一种柚皮苷衍生物、制备方法及其在制备治疗心血管类疾病的药物中的应用
阅读说明：本技术 一种柚皮苷衍生物、制备方法及其在制备治疗心血管类疾病的药物中的应用 (Naringin derivative, preparation method and application thereof in preparation of medicine for treating cardiovascular diseases ) 是由 李峰 李文保 于 2021-03-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种柚皮苷衍生物,其具有通式(I)所示结构,本发明还提供了所述柚皮苷衍生物的制备方法和在制备心血管类疾病的药物中的应用,通过药理学实验证明,上述柚皮苷衍生物具有显著减肥、降血脂的生物学活性。柚皮苷衍生物具有一定的减肥、减脂的趋势,并且均具有良好的安全性,对于开发新型的减肥、降血脂等心血管类疾病的治疗药物具有重要意义。(The invention provides a naringin derivative which has a structure shown in a general formula (I), and also provides a preparation method of the naringin derivative and application of the naringin derivative in preparation of medicaments for treating cardiovascular diseases. The naringin derivative has certain tendency of losing weight and reducing fat, has good safety, and has important significance for developing novel medicaments for treating cardiovascular diseases such as losing weight, reducing blood fat and the like.)
技术领域
本发明属于化学和医药技术领域，涉及医药化合物及其制备方法和应用，具体涉及一种柚皮苷衍生物及其制备方法和在制备治疗心血管类疾病的药物中的应用。
背景技术
柚皮苷又称柚苷、异橙皮苷，来源于芸香科柑橘属植物未成熟或者近成熟的干燥果皮和果肉，是一种天然的黄酮类化合物。近年来有关柚皮苷临床应用的研究发现其在治疗抗炎镇痛、减肥、抗癌、以及预防心血管类疾病方面都发挥着积极作用。
肥胖是一种脂肪代谢紊乱并伴有炎症反应的疾病，是诱发许多慢性病的主要风险因素，如糖尿病、心血管疾病和癌症等。治疗肥胖症的药物很多，按其作用机制可分为抑制食欲、增加能量消耗、抑制肠道消化吸收以及植物类和其他一些正在研究中的如肥胖基因产品等。国外一共上市 6 个药物治疗肥胖症，此外，西布曲明和利莫那班均在上市后撤市，原因在于两者引起严重的不良反应：西布曲明能引起心血管疾病的增加，而利莫那班能够导致抑郁和自杀的风险。
心脑血管疾病如高血压、脑梗、动脉粥样硬化对人类的健康存在着严重威胁。柚皮苷可降低血液的粘滞度，减少血栓的形成，对心脑血管系统具有一定的保护作用，改善心功能和发挥调控心血管作用。
尽管柚皮苷具有多种药理活性，但其体内生物利用度低等缺陷限制了其临床应用，因此，在柚皮苷结构基础上进行化学修饰与改造，增强其成药性，这对于开发新型的减肥、降血脂等心血管类疾病的治疗药物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种柚皮苷衍生物及其制备方法；此外本发明还提供了所述柚皮苷衍生物在制备减肥、降血脂等治疗心血管类疾病的药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种柚皮苷衍生物，其具有通式（I）所示结构：
；
式中：R选自或；其中n=1-5。
具体的所述n为1，2，3，4或5。
进一步的，所述柚皮苷衍生物具体为P-1和P-3，其结构式如下：
本发明还提供了所述的柚皮苷衍生物的制备方法，所述P-1的制备方法为：
柚皮苷与苄基保护的水杨酸在缩合剂作用下进行缩合反应制得柚皮苷衍生物P-2，然后脱除苄基保护即得P-1；
；
所述P-3的制备方法为：柚皮苷与溴乙醇在碱作用下进行醚化反应制得柚皮苷衍生物P-3。
进一步的，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、二异丙基碳二亚胺(DIC) 中的一种或几种；所述的碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、氢氧化钾、氢氧化钠、三乙胺、二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。
进一步的，所述的缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）中的一种或两种；所述碱选用碳酸钾、氢氧化钾、三乙胺中的一种或几种。
所述P-1的制备方法为：柚皮苷与缩合剂、2-（苄氧基）苯甲酸，在室温下反应22-26h，过滤得到的母液加入钯碳，加氢，室温下反应22-26h，过滤，母液浓缩蒸干，柱层析得P-1。
所述柚皮苷与缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3；所述柚皮苷与2-（苄氧基）苯甲酸的摩尔比为1:0.9-1.1，所述柚皮苷与钯碳的质量比为9-11:1；所述钯碳为9-11wt%的钯碳。
所述P-3的制备方法为取柚皮苷溶于溶剂中，加入碱，室温下搅拌反应1.8-2.2h，加入溴乙醇，78-82℃反应过夜，降温、萃取、柱层析纯化得P-3；所述柚皮苷与碱的摩尔比为1:2-2.2；所述柚皮苷与溴乙醇的摩尔比为1:0.9-1.1。
本发明还提供了所述的柚皮苷衍生物在制备治疗心血管类疾病的药物中的应用。
进一步的，所述药物为用于减肥、降血脂的药物。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
本发明提供了柚皮苷衍生物及其制备方法和在制备治疗心血管类疾病的药物中的应用，通过药理学实验证明，上述柚皮苷衍生物体外降脂结果较好，可显著降低大鼠的体重，明显降低大鼠的摄食量，减轻大鼠体内脂肪的堆积，具有显著减肥、降血脂的生物学活性。柚皮苷衍生物具有一定的减肥、减脂的趋势，并且均具有良好的安全性，具有进一步开发的价值。
附图说明
图1为受试样品对高脂模型大鼠体重的影响，其中，** p<0.01vs.空白，# p<0.05，## p<0.01 vs.模型。
图2为受试样品对高脂模型大鼠摄食量的影响，其中，# p<0.05 vs.模型。
图3为受试样品对高脂模型大鼠体脂的影响，其中，** p<0.01 vs.空白，# p<0.05， vs.模型。
图4为受试样品对高脂模型大鼠血脂的影响，其中，** p<0.01 vs.空白， # p<0.05，##p<0.01 vs.模型；
其中4a为受试样品对高脂模型大鼠甘油三酯(TG)的影响；
4b为受试样品对高脂模型大鼠胆固醇(TCHO)的影响；
4c为受试样品对高脂模型大鼠低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）的影响；
4d为受试样品对高脂模型大鼠高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的影响。
图5为受试样品对高脂模型大鼠主动脉根部脂质堆积的影响；
其中5a为空白组大鼠主动脉根部脂质堆积的图片；
5b为模型组大鼠主动脉根部脂质堆积的图片；
5c为奥利司他组受试样品对高脂模型大鼠主动脉根部脂质堆积的影响；
5d为辛伐他汀组受试样品对高脂模型大鼠主动脉根部脂质堆积的影响；
5e为P-1组受试样品对高脂模型大鼠主动脉根部脂质堆积的影响；
5f为P-3组受试样品对高脂模型大鼠主动脉根部脂质堆积的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：柚皮苷衍生物P-1的合成路线如下：
；
将柚皮苷（5.80 g, 10 mmol）加入丙酮（50 mL），依次加入二环己基碳二亚胺DCC（2.47 g，12 mmol）和2-（苄氧基）苯甲酸（2.28 g, 10 mmol），室温下反应24小时，过滤去白色固体，母液不经纯化直接加入（0.58g）10%钯碳，加氢，25度下反应24小时，过滤，母液浓缩蒸干，柱层析得P-1，收率55%。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ = 12.64 (s, 1H), 10.85 (s, 1H), 8.45 (d,1H), 8.10 (dd, 1H), 7.61-7.53 (m, 1H), 7.35 (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 7.22 (t,1H), 6.37 (d, 1H), 6.20 (d, 1H), 5.51 (d, 1H), 5.31 (d, 1H), 5.10 (d, 1H),4.77-4.75 (m, 2H), 4.65 (t, 1H), 4.51 (d, 1H), 4.29 (t, 1H), 4.20 (d, 1H),3.70-3.67 (m, 1H), 3.61 (s, 1H), 3.56-3.50 (m, 2H), 3.49-3.45 (m, 2H), 3.43-3.38 (m, 3H), 3.32-3.26 (m, 3H), 1.13 (s, 3H) ppm. ESI-MS：（m/z，%）= 701 [M+H]+。
实施例2：柚皮苷衍生物P-3的合成路线如下：
取柚皮苷（5.80 g, 10 mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（30mL）中，加入碳酸钾（28.4g, 21mmol），室温下搅拌反应2h，加入溴乙醇（13.1g, 10mmol），80℃反应过夜，倒入冷水中，二氯甲烷萃取，柱层析纯化得P-3，收率65%。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ = 7.30 (d, 2H), 6.89 (d, 2H), 6.37 (d,1H), 6.20 (d, 1H), 5.51 (d, 1H), 5.31 (d, 1H), 5.10 (d, 1H), 4.78- 4.75 (m,2H), 4.65 (t, 1H), 4.51 (d, 1H), 4.33-4.29 (m, 3H), 4.20 (d, 1H), 3.70 – 3.67(m, 3H), 3.61 (s, 1H), 3.58-3.50 (m, 2H), 3.46-3.41 (m, 2H), 3.45-3.38 (m,3H), 3.33-3.26 (m, 3H), 1.12 (s, 3H) ppm. ESI-MS：（m/z，%）= 625 [M+H]+。
实施例3：测定柚皮苷类衍生物体外降脂活性测试
1.实验材料：
DMEM培养基，美洲源FBS血清，谷氨酰胺，青霉素，链霉素，96孔板，人肝癌细胞HepG2，油红O，异丙醇，DMSO等。
2. 实验方法：
1）取对数生长期HepG2细胞12000个/孔接种于96孔板，100μl/孔；
2）12h后融合度达到70-80%后换成无血清DMEM培养基，每孔80μl，饥饿12h。12h后，空白对照加入20μl无血清培养基，其他组每孔加入诱导剂OA（终浓度80μM），10μl/孔。在此基础上，模型组补充10μl无血清培养，给药组加入10μl待测化合物，终浓度10μM，培养箱孵育24h；
3）24h孵育完毕后，弃掉培养基，用PBS（室温）缓冲液洗1次，每孔加入80μl4%多聚甲醛固定液室温固定0.5h，PBS洗1次，60%异丙醇润洗10min后每孔加入60μl 0.3%油红O（Sigma O0625）染液室温染色1h，然后用PBS缓冲液洗3次；
4）用DMSO溶解，100μl/孔，酶标仪358nm处测OD值。
3. 实验结果见表1：
由表1可知，P-1，P-3组的OD值是最高的，说明其体外降脂结果较好。
实施例4：测定柚皮苷类衍生物体内降脂活性测试
1.实验材料：
受试化合物：P-1，P-3，浓度均为100mg/kg
实验动物：雄性SD大鼠72只，体重100±5g，购自于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK鲁20140007。
2.实验方法
所有大鼠基础饲料喂养7天，禁食12h后，按体重随机分为8组：空白组，模型组，阳性药奥利司他组（40mg/kg），阳性药辛伐他汀组（5mg/kg），P-1组（100mg/kg），P-3组（100mg/kg），每组9只大鼠，其中空白组继续饲喂基础饲料，其他组饲喂高脂饲料，喂养4周后，采血检测血脂水平，联合体重增重水平确定造模成功。
高脂喂养4周后各组给予相应样品灌胃，1次/天，连续4周，给药期间记录体重与摄食量。分组与处理见下表2：
上述处理，是指按照此规格灌胃给药。
给药4周后，禁食12h，各组大鼠10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，2500rpm 15min离心分离血清，检测甘油三酯（TG）、胆固醇（TCHO）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量，打开腹腔取出附睾、肾周脂肪，电子天平称湿重并记录。
取各组大鼠心脏，于主动脉根部横断面冰冻切片，入10%中性福尔马林固定15min，蒸馏水冲洗2min，60%异丙醇水溶液2s，入油红O工作液染15min，60%异丙醇水溶液2s，蒸馏水洗2min，Mayer氏苏木精染核8min，水洗1min，分化2s，水洗1min，返蓝1s，水洗1min，甘油封片，镜检。
3. 检测结果及分析
（1）受试样品对高脂模型大鼠体重与摄食量的影响
各组大鼠初始体重均衡，差异均无显著性，饲喂高脂饲料后，大鼠体重较空白组显著增加。给予样品处理4周，各组大鼠均状态良好，阳性药奥利司他和样品P-1、P-3可显著降低大鼠的体重，样品P-1、P-3可明显降低大鼠的摄食量( P<0.05)，其余各组体重与摄食量则未有显著性差异。推测样品P-1、P-3具有减重的活性，其机制可能与抑制摄入有关（表3，图1、2）。
注：** p<0.01 vs.空白，# p<0.05，## p<0.01 vs.模型
（2）受试样品对高脂模型大鼠体脂的影响
脂肪系数是大鼠体内肾脏及睾丸周围脂肪垫与大鼠体重的百分比，反映大鼠体内脂肪的多少与大鼠的肥胖程度。由表4可知，与空白组比较，模型组的脂肪重量、脂肪系数明显增加( P<0.01) ，表明喂饲高脂饲料能够加重大鼠体内脂肪的堆积；与模型组比较，奥利司他、样品P-1、P-3的脂肪重量和脂肪系数均有明显降低，差异显著( P<0.05)，说明样品P-1、P-3可减轻大鼠体内脂肪的堆积。
注：** p<0.01 vs.空白，# p<0.05， vs.模型。
（3）受试样品对高脂模型大鼠血脂的影响
给药4周后，模型组与空白组相比，TCHO、LDL-C水平明显升高（P<0.01），HDL-C水平明显降低（P<0.01），表明高脂饲料喂养大鼠致高胆固醇型、高脂血模型复制成功。
阳性药辛伐他汀可显著降低大鼠TCHO、LDL-C水平（P<0.05），P-3能降低低密度胆固醇LDL-C，并提高高密度胆固醇HDL-C水平，与模型组相比差异显著（P<0.05）（表5，图4）。
注：** p<0.01 vs.空白， # p<0.05，##p<0.01 vs.模型
（4）受试样品对高脂模型大鼠主动脉根部脂质堆积的影响
主动脉根部进行油红O染色，可见空白组血管壁无脂质堆积，模型组血管内部脂质堆积现象明显，给予药物处理4周后，奥利司他与辛伐他汀组大鼠均未出现脂质堆积，各样品组均有不同程度的脂质堆积现象，油红O染色结果与大鼠各组血脂结果基本相吻合（图5），说明样品有一定的降脂趋势。
（5）安全性评价：体内实验过程发现，所有受试大鼠均未发生死亡，表明所有供试化合物均具有良好的安全性。
本实验表明，在该实验模型中，100mg/kg给药浓度下，化合物P-3具有减轻体重，抑制摄食，减轻体脂堆积，调节载脂蛋白水平的功效；化合物P-1具有减轻体重，抑制摄食，减轻体脂堆积的功效；所有供试化合物在不同指标上均表现有一定的减肥、减脂的趋势，并且均具有良好的安全性，具有进一步开发的价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
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