一种寡聚透明质酸钠的制备方法
阅读说明：本技术 一种寡聚透明质酸钠的制备方法 (Preparation method of oligomeric sodium hyaluronate ) 是由 张建勇 俞超 王朋田 朱伟伟 刘守垒 田洪果 相茂功 王春朋 殷小崴 王海泉 秦 于 2021-01-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种寡聚透明质酸钠的制备方法：可发酵产生透明质酸的菌种接入发酵培养基中,适宜条件下搅拌发酵,发酵至动力粘度140000-250000 mPa·s时,添加透明质酸酶,至发酵终点获得发酵液；调节发酵液的pH,在适温下加入透明质酸酶,反应获得酶解液；酶解液中加入抗氧化剂,然后调节pH,升温灭活酶,获得寡聚透明质酸钠溶液；将寡聚透明质酸钠溶液纯化、干燥获得寡聚透明质酸钠。本发明提供的寡聚透明质酸钠的制备方法,在发酵过程中加入透明质酸水解酶,边发酵边酶解,提高了产量；高温灭活过程中加入抗氧化剂,提高了纯度。该方法获得的寡居透明质酸钠的收率高、工艺连续,直接获得目标分子量产物,所得产品活性高。(The invention provides a preparation method of oligomeric sodium hyaluronate, which comprises the following steps: inoculating a strain capable of fermenting to produce hyaluronic acid into a fermentation culture medium, stirring and fermenting under a proper condition, and adding hyaluronidase when the dynamic viscosity is 140000-250000 mPa & s until the fermentation end point to obtain fermentation liquor; adjusting the pH value of the fermentation liquor, adding hyaluronidase at a proper temperature, and reacting to obtain enzymatic hydrolysate; adding an antioxidant into the enzymolysis liquid, then adjusting the pH, heating and inactivating the enzyme to obtain an oligomeric sodium hyaluronate solution; and purifying and drying the oligomeric sodium hyaluronate solution to obtain the oligomeric sodium hyaluronate. According to the preparation method of oligomeric sodium hyaluronate, provided by the invention, hyaluronic acid hydrolase is added in the fermentation process, and enzymolysis is carried out while fermentation is carried out, so that the yield is improved; and an antioxidant is added in the high-temperature inactivation process, so that the purity is improved. The oligomeric sodium hyaluronate obtained by the method has high yield and continuous process, and can directly obtain a target molecular weight product with high activity.)
技术领域
本发明属于生物大分子发酵生产技术领域，涉及一种寡聚透明质酸钠的制备方法，具有涉及一种在发酵过程中降解制备寡聚透明质酸钠的方法。
背景技术
寡聚透明质酸钠相比常规分子量的透明质酸钠在保持较好的保湿特性的基础上还具有良好的透皮吸收特性和大分子透明质酸不具有的生物活性，广泛用于日用品中。常见寡聚透明质酸钠的制备方法有三大缺点，第一，传统透明质酸钠的发酵工艺，在发酵后期（10-12g/L），因为粘度大搅拌困难导致传质传热困难等原因只能停止发酵，导致产量较低，在此基础上酶解透明质酸的成本也会增高。第二，以常规分子量透明质酸再投料进行酶解，溶液体积大，浓度小，生产成本高。第三，常见的两种方法得到固体成品困难：沉淀法体积大浪费大量原料酒精且收率低；喷雾干燥法虽然收率高，但是成品透明质酸钠颜色较差且含量较沉淀法低。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高产量高活性定向分子量寡聚透明质酸钠的发酵制备方法。在透明质酸钠发酵过程中加入透明质酸水解酶，边发酵边酶解，将产量提高至14g/L左右，再经过二次酶解得到固定分子量的寡聚透明质酸钠。该方法提高了发酵产量且工艺连续，酶解后透明质酸的收率高，所得产品活性高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种寡聚透明质酸钠的制备方法，包括以下步骤：
（1）可发酵产生透明质酸的菌种接入发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度140 000-250 000 mPa·s时，添加透明质酸酶，至发酵终点获得发酵液；
（2）调节发酵液的pH，在适温下加入透明质酸酶，反应获得酶解液；
（3）酶解液中加入抗氧化剂，然后调节pH，升温灭活酶，获得寡聚透明质酸钠溶液；
（4）将寡聚透明质酸钠溶液纯化、干燥获得寡聚透明质酸钠。
步骤（1）中，所述透明质酸酶添加量为30-90AU/L发酵液。
所述发酵终点为pH变化小于0.05/min。
优选地，所述可发酵产生透明质酸的菌种选自兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
所述发酵培养基为适于透明质酸发酵，至少含有碳源、氮源、无机盐的发酵液。
步骤（2）中，所述pH为6.0-7.5，所述适温为30-45℃，优选为37-40℃。
步骤（2）中，所述透明质酸酶的添加量根据目的产物的分子量和酶解时间进行调整。优选的，分子量段在5KDa-10KDa，每kg HA添加酶60000-120000AU；分子量段在3KDa-5KDa，每kg HA添加酶120000-150000AU；分子量段在800Da-3KDa，每kg HA添加酶150000-300000AU。
步骤（2）中，所述透明质酸酶的酶解时间为6-9h。
步骤（1）和（2）中，所述透明质酸的来源不限，可以是水蛭来源的、动物来源的，如，水蛭、牛睾丸，也可以是微生物来源的，如重组工程菌发酵获得的。
步骤（3）中，所述抗氧化剂的浓度为0.1%-0.2%w/v。所述抗氧化剂选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾和抗坏血酸及其衍生物中的一种或几种；优选为亚硫酸氢钠。
步骤（3）中，所述pH为4.5-5.6。
步骤（3）中，所述升温的温度为80-120℃，灭活时间为15-60min。
优选的，步骤（4）中，所述纯化包括以下步骤：
（i）寡聚透明质酸钠溶液过滤后，依次加入漂白剂和金属离子螯合剂调节pH进行反应，然后调节pH后进行过滤、浓缩，获得浓缩液；
（ii）在浓缩液中加入氯化钠、调节pH，以乙醇溶液沉淀，沉淀洗涤后抽滤，获得纯品。
步骤（i）中，所述过滤的孔径为0.22-0.45μm。
步骤（i）中，所述漂白剂的加入量为0.1%-0.2% w/v。所述金属离子螯合剂的加入量为0.1%-0.2%w/v。
步骤（i）中，所述漂白剂为次氯酸钠、双氧水或活性炭中的一种；优选为次氯酸钠。所述金属离子螯合剂为EDTA、EDTA二钠或EDTA二钾。
步骤（i）和（ii）中，所述pH均为6.0-7.5。
步骤（i）中，所述浓缩优选为超滤浓缩，超滤的孔径为根据目的产品的不同而选择，如，分子量段在5KDa-10KDa，可以使用500Da的超滤膜；分子量段在3KDa-5KDa，可以使用300Da的超滤膜；分子量段在800Da-3KDa，可以使用300Da的反渗透膜。
步骤（ii）中，所述氯化钠加入量为4%-6%w/v。
步骤（ii）中，所述乙醇溶液浓度为90-100%v/v。
步骤（ii）中，所述洗涤的溶剂为90-100%v/v乙醇溶液。
一种上述制备方法获得的寡聚透明质酸钠。
本发明具有以下优点：
本发明提供的寡聚透明质酸钠的制备方法，在发酵过程中加入透明质酸水解酶，边发酵边酶解，将产量提高至14g/L，再经过二次酶解得到固定分子量的寡聚透明质酸钠；高温灭活过程中加入抗氧化剂保护透明质酸钠。该方法提高了发酵产量，酶解后透明质酸的收率高、工艺连续，直接获得目标分子量产物，所得产品活性高。
附图说明
图1是不同处理组模型组织形态。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 5KDa-10KDa透明质酸钠的制备
（1）在40L发酵罐中，将兽疫链球菌接入30L发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度210 000 mPa·s时添加透明质酸酶1200AU，发酵至pH变化小于0.05/min，停止发酵，获得发酵液，硫酸咔唑法检测透明质酸钠含量为13.5g/L；
（2）调节发酵液的pH为6.5，在37℃下加入透明质酸酶30000AU，反应7.5h获得酶解液；
（3）酶解液冷至室温，加入60g亚硫酸氢钠，然后调节pH至4.5，升温至80℃保持30min灭活酶，获得寡聚透明质酸钠溶液；
（4）寡聚透明质酸钠溶液0.45μm滤板过滤后，依次加入150g次氯酸钠溶液（30%w/v）和40g EDTA二钠，加水至40L，调节pH至8.0后30℃搅拌30min，调节pH至6.5后0.22μm滤板过滤、以500Da的超滤膜进行超滤浓缩，获得浓缩液4L；
（5）在浓缩液中加入160g氯化钠、调节pH至6.5，倒入16L浓度95% v/v的乙醇溶液搅拌产生沉淀，静置30min，去上清后沉淀再加入4L浓度95%v/v乙醇溶液搅拌洗涤30min，重复至上清液酒精度＞90，然后抽滤，65℃真空干燥，得345g纯白色产品，平均分子量8KDa，收率85%，含量98%。
实施例2 3KDa-5KDa透明质酸钠的制备
（1）在40L发酵罐中，将兽疫链球菌接入30L发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度195 000 mPa·s时添加透明质酸酶1350AU，发酵至pH变化小于0.05/min，停止发酵，获得发酵液，硫酸咔唑法检测透明质酸钠含量为13.7g/L；
（2）调节发酵液的pH为6.5，在40℃下加入透明质酸酶48000AU，反应8h获得酶解液；
（3）酶解液冷至室温，加入40g抗坏血酸，然后调节pH至5.0，升温至100℃保持20min灭活酶，获得寡聚透明质酸钠溶液；
（4）寡聚透明质酸钠溶液0.45μm滤板过滤后，依次加入80g活性炭和40g EDTA，加水至40L，调节pH至8.0后30℃搅拌30min，调节pH至6.8后0.22μm滤板过滤、以300Da的超滤膜进行超滤浓缩，获得浓缩液2L；
（5）在浓缩液中加入160g氯化钠、调节pH至6.5，倒入24L浓度为90% v/v的乙醇溶液沉淀搅拌产生沉淀，静置30min，去上清后沉淀再加入4L浓度95%v/v乙醇溶液搅拌洗涤30min，重复至上清液酒精度约为90，然后抽滤，65℃真空干燥，得332g纯白色产品，平均分子量4.5KDa，收率80%，含量99%。
实施例3 800Da-3KDa透明质酸钠的制备
（1）在40L发酵罐中，将兽疫链球菌接入30L发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度180 000 mPa·s时添加透明质酸酶1800AU，发酵至pH变化小于0.05/min，停止发酵，获得发酵液，硫酸咔唑法检测透明质酸钠含量为13.4g/L；
（2）调节发酵液的pH为6.5，在37℃下加入透明质酸酶60000AU，反应7h获得酶解液；
（3）酶解液冷至室温，加入70g亚硫酸氢钾，然后调节pH至5.6，升温至120℃保持15min灭活酶，获得寡聚透明质酸钠溶液；
（4）寡聚透明质酸钠溶液0.45μm滤板过滤后，依次加入120g双氧水（50%w/w）和60gEDTA二钾，加水至40L，调节pH至8.0后30℃搅拌30min，调节pH至6.5后0.22μm滤板过滤、以300Da的反渗透膜进行浓缩，获得浓缩液2L；
（5）在浓缩液中加入160g氯化钠、调节pH至6.5，倒入24L浓度为90% v/v的乙醇溶液沉淀搅拌产生沉淀，静置30min，去上清后沉淀再加入4L浓度95%v/v乙醇溶液搅拌洗涤30min，重复至上清液酒精度＞90，然后抽滤，65℃真空干燥，得302g纯白色产品，平均分子量1.2KDa，收率75%，含量98%。
对比例1
在40L发酵罐中进行透明质酸发酵，发酵液体积为30L，动力粘度为140 000mPa·s、150000 mPa·s、160000 mPa·s、170000-250000 mPa·s时，加入透明质酸酶1800AU，发酵结束后硫酸咔唑法检测透明质酸钠含量分别为0g/L、10.4g/L、11.4g/L、13.0-14.1g/L，按照常规方法纯化沉淀得到产品13g、314g、342g、390-420g。动力粘度高于250 000Pa·s时，粘度过大，搅拌发酵无法继续。
由此可见，当粘度低于150000mPa·s时，透明质酸酶的加入会影响正常的发酵过程，造成产量过低；当粘度高于250 000Pa·s时，搅拌无法继续造成传质传热困难，影响透明质酸酶解效果。
对比例2
按照实施例1中的原料比例和步骤进行发酵、酶解和纯化，不同在于，步骤（3）中不加入抗氧化剂，最终得到产品347g，平均分子量8KDa，收率85.5%，含量91.5%，颜色为暗黄色。这说明，在寡聚透明质酸钠纯化过程中添加抗氧化剂有助于抑制纯化过程中的产品降解，有利于提高收率和产品含量。
对比例3 以大分子透明质酸为原料制备5KDa-10KDa透明质酸钠
取与实施例1中相同菌种同样发酵培养基中发酵生产的平均分子量为80kDa的透明质酸钠400g，溶于40L水，完全溶解后加入30000AU透明质酸酶，调节pH至6.5、37℃下搅拌酶解8h，80℃灭活30min，获得酶解液，然后按照实施例1中的纯化方式进行纯化、浓缩、干燥，获得平均分子量为8KDa的寡聚透明质酸钠288g，其中沉淀使用酒精200L，收率72%，颜色为白色，硫酸咔唑法测定含量92%。这说明，采用发酵过程中添加透明质酸酶降解的方法比传统的制备大分子透明质酸后再酶解的方法收率高，纯度高，而且耗费酒精少。
实施例4 产品效果
对上述实施例、对比例中的产品进行抗敏、抗炎、屏障损伤修复活性比较，以市售酸解法制备的寡聚透明质酸钠为对照（山东众山生物科技有限公司生产，含量98%，平均分子量8.1KDa，简称为酸解HA）。各样品浓度均按照寡聚透明质酸钠含量计算。
1.抗敏功效检测
采用C48/80刺激肥大细胞模型，通过肥大细胞脱颗粒率的形态学观察和脱颗粒率来评价样品的舒敏功效，按照下表进行实验分组：
按照以下步骤进行测定：按1.5×105个/孔的接种密度接种肥大细胞至24孔板，37℃、5%CO2、95%RH条件下孵育；待24孔板中细胞铺板率达到40%-60%时进行给药，空白对照组给药量为1mL，其他组每孔给药量为900μL，每组设3个复孔。原条件下继续培养2h；然后，每孔加入100μL相应的受试物工作液、阴性对照工作液和阳性对照工作液配制的100μg/mlC48/80母液，并摇动孔板，使得孔内液体混匀，然后将孔板置于原条件下继续培养45min；将24孔板放置在0℃冰水浴中冷浸10min终止反应，于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照(20×)；按照以下公式计算结果：脱颗粒率=脱颗粒细胞数/所有细胞数×100%。
结果如表1所示：与空白组相比，阴性组肥大细胞脱颗粒率明显上升，说明本次实验C48/80刺激条件有效。与阴性组相比，阳性组肥大细胞脱颗粒率现象被显著抑制，说明本次实验有效。实施例1，对比例2，对比例3和酸解HA四组与阴性组相比，在7.81μg/mL浓度下，肥大细胞脱颗粒率明显下降，且实施例1下降最明显，说明相同分子量下本发明制备的透明质酸抗敏活性最好。实施例1，实施例2和实施例3相比，脱颗粒率越来越低，说明本方法制备的寡聚透明质酸分子量越小，抗敏活性越高。
表1 不同处理的舒敏效果
2.抗炎功效检测
选用UVB刺激角质形成细胞建立皮肤炎症损伤体外模型，通过检测炎症因子TNFα、IL-α表达情况来评价样品的抗炎功效，按照下表进行实验分组：
按照以下步骤进行测定：按1.5×105个/孔的接种密度接种细胞至24孔板，37℃、5%CO2、95%RH条件下孵育；待24孔板中细胞铺板率达到40%-60%时进行给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。原条件下继续培养24h；然后，PBS清洗细胞后，根据实验分组，对有UVB照射的组别进行300mJ/cm2的UVB辐照，然后将孔板置于原条件下继续培养24h；收集24孔板中的上清液于EP管中，置于-80℃冰箱保存。根据各炎症因子的ELISA检测试剂盒的操作说明书进行TNFα、IL-lα含量检测。
表2 不同处理细胞上清液中TNFα、IL-lα含量
结果如表2所示：与空白组相比，阴性组TNFα、IL-lα含量明显上升，说明本次实验刺激条件有效。与阴性组相比，阳性组TNFα、IL-lα含量明显下降，说明本次实验有效。实施例1，对比例2，对比例3和酸解HA四组与阴性组相比，在1000μg/mL浓度下，TNFα、IL-lα含量明显下降，且实施例1下降最明显，说明相同分子量下本发明制备的透明质酸抗炎活性最好。实施例1，实施例2和实施例3相比，TNFα、IL-lα含量越来越低，说明本方法制备的寡聚透明质酸分子量越小，抗炎活性越高。
3.屏障损伤修复功能检测
采用SLS（十二烷基硫酸钠）刺激3D皮肤模型(EpiKutis®)，模拟人体斑贴实验构建“SLS-EpiKutis皮肤刺激性损伤模型。采用表面给药的方式，将样品模拟人体使用过程，均匀涂布于实验构建的“SLS-EpiKutis”皮肤刺激性损伤模型表面，通过检测模型组织形态学结构变化及屏障相关蛋白，评价样品促进“SLS-Epikutis”刺激性损伤屏障修复的功效，按照下表进行实验分组：
按照以下步骤进行测定：根据上表实验设计，将模型转移到6孔板中(提前添加0.9mL模型培养液)，在6孔板上标注测试组编号。取配置好的不同组样品液25μL加于模型表面，轻轻抖动模型，使样品均匀分布于模型表面，置于CO2培养箱(37℃、5%CO2、95%RH)中孵育24h。孵育结束后，用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。将用于组织形态观察的模型用4%的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，将模型环切取下，进行H&E染色处理，显微镜下拍照观察，采集图片观察组织形态（图1）。将用于FLG、LOR和CD44免疫组化检测的模型，依次石蜡包埋切片，前处理（脱蜡、水化、抗原修复、阻断过氧化物酶），血清封闭、分别滴加一抗、二抗孵育，ABC复合物孵育，染色（DAB染色、苏木素复染），脱水获得切片，应用图像分析系统测定其积分光密度（IOD）值。
表3 不同处理FLG、LOR和CD44积分光密度（IOD）值
结果如图1和表3所示：与空白组相比，阴性组表皮模型角质层疏松增厚，活细胞层受损、有空泡出现，说明SLS刺激条件有效。与阴性组相比，阳性(WY14643)组模型四层结构边界清晰，活细胞层细胞排列紧凑，角质层疏松增厚现象明显改善，说明本次检测体系有效。与阴性组相比，实施例1组和酸解HA组模型四层结构边界清晰，活细胞层受损情况显著改善，角质层疏松增厚现象也显著缓解；由此可知，实施例1组和酸解HA组在10mg/mL的浓度下，对SLS造成的3D表皮模型形态学损伤具有一定的修复功效。
与空白组相比，阴性组FLG、LOR和CD44蛋白含量显著下降，说明本次实验刺激条件有效。与阴性组相比，阳性组FLG、LOR和CD44蛋白含量显著提升，说明本次实验有效。实施例1组分别与阴性对照组和酸解HA组相比，FLG、LOR和CD44蛋白含量显著提升。说明本方法制备的小分子透明质酸具有较好的屏障修复修复活性。
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