明还提供钌-青蒿琥酯配合物在制备抗肿瘤药物中的应用，研究发现钌-青蒿琥酯配合物有良好的抗肿瘤活性。
本发明的钌-青蒿琥酯配合物的抗肿瘤作用是通过MTT比色法验证的，所述肿瘤细胞为HeLa(人宫颈癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、A549R(耐药性的人肺癌细胞株)。所述钌-青蒿琥酯配合物在肿瘤细胞中的摄取水平、摄取机制、Western Blot研究均在HeLa细胞中进行。
与现有技术相比，本发明具有以下优异效果：
(1)本发明具有抗肿瘤作用的化合物为钌配合物，其具有多配位构型，可以进行不同配体的修饰，实现其与相应底物的特异性结合。
(2)本发明钌多吡啶配合物具有较高的脂溶性，将钌多吡啶配合物与青蒿琥酯结合，可提高细胞对青蒿琥酯的摄取量，进入细胞后，协同发挥抗肿瘤作用，本发明还进一步研究了钌-青蒿琥酯配合物的抗肿瘤活性，发现Ru-2具有良好的抗肿瘤活性。
附图说明
图1为化合物Ru-1的1H-NMR谱；
图2为化合物Ru-1的ESI-MS图谱；
图3为化合物Ru-2的1H-NMR谱；
图4为化合物Ru-2的ESI-MS图谱；
图5为激光共聚焦显微镜研究Ru-2在HeLa细胞中的摄取；
图6为激光共聚焦显微镜研究Ru-2在HeLa细胞中的摄取机制；
图7为Western Blot研究Ru-2在HeLa细胞中的抗肿瘤机制。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所要求的保护范围并不局限于此，实施例中所使用的材料，不做特别说明的情况下，均可以市场购买得到或者常规方法配制得到。
实施例1
将7.6729mmol DIP、3.836mmol RuCl3·nH2O和38.36mmol氯化锂置三颈烧瓶中，加入11mL N,N二甲基甲酰胺，氮气保护下153℃反应8h，反应完成后，将反应液逐滴加入到150mL冰丙酮中，之后，置于4℃冰箱过夜，抽滤，用于4℃预冷的水和丙酮交替洗涤，得到cis-[Ru(DIP)2Cl2]·2H2O；
取0.3144mmol cis-[Ru(DIP)2Cl2]·2H2O和0.3144mmol 4-羟甲基-4'-甲基-2-2'-联吡啶置于三颈烧瓶中，加入100mL体积分数75％的乙醇水溶液，氮气保护下85℃反应8h，反应完成后，将反应液充分浓缩至10mL，加入1.2576mmol六氟磷酸铵固体，超声即析出大量沉淀，抽滤，真空干燥，沉淀以乙腈/水/饱和硝酸钠溶液(100:9:1，v/v/v)作为洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，得到反应中间体[Ru(DIP)2bpy(4-CH3-4'-CH2OH)](PF6)2，Ru-1，产率为83.64％。
图1和图2所示分别为化合物Ru-1的1H-NMR谱和ESI-MS图谱；图示，1H NMR(600MHz,d6-DMSO)δ8.82(d,J＝18.8Hz,2H),8.35(s,2H),8.25(d,J＝21.3Hz,6H),7.95(d,J＝5.1Hz,2H),7.89–7.49(m,24H),7.45(s,1H),7.36(s,1H),5.78(s,1H),4.77(s,2H),2.56(s,3H)。MS(ESI):m/z:965.3[M-2PF6-H]+。
将0.1592mmol反应中间体、15.92mmolART、0.2388mmol脱水剂二环己基碳二亚胺和0.1592mmol催化剂4-二甲氨基吡啶置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL超干二氯甲烷，室温反应3天，反应结束后，将反应液浓缩至5mL，之后，逐滴滴加到20mL乙醚中，有大量沉淀析出，抽滤，真空干燥，得到的粗产品以二氯甲烷/甲醇溶液(60:1，v/v)作为洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化得到钌-青蒿琥酯配合物[Ru(DIP)2bpy(4-CH3-4'-CH2OART)](PF6)2，Ru-2，产率为48.5％。
图3和图4所示分别为化合物Ru-2的1H-NMR谱和ESI-MS图谱；图示，1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.87–8.80(m,2H),8.34(s,2H),8.28–8.20(m,6H),7.95(d,J＝5.3Hz,2H),7.82(d,J＝5.6Hz,1H),7.77(s,2H),7.72–7.62(m,21H),7.47(d,J＝5.9Hz,1H),7.38(d,J＝5.8Hz,1H),5.63(d,J＝4.2Hz,1H),5.50(d,J＝8.3Hz,1H),5.37(s,2H),2.76(dd,J＝18.2,4.4Hz,4H),2.57(s,3H),2.25(s,1H),2.14(s,1H),1.96(d,J＝14.3Hz,1H),1.79(s,1H),1.48(s,3H),1.34(s,3H),1.21(d,J＝9.4Hz,3H),1.14(s,1H),0.85(s,4H),0.67(s,3H)。MS(ESI):m/z:666.2[M-2PF6]2+。
实施例2
对钌-青蒿琥酯配合物抗肿瘤活性实验测试：
将HepG2、A549R、HeLa细胞分别用含10％胎牛血清与1％青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基(10％胎牛血清与1％青霉素-链霉素为体积百分比)，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，将细胞用质量百分比0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行活细胞计数，调整活细胞浓度为5×104/mL接种于96孔培养板，每孔160μL，培养24h后，再分别加入不同量的药物，药物终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM，置37℃，含5％CO2的培养箱中孵育48h，于结束前4h加入MTT(20μL/孔)，4h后弃上清液，加入DMSO(150μL/孔)，振荡15min，之后，测定波长为570nm处的吸光值。
将细胞分为空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和实验组，空白对照组为含1％DMSO的培养基，阳性对照组选用顺铂(cisplatin)，阴性对照组为Ru-1、Ru-1+ART、ART，实验组为Ru-2。
IC50为半数抑制有效浓度，通过spss计算得到。
测试结果如下表1所示，实验数据为三次平行实验后取得的平均值。
由表1可以看出，同样浓度下，Ru-2的IC50最低，说明Ru-2具有抗肿瘤效果最好。
表1
实施例3
对钌-青蒿琥酯配合物在HeLa细胞中的摄取情况进行研究，本实施例通过激光共聚焦显微镜观察钌-青蒿琥酯配合物在HeLa细胞中的摄取：
将HeLa细胞培养于35mm的Corning激光共聚焦培养皿中，当其密度为70％时，加入5μM的Ru-2分别孵育1h、2h、3h、4h，之后，用PBS洗涤两次，立刻用激光共聚焦显微镜观察。
研究结果如图5所示，细胞对Ru-2的摄取量呈时间依赖的方式增加。
实施例4
对钌-青蒿琥酯配合物在HeLa细胞中的摄取机制进行研究，本实施例通过激光共聚焦显微镜研究钌-青蒿琥酯配合物在HeLa细胞中的摄取机制：
将HeLa细胞培养于35mm的Corning激光共聚焦培养皿中，当其密度为70％时，加入30μM的CCCP(CCCP，羰基氰化物间氯苯腙，代谢抑制剂)和50μM的氯喹(Chloroquine，内吞抑制剂)预孵育1h，之后，将培养液替换为含5μM的Ru-2的培养液(培养基为DMEM)，继续孵育4h后，细胞用PBS洗涤两次，立刻用激光共焦显微镜观察。
研究结果如图6所示，经4℃或代谢抑制剂CCCP处理之后，HeLa细胞对配合物的摄取效率降低，而经内吞抑制剂氯喹预处理后，HeLa细胞对配合物的摄取效率没有明显变化；研究结果表明，钌-青蒿琥酯配合物是通过能量依赖的途径进入HeLa细胞。
实施例5
钌-青蒿琥酯配合物的抗肿瘤机制研究：
将HeLa细胞培养于60mm的Corning培养皿中，当其密度长至70％时，加入Ru-2(Ru-2的浓度设置分别为0μM、4μM、6μM、8μM)，置37℃培养箱孵育24h，之后，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解细胞，离心，收集上清液，用BCA蛋白分析试剂盒测定总蛋白浓度。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标蛋白，然后转移到PVDF膜上，将PVDF膜浸泡于封闭液中室温震摇2h。接着与相应的一抗(β-actin、caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2)于4℃震摇过夜，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h。使用ECL化学发光底物试剂盒进行信号检测。
caspase-3为细胞凋亡关键的执行分子；PARP为细胞凋亡的标志物；Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，抑制化疗药物所引起的细胞凋亡；Bax基因是人体最主要的凋亡基因，其编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。
检测结果如图7所示，Ru-2处理之后能够诱导caspase-3断裂，同时PARP也发生了剪切，并且能降低细胞中Bcl-2的表达，提高Bax的表达。
以上实验结果表示钌-青蒿琥酯配合物能通过诱导HeLa细胞发生凋亡来发挥抗肿瘤作用。