一种人卵巢癌细胞抑制剂、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种人卵巢癌细胞抑制剂、制备方法及其应用 (Human ovarian cancer cell inhibitor, preparation method and application thereof ) 是由 杨燕 宾贻东 廖志强 农基健 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人卵巢癌细胞抑制剂及其制备方法、应用,属于医药领域。其化学名称为六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1’,2’:1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-苯并喹啉合铱(Ⅲ)。其制备方法步骤包括:8-羟基喹啉与盐酸、NaClO-3反应；加入无水碳酸钾；加入2-氨基-5-甲基吡啶；加入4,5-二甲基邻苯二胺；得化合物3a；7,8-苯并喹啉和水合三氯化铱反应得化合物4；化合物3a与化合物4反应,得人卵巢癌细胞抑制剂。本发明对人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP的体外抗肿瘤活性大于8-羟基喹啉衍生物配体和金属基抗癌药物顺铂；对正常细胞HL-7702的毒性很小,体现出靶向抑制人卵巢癌增殖的良好效果。(The invention discloses a human ovarian cancer cell inhibitor, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of medicines. Its chemical name is hexafluorophosphorylation.2, 12, 13-trimethylpyrido [3,2-a]Pyrido [1',2':1,2]Imidazo [4, 5-c)]Phenazine bis-benzoquinolinato iridium (III). The preparation method comprises the steps of 8-hydroxyquinoline, hydrochloric acid and NaClO 3 Carrying out reaction; adding anhydrous potassium carbonate; adding 2-amino-5-methylpyridine; adding 4, 5-dimethyl o-phenylenediamine; to obtain a compound 3 a; reacting 7, 8-benzoquinoline with iridium trichloride hydrate to obtain a compound 4; reacting the compound 3a with the compound 4 to obtain the human ovarian cancer cell inhibitor. The in vitro anti-tumor activity of the invention on human ovarian cancer drug-resistant strain SK-OV-3/DDP is greater than that of 8-hydroxyquinoline derivative ligand and metal-based anti-cancer drug cisplatin; toxicity to Normal cell HL-7702Has small sex, and shows good effect of targeted inhibition of human ovarian cancer proliferation.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种人卵巢癌细胞抑制剂、制备方法及其应用。
背景技术
我国目前每年约有5.2万女性被确诊为卵巢癌，约2.2万人死于卵巢癌，并且过去10年卵巢癌发病呈年轻化趋势。卵巢癌具有易增殖、侵袭性高等特点，这是临床治疗失效的主要原因，因此抑制卵巢癌细胞增殖及侵袭是治疗卵巢癌的要点与难点之一。
8-羟基喹啉衍生物是多种药物的中间体(如喹碘仿、氯碘喹啉等)，具有广泛的药理活性，如抗癌、抗艾滋病、抗真菌、抗血吸虫、抗氧化和神经保护活性等。8-羟基喹啉的抗肿瘤活性研究起点较晚，Shaw等人分析不同类型的8-羟基喹啉衍生物的构效关系，发现8-羟基喹啉是抗肿瘤的主要药效基团。但8-羟基喹啉衍生物铱(Ⅲ)配合物作为人卵巢癌细胞抑制剂，尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种人卵巢癌细胞抑制剂、制备方法及其应用，其抑制剂比临床药物顺铂活性更高；制备方法以8-羟基喹啉衍生物作为活性配体，合成人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]。
本发明的第一个目的，通过以下技术方案予以实现:
一种人卵巢癌细胞抑制剂，名称为六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-苯并喹啉合铱(Ⅲ)，其结构式如下：
本发明的第二个目的，通过以下技术方案予以实现:
人卵巢癌细胞抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将8-羟基喹啉、盐酸加入容器中，待8-羟基喹啉溶解后，加入NaClO3，得化合物1；
(2)将化合物1、无水碳酸钾和乙醇加入容器中，搅拌使化合物1溶解，加入2-氨基-5-甲基吡啶，反应混合物回流，得化合物2；
(3)化合物2、无水乙醇和乙酸加入容器中并搅拌，使化合物2溶解，加入4,5-二甲基邻苯二胺加入到容器中，回流反应，得化合物3a；
(4)按7,8-苯并喹啉，水合三氯化铱加入容器中，然后依次加入乙二醇乙醚、水；通入氮气，反应回流，得化合物4；
(5)化合物4与化合物3a加入容器中，再加入乙二醇，氩气保护下回流反应，反应结束后加入饱和六氟磷酸铵溶液，得沉淀物；沉淀物为六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-苯并喹啉合铱(Ⅲ)。
优选地，所述步骤(1)为：将8-羟基喹啉、盐酸加入到容器中，加热到40-45℃，待8-羟基喹啉溶解后，加入NaClO3，保持在40-45℃继续搅拌反应1-3h；反应结束后水稀释，除去沉淀物并取滤液萃取，合并有机相，水洗，旋蒸出溶剂，得到固体物，过滤沉淀，固体物重结晶，得到化合物1。
8-羟基喹啉与NaClO3摩尔比为1:5-6；盐酸浓度为35-37％体积分数。
优选地，所述步骤(2)为：将化合物1和无水碳酸钾加入到容器中，再加入乙醇，搅拌使化合物1溶解完全，加入2-氨基-5-甲基吡啶进行反应，反应混合物在80-85℃下回流15-20h，冷却，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，得化合物2；
化合物1和无水碳酸钾的摩尔比为1:1-2。
2-氨基-5-甲基吡啶与化合物1的摩尔比为2-3:1。
优选地，所述步骤(3)为：化合物2加入容器中，加入无水乙醇和乙酸搅拌溶解，然后将4,5-二甲基邻苯二胺加入到容器中，80-90℃下回流反应，冷却析出沉淀物，过滤，沉淀物重结晶，得化合物3a。
化合物2与4,5-二甲基邻苯二胺摩尔比为1:1-2。
优选地，所述步骤(4)为：取7,8-苯并喹啉，水合三氯化铱投入容器中，再依次加入乙二醇乙醚、水；通入氮气，加热至120-150℃回流24-48h，冷却，向反应液中倒入水，搅拌析出固体物，固体物过滤，水洗，乙醇洗，干燥得到化合物4。
7,8-苯并喹啉和水合三氯化铱的摩尔比为1-2:1。
优选地，所述步骤(5)为：取化合物4与化合物3a加入容器中，再加入乙二醇，氩气保护下加热回流10-15h；冷却，加水稀释，加入饱和六氟磷酸铵溶液，产生沉淀物；抽滤，用水、乙醚洗涤沉淀物并干燥；沉淀物用乙腈溶解，用中性氧化铝过柱分离；二氯甲烷和乙腈的混合溶剂淋洗，蒸馏旋干去除溶剂，得人卵巢癌细胞抑制剂；
化合物4与化合物3a的摩尔比为1:1-2。
二氯甲烷和乙腈的体积比为3:1。
本发明的第三个目的，通过人卵巢癌细胞抑制剂在制备抗肿瘤药物中应用予以实现。
本发明的第三个目的，还可以通过人卵巢癌细胞抑制剂在制备外用抗肿瘤药物中作为有效成分的应用予以实现。
本发明制备的人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]，对人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP有很高的抗肿瘤活性，其IC50值范围为0.002±0.001μM，其体外抗肿瘤活性大于8-羟基喹啉衍生物配体和金属基抗癌药物顺铂；对正常细胞HL-7702的毒性很小(IC50＞50μM)，体现出很好的靶向抑制人卵巢癌增殖。人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]具有潜在的药用价值，能够用于抗肿瘤药物的制备。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的电喷雾质谱图；
图2为本发明实施例1制得的人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例1制得的人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的核磁共振碳谱图；
图4为本发明实施例1制得的人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的红外光谱图；
图5为本发明制备的人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的化学结构式；
图6为本发明的合成路线图。
图6中，化合物1为6,7-二氯喹啉-5,8-二酮；化合物2为9-甲基吡啶并[2',1':2,3]咪唑并[4,5-h]喹啉-5,6-二酮；化合物3a为2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪；化合物4为铱(Ⅲ)氯桥二聚体[(H-BQ)2Ir(μ-Cl)]2；；化合物[Ir(3a)(BQ)2]为六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-苯并喹啉合铱(Ⅲ)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的制备与表征：
如图6所示，称取化合物4与化合物3a(8-羟基喹啉衍生物)按照摩尔比为1:1.3，投入容器中，再加入乙二醇，氩气保护下加热回流13h，得深红色澄清溶液；冷却至室温，加水稀释后，再加入饱和六氟磷酸铵溶液，即产生大量红色沉淀；抽滤，用水、乙醚洗涤、干燥；将干燥后的粗产品用乙腈溶解，用中性氧化铝过柱分离；用V(二氯甲烷):V(乙腈)＝3:1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然后减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]，即六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-苯并喹啉合铱(Ⅲ)，即得到土黄色的目标产物[Ir(3a)(BQ)2]。
对所得[Ir(3a)(BQ)2]进行鉴定：
(1)电喷雾质谱，其谱图如图1所示。
ESI-MS m/z:912.2423[M]+，其中M为人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的分子量。
(2)核磁共振氢谱图，如图2所示。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),9.08(s,1H),8.81–8.56(m,3H),8.49(d,J＝8.0Hz,1H),8.27–8.17(m,1H),8.13(d,J＝5.0Hz,1H),8.08(d,J＝8.8Hz,1H),7.99(dd,J＝27.8,8.9Hz,3H),7.92–7.83(m,2H),7.70(d,J＝7.9Hz,2H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(d,J＝9.3Hz,1H),7.41–7.35(m,1H),7.35–7.28(m,2H),6.56(d,J＝7.1Hz,1H),6.47(d,J＝7.1Hz,1H),6.02(d,J＝9.2Hz,1H),2.51(s,3H),2.50(s,3H),2.45(s,3H)。
(3)核磁共振碳谱图，如图3所示。
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ157.34,156.76,146.99,145.97,144.02,141.75,141.66,141.38,138.24,137.98,136.08,134.25,134.11,130.09,129.84,129.72,129.05,127.70,127.28,127.19,126.96,126.92,125.91,124.77,124.71,123.14,121.04,120.96,113.52,20.41,19.83,18.34.
(4)红外光谱图，如图4所示。
红外光谱为(KBr压片,cm-1)：3426,3032,2929,1616,1531,1446,1437,1390,1202,1099,1015,847,724,556。
因此，可以确定所得黄色目标产物为人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]，其结构式如图5所示。
实施例2
人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的合成路线如图6所示：
(1)化合物1的制备：在1L的圆底烧瓶加入600mL的浓盐酸(预先置于冰箱冰冻，浓盐酸浓度为37％质量分数)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到40℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入53g NaClO3(60分钟内加完)，加完后在40℃继续搅拌2h。反应结束后用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物1；
(2)化合物2的制备：将2.28g(0.01mol)的化合物1和1.363g无水碳酸钾(0.01mol)加入到50mL的圆底烧瓶中加入20mL的乙醇，搅拌使化合物1完全溶解，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶2.16g(0.02mol)，反应混合物在84℃下回流15h；冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，得化合物2。
(3)化合物3a的制备：称取1mmol的化合物2加入到50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇和3mL乙酸，搅拌30min，称取1.9mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用4mL乙醇溶解后加入)，80℃下回流10min，冷却析出金黄色沉淀(席夫碱类物质)，过滤，将固体重结晶，得化合物3a。
(4)化合物4的制备：取7,8-苯并喹啉0.4301g(2.4mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚18mL，去离子水6mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至120℃回流24h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为化合物4。
(5)人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol化合物4，0.2mmol化合物3a，15mL乙二醇，氩气保护下加热回流10h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷):V(乙腈)＝2:1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然后减压蒸馏旋干去除溶剂，得人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]；产率约92％。
实施例3
人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的合成路线如图6所示：
(1)化合物1的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入725mL的浓盐酸(预先置于冰箱冰冻，浓盐酸浓度为35％质量分数)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到45℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入64g NaClO3(60分钟内加完)，加完后在45℃继续搅拌1h。反应结束后用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物1；
(2)化合物2的制备：将2.28g(0.01mol)的化合物1和2.73g(0.02mol)无水碳酸钾加入到50mL的圆底烧瓶中，加入25mL的乙醇，搅拌使化合物1溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶3.24g(0.03mol)，反应混合物在85℃下回流15h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，得化合物2。
(3)化合物3a的合成：称取1mmol的化合物2加入到50mL圆底烧瓶中，加14mL无水乙醇和5mL乙酸，搅拌60min，称取2.0mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用4mL乙醇溶解后加入)，80℃下回流10min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(即为席夫碱)，过滤，固体重结晶，得化合物3a。
(4)化合物4的合成：取7,8-苯并喹啉0.2151g(1.2mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚15mL，去离子水5mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至150℃回流36h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为化合物4。
(5)人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol化合物4，0.2mmol化合物3a，15mL乙二醇，氩气保护下加热回流15h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷):V(乙腈)＝2:1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然后，减压蒸馏旋干去除溶剂，得人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]；产率约90％。
体外抗肿瘤活性实验
1.细胞株与细胞培养
本实验选用人卵巢癌顺铂耐药SK-OV-3/DDP细胞和人正常肝HL-7702细胞等两种人类细胞株。
所有人源细胞株均培养在含100U/mL青霉素、10wt％小牛血、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
2.待测化合物的配制
所用的化合物3a、化合物4和人卵巢癌细胞抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]的纯度均需≥95％，将它们的DMSO(二甲基亚砜)储液用生理缓冲液稀释成20μmol/L的终溶液(DMSO的终浓度≤1％)，测试该浓度下各个化合物对正常细胞或所选的肿瘤细胞生长的抑制程度。
3.细胞生长抑制实验(MTT法)
(1)取对数生长期的正常细胞或肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS(磷酸缓冲盐溶液)填充)；
(2)5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；
(3)5％CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、培养液、MTT、相同浓度的药物溶解介质、DMSO)。
(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：
计算各个化合物对所选细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对所选的各个细胞株的IC50值(单位为μM)。其结果如以下表1所示。
表1化合物3a、化合物4和配合物[Ir(3a)(BQ)2]对二种细胞株的IC50值
IC50活性筛选结果显示，抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]对人卵巢癌顺铂耐药SK-OV-3/DDP细胞和人正常肝HL-7702细胞的增殖抑制活性，明显高于配体3a。活性筛选实验结果显示，抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]对人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP有很高的抗肿瘤活性，其IC50值范围为0.002±0.001μM，其体外抗肿瘤活性远远大于3a配体和临床经典的金属基抗癌药物顺铂；此外，配合物5a-Ir对正常细胞HL-7702的毒性很小(IC50＞50μM)，体现出很好的靶向抑制人卵巢癌的增殖。总而言之，抑制剂[Ir(3a)(BQ)2]表现出良好的体内外抗肿瘤活性和靶向性。
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