新autotac嵌合化合物及包含其的通过靶向的蛋白质降解来预防、改善或治疗疾病的组合物
阅读说明：本技术 新autotac嵌合化合物及包含其的通过靶向的蛋白质降解来预防、改善或治疗疾病的组合物 (Novel AUTOTAC chimeric compounds and compositions comprising the same for preventing, ameliorating or treating diseases through targeted protein degradation ) 是由 权容兑 池昌勋 斯利尼瓦斯劳·甘尼皮瑟蒂 金希妍 文修兰 郑灿勋 郑宜静 成基云 于 2019-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种自噬靶向性嵌合(AUTOTAC)化合物,其中新颖的p62配体和靶结合配体通过连接子连接,或者该AUTOTAC化合物的立体异构物、溶剂化物、水合物或前药；以及包含其作为活性成分的用于通过靶向蛋白降解来预防或治疗疾病的药物组合物或食品组合物。本发明不仅允许采用靶向的特定蛋白质的浓度调节,而且允许将药物和其它低分子量化合物递送至溶酶体。根据本发明的AUTOTAC化合物选择性移除特定蛋白质且因此可有用地用作预防、改善或治疗各种疾病的药物组合物。(The present invention relates to an autophagy-targeting chimeric (AUTOTAC) compound, wherein a novel p62 ligand and a target binding ligand are linked by a linker, or a stereoisomer, solvate, hydrate or prodrug of the AUTOTAC compound; and a pharmaceutical composition or food composition for preventing or treating diseases by targeted protein degradation comprising the same as an active ingredient. The present invention not only allows for concentration modulation of specific proteins that are targeted, but also allows for the delivery of drugs and other low molecular weight compounds to lysosomes. The AUTOTAC compound according to the present invention selectively removes a specific protein and thus may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating various diseases.)
技术领域
本发明涉及一种新颖的嵌合化合物，特别是其中p62配体和靶结合配体通过连接子连接的嵌合化合物；以及包含其的用于通过靶向的蛋白降解来预防或治疗疾病的药物组合物或食品组合物。
背景技术
N端规则路径为蛋白分解系统，其中蛋白质的特定N端残基充当降解信号。N端规则降解信号通过包括N端精氨酸(Nt-Arg)、赖氨酸(Nt-Lys)及组氨酸(Nt-His)的I型碱性残基；以及包括苯丙氨酸(Nt-Phe)、亮氨酸(Nt-Leu)、色氨酸(Nt-Trp)、酪氨酸(Nt-Tyr)及异亮氨酸(Nt-Ile)的II型疏水性残基来例示。这些N端残基与特定N识别子(下文称作N配体)结合。本发明发明人首次发现或克隆了先前已知的N识别子，即UBR1、UBR2、UBR4及UBR5，并发现它们利用UBR盒作为底物识别结构域(Tasaki,T.等，Mol Cell Biol 25,7120-36(2005))。发明人还发现，UBR盒与诸如N端精氨酸残基的I型N端规则配体(Nt-Arg、Nt-Lys、Nt-His)结合以识别底物且将泛素链连接至该底物。进一步发现UBR1及UBR2具有在2型N端规则配体(Nt-Trp、Nt-Phe、Nt-Tyr、Nt-Leu及Nt-Ile)的结合中起重要作用的N结构域(Sriram,S.M.,Kim,B.Y.&Kwon,Y.T.,Nat Rev Mol Cell Biol 12,735-47(2011))。由N识别子与N端规则配体之间的结合产生的泛素化底物被递送至蛋白酶体，该泛素化底物在其中被降解成短肽。在此过程中，特定N端残基(Nt-Arg、Nt-His、Nt-Lys、Nt-Trp、Nt-Phe、Nt-Tyr、Nt-Leu、Nt-Leu)为结合的基本决定因素，因为N识别子提供靶向N端规则底物所需氢键的大部分(Sriram,S.M.&Kwon,Y.T.,Nat Struct Mol Biol 17,1164-5(2010))。
胞内蛋白质降解主要是通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)及自噬-溶酶体系统进行。一般来说，UPS会调节正常折叠的调节子的胞内浓度，或降解错误折叠及已丧失其功能的蛋白质。此时，底物会被估计约500至1,000个E3连接酶直接或间接地识别并泛素化，然后被去折叠成多肽螺旋并被蛋白酶体降解(Ji and Kwon,Mol Cells 40,441-449(2017))。在正常细胞中，泛素-蛋白酶体系统的过程是顺利的，但疾病相关的蛋白质会变成折叠不正确的错误折叠蛋白质，或者错误折叠蛋白质累积产生的聚集体会阻断蛋白酶体的功能，或者蛋白酶体功能在老化过程中下降，或者与疾病相关的蛋白质的降解由于蛋白质转录和翻译的重新编程而无法顺利进行(Ciechanover,A.&Kwon,Y.T.,Exp Mol Med 47,e147(2015))。在代表性实例中，蛋白质构象病(阿兹海默氏症、亨廷顿氏症、帕金森氏症、人疯牛症、葛雷克氏病(Lou Gehrig's disease)/肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、角膜病变、2型糖尿病等等)的各自的主要病理蛋白质是被错误折叠、泛素化并且累积，而这些多余的蛋白质废物被转换回聚集体(Aguzzi and O’Connor,Nat Rev Drug Discov 9,237-48(2010))。这些特定突变蛋白质具有被转化成聚集体的强特性，因此不会被降解进入如上所述的蛋白酶体。其原因在于，因为蛋白酶体具有约13埃的窄内径，所以必须将错误折叠蛋白质去折叠，但当蛋白质聚集时其无法去折叠。在另一代表性实例中，已知癌细胞会通过重新编程胞内转录和翻译而增加致癌蛋白质的转录和翻译同时抑制降解(Xiong等，J CellPhysiol 234,14031-14039(2019))。此外，由于泛素-蛋白酶体系统，形成复合物的亚基蛋白及跨膜蛋白的降解也受到限制。
自噬(autophagy)是除了UPS(泛素-蛋白酶体系统)之外的主要胞内蛋白质降解系统。自噬为通过降解衰老或受损细胞的细胞器或损伤或非正常折叠的蛋白质及其聚集体来基本维持细胞体内平衡及基因稳定性的蛋白质降解过程(Ji和Kwon,Mol Cells 40,441-449(2017))。特别地，当病例蛋白质及其聚集体在细胞质中累积时，其可能变为细胞毒素物质，且因此应该通过自噬来接收且降解。自噬的机制主要划分成大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)及伴随蛋白介导的自噬，且其视降解胞内底物的目的而划分成主体自噬及选择性自噬(Dikic,I.&Elazar,Z.,Nat Rev Mol Cell Biol 19,349-364(2018))。其中，选择性自噬及伴随蛋白介导的自噬引起非所需胞内蛋白质及功能异常细胞器选择性降解。通过诱导选择性自噬，基于累积病理学上错误折叠蛋白质及功能异常细胞器的疾病的新疗法的发展目前正在建立新的范例。p62/SQSTM1/Sequestosome-1蛋白对于启动在选择性自噬的机制中作为介质的自噬小体的形成且递送内含物而言至关重要。此时，p62蛋白与病理蛋白质及其聚集体结合，其随后被递送至自噬小体。p62在将病理蛋白质递送至自噬小体时作为关键过程经历自身寡聚合((Dikic,I.&Elazar,Z.,Nat Rev MolCell Biol 19,349-364(2018))。此时，将病理蛋白质浓缩在一起以减少体积，由此利用自噬促进降解。PB1区域调节p62的自身寡聚合，但其调节机制不熟知。递送至自噬小体的错误折叠蛋白质-p62共轭物可在自噬小体与溶酶体结合时利用溶酶体酶降解。
通过上文所描述的机制，自噬对于通过调节损伤蛋白质及细胞的细胞器中的胞内变化来维持细胞体内平衡至关重要。当自噬功能减弱时，其导致错误折叠蛋白质累积及聚集，从而产生蛋白质构象病或癌症。在活化整体自噬以治疗这些疾病方面的研究持续积极地进行(Ciechanover,A.&Kwon,Y.T.,Exp Mol Med 47,e147(2015))。一般抑制整体自噬的调节物是mTOR。使用mTOR抑制剂活化自噬的方法是最广为使用的(Jung,C.H.,Ro,S.H.,Cao,J.,Otto,N.M.&Kim,D.H.,FEBS Lett 584,1287-95(2010))。具体而言，通过使用雷帕霉素(rapamycin)治疗，在过表达APP的AD动物模型中，可消除淀粉样蛋白β(Ab)及tau蛋白，同时改善认知能力(Caccamo,A.,Majumder,S.,Richardson,A.,Strong,R.&Oddo,S.,JBiol Chem 285,13107-20(2010))；在过表达tau蛋白的AD动物模型中，可消除tau蛋白(Rodriguez-Navarro,J.A.et al.,Neurobiol Dis 39,423-38(2010))；以及在PD小鼠模型中，可消除过表达的突变α-突触核蛋白聚集体(Webb,J.L.,Ravikumar,B.,Atkins,J.,Skepper,J.N.&Rubinsztein,D.C.,J Biol Chem 278,25009-13(2003))。在HD小鼠中证实，使用CCI-779(一种雷帕霉素类物质)有效地消除了亨廷顿蛋白聚集体，而且改善了动物行为及认知能力(Ravikumar,B.,Duden,R.&Rubinsztein,D.C.,Hum Mol Genet 11,1107-17(2002))。然而，mTOR在包括NF-kB在内的各种胞内途径中起非常重要的作用。因此，虽然其在消除蛋白质构象病的错误折叠蛋白质聚集体方面展现极佳的活性，但在使用这些已知mTOR是药物靶标的整体自噬活化剂作为治疗剂方面存在着限制。此外，没有有效的自噬小体靶向疗法和靶向疾病诱导性蛋白质的治疗剂。
在中心法则中，储存在DNA中的遗传信息被转录成RNA并翻译成蛋白质，以调节细胞功能。对于DNA，可使用DNA编辑技术如CRISPR进行靶切割；对于RNA，可使用siRNA进行靶降解。然而，对于蛋白质，靶向降解技术相对地有限。假如可通过靶向疾病诱导性蛋白质而将其降解，则其可作为用于药物工业中的药物开发的平台技术。PROTAC(蛋白质水解靶向嵌合体)是一种开发用于产生胞内降解靶蛋白质的技术。PROTAC使用具有识别靶蛋白质的配体与识别E3泛素酶的配体的嵌合化合物(An和Fu,EBioMedicine 36,553–562(2018))。当该靶结合体与疾病诱导性蛋白质结合且将其带靠近E3时，E3识别为底物并进行泛素化以诱导蛋白酶体降解。因为现有的疾病治疗范例是蛋白酶抑制，因此开发针对无法被现有治疗剂靶向的蛋白质的新疗法非常重要。就这些角度而言，对于无法被传统酶抑制方法靶向的蛋白质，能够在泛素-蛋白酶体系统下选择性降解蛋白质的PROTAC是一种具有吸引力的新疗法开发方法。然而，PROTAC仅利用会识别E3泛素酶的配体来引起蛋白酶体降解，因此当靶蛋白质错误折叠而形成聚集体、或形成复合物或结合至膜结构时，则很难将其降解(Bondeson等，Cell Chem Biol 25,78-87.e5(2019))。此外，PROTAC无法降解诸如内质网及线粒体等细胞器，以及诸如病毒及细菌等病原体。因此，需要开发一种可靶向病理蛋白质、细胞器及聚集体并将其等递送至选择性自噬的方法。
为了调节细胞功能，广泛地使用通过编辑DNA或降解RNA来间接调节蛋白质活性及浓度的方法。特别是，使用siRNA使得RNA能够靶降解，但siRNA具低细胞渗透性，且使用转染试剂等递送至细胞内。因此，该方法复杂且昂贵。再者，假如靶蛋白质很稳定，则即使降解RNA仍很难降低蛋白质的浓度。因此，必须开发一种可通过靶向特定蛋白质而直接降解的方法或物质(即蛋白质降解剂)。
发明内容
传统药物如小分子合成化合物、抗体、蛋白质、肽等各不相同，但基本原理是结合特定蛋白质的活性位置，抑制致病性蛋白质的活性，从而展现药物功效。这些传统药物开发方法具有某些限制。首先，需要高的药物浓度，这可能引起药物的副作用。因为药物-蛋白质结合不是稳定的共价键，所以该结合可能断开。即，药物在与靶蛋白质结合时会展现药物功效，而药物与靶蛋白质分开时不会展现药物功效。因此，为维持药物功效，必须在全身维持高药物浓度。然而，为了药物功效而增加药物浓度使得药物可以结合其它非预期的蛋白质，而这种情况可能导致药物副作用。其次，药物靶蛋白质有限。迄今，美国食品药物管理局(FDA)许可了大约400种的药物靶蛋白质。这些超过90％是酶、发送蛋白、通道/膜蛋白等等。因为这些药物靶蛋白质具有活性位点和结合位点，所以相对容易用相对传统的药物开发方法找到。然而，估计存在3,000种与疾病相关的蛋白质，而目前仅约13％的许可药物用于此靶标。因此，有必要转移新药物开发范式，且当使用靶蛋白质降解技术时，其具有优于现有治疗剂的以下优点。首先，因为其可降解转录因子、通过蛋白质结合参与信号传导的蛋白质以及聚集与累积的蛋白质如tau蛋白，所以其能调节很难用传统药物靶向的无法施药的蛋白质。其次，其能克服其中靶蛋白质过表达及过度活化或具药物耐受性或者药物功效因其它信号传导系统的活化而降低的现象。第三，因为靶蛋白质降解材料在降解靶蛋白质后被重复使用，所以可以低剂量施用，并且还可降低与其相关的副作用。第四，因为降解及重新产生靶蛋白质需要特定的时间，所以施用周期增加且经济效益高。
为了解决上述现有治疗剂的问题，本发明的目的是提供一种新颖的AUTOTAC(自噬靶向嵌合体)化合物，其中诱导p62蛋白的活化和寡聚合的新颖的p62配体化合物与靶结合配体经由连接子连接(图1)。
本发明的另一目的是提供一种包含前述AUTOTAC化合物作为活性成份的用于消除疾病诱导性蛋白质的药学或食品组合物。
本发明的又一目的是提供一种用于实现胞内靶蛋白质的降解的生化筛选方法及技术。
为了达到以上的目的，本发明的一个实施方式提供新颖的AUTOTAC嵌合化合物，其中结合p62的ZZ结构域的配体与靶结合配体由连接子连接。
本发明的另一实施方式提供(1)诱导p62寡聚合及结构活化的方法；(2)增加p62-LC3结合的方法；(3)将p62及靶蛋白质递送至自噬小体的方法；(4)活化自噬小体生物合成的方法；(5)靶向靶蛋白质并将其递送至自噬的方法；(6)靶向靶蛋白质并使其失活的方法；和(7)通过溶酶体降解靶蛋白质的方法。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于预防或治疗疾病的药物组合物或保健功能食品，其含有前述的AUTOTAC嵌合化合物作为活性成份。优选地，该疾病不仅包括癌症或退行性脑疾病，而且包括靶向降解某些蛋白质时预期具有治疗效果的其它疾病，如罕见难治的疾病。
本发明的核心技术在于：(1)使用AUTOTAC材料连接靶蛋白质与p62，(2)诱导p62的自身寡聚，(3)使靶蛋白质与p62形成复合物，从而以生物学方式使该靶蛋白质失活，(4)随后将该靶蛋白质-p62复合物递送至自噬膜(诸如吞噬泡(phagophore))，以及(5)在溶酶体中降解该靶蛋白质-p62复合物。
本发明的药代动力学及核心技术总结在图1中。
具体而言，如图1所示，AUTOTAC嵌合化合物具有如下结构，其中靶结合配体(TBL)与p62 ZZ结构域配体(即，自噬靶向配体(ATL))通过连接子连接。其通过该靶配体与靶蛋白质结合，而所述自噬靶向配体在与p62 ZZ结构域(其为自噬受体)结合后进行寡聚合。随后，p62通过结合至从自噬小体膜突出的LC3而被自噬靶向，然后该靶蛋白质在溶酶体中降解。在本发明中，尝试通过使用可与p62 ZZ结构域结合的小分子配体来活化p62，以有效地消除靶蛋白质。目前为止，存在使用泛素蛋白酶体系统(UPS)来靶向蛋白质降解的PROTAC化合物，但还没有关于使用自噬来降解靶蛋白质的低分子量化合物的报告。当使用不同于PROTAC的自噬时，不仅能够降解无法通过PROTAC降解的蛋白质，例如错误折叠蛋白质聚集体、膜结合蛋白质和复合物的亚基，而且可降解胞内结构(发炎体、应激颗粒(stressgranule)等)、细胞器(内质网、线粒体、过氧化物酶体等)及侵犯细胞的病原体(病毒、细菌等)。通过这种靶降解，可以预期在各种疾病中的预防和治疗效果。
p62蛋白对于启动自噬小体(其是选择性自噬机制中的介导体)的形成及内容物(即靶蛋白质)的递送很重要。已观察到，根据本发明的新颖的AUTOTAC嵌合化合物通过p62活化来诱导p62的自身寡聚。此外，证实通过此自身寡聚，靶蛋白质被递送到自噬小体，由此靶蛋白质在溶酶体中降解。
因为根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物不仅会引起胞内自噬，还会引起自噬小体靶向靶蛋白质，因此能够在自噬机制下选择性降解无法被传统酶抑制方法靶向的蛋白质，其可提供新颖的治疗剂。
根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物具有如下结构，其中靶结合配体(TBL)与结合至p62蛋白ZZ结构域的配体(即自噬靶向配体(ATL))通过连接子连接。通过自噬靶向配体活化自噬，将该靶蛋白质带至自噬小体并在溶酶体中将其降解。
本发明是能够在将待降解的蛋白质的配体连接至自噬靶向配体-连接子时降解期望的靶蛋白质的平台技术，因此可用作预防、改善及治疗各种疾病的药物。
附图说明
图1显示如下示意图，其显示根据本发明的新颖的AUTOTAC嵌合化合物的构造并且显示该化合物与p62蛋白结合且同时与靶蛋白质、细胞器及聚集体结合，后者被递送至自噬小体(其是通过p62蛋白的大自噬的介导体)，最后被溶酶体降解。
图2a、2b及2c是显示AUTOTAC化合物的相应p62蛋白的寡聚合及高分子量聚集功效的免疫印迹测定结果。这显示p62蛋白的寡聚合及高分子量聚集作用随着该化合物的处理而增加。免疫印迹显示来自三个以上独立实验的代表性结果。
图3是显示相应的靶蛋白质被根据本发明的AUTOTAC化合物降解的功效的免疫印迹测定结果。这显示出靶蛋白质水平随着该化合物的处理而减少。免疫印迹显示来自三个以上独立实验的代表性结果。
图4a及4b是显示相应靶蛋白质的降解功效机制由根据本发明的AUTOTAC化合物通过自噬-溶酶体途径介导的免疫印迹测定结果。这显示出靶蛋白质水平经由所述化合物的处理而减少，而当用作为自噬-溶酶体途径的抑制剂的羟氯喹(HCQ)处理时，靶蛋白质水平再次增加。免疫印迹显示来自三个以上独立实验的代表性结果。
图5a、5b及5c是显示本发明的AUTOTAC嵌合化合物的靶蛋白质降解功效分别优于单独p62配体或靶结合配体的靶蛋白质降解功效的免疫印迹测定结果。这显示出相较于用p62配体或靶蛋白质配体处理后，用AUTOTAC嵌合化合物处理后的靶蛋白质水平显著地减少。免疫印迹显示来自三个以上独立实验的代表性结果。
图6a、6b及6c是显示由根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物将靶蛋白质与p62蛋白一起递送至自噬的功效的免疫荧光染色测定结果。其可证实在用所述化合物处理后，胞内荧光斑点(puncta)以及靶蛋白质和p62蛋白与该AUTOTAC化合物的共存逐渐增加。
具体实施方式
下文将更详细地描述本发明。
本发明提供一种嵌合化合物，其包含p62配体(自噬靶向配体，ATL)、靶结合配体(TBL)和连接子；以及一种使用前述化合物将靶蛋白质、细胞器及聚集体与p62一起递送至自噬小体(其是大自噬的介导体)并将在溶酶体中降解的方法。通过这种方法，本发明提供一种用于通过将致病性蛋白质、细胞器及聚集体递送至自噬并将其降解来预防、改善或治疗疾病的方法，以及一种包含上述复合物(下文也称作“嵌合化合物”)的用于与疾病相关的病理蛋白质、细胞器及聚集体的自噬活化及用于预防、改善或治疗所述疾病的组合物。
本发明人发现，通过使用p62配体，该p62配体可活化自噬，有效地将靶蛋白质、细胞器及聚集体递送至自噬小体并消除它们。发明人还发现，当将该配体与能够结合以上病理蛋白质的配体组合使用时，其表现出非常优异的病理蛋白质及聚集体消除功效，且不同于常规PROTAC化合物，不需要为了形成三元复合物(靶蛋白质-连接子-E3连接酶配体)针对病理蛋白质折叠、E3连接酶选择性及有效的降解而优化连接子的长度。本发明人开发的其中p62配体与结合至靶蛋白质的靶结合配体通过连接子连接的新颖的嵌合化合物命名为AUTOTAC(AUTOphagy Targeting Chimera，自噬靶向嵌合体)。
本发明的特征是能够通过将待降解的蛋白质的配体连接至与p62配体连接的连接子来降解期望蛋白质的技术。即，其中p62配体与靶结合配体由连接子连接的嵌合化合物是一种双功能小分子，且靶蛋白质(会在与蛋白质的自噬相关的p62附近降解)与靶向它们的配体结合，从而形成可易于降解该靶蛋白质的结构。本发明的要点在于，通过将与需要预防或治疗的各种疾病相关的蛋白质与p62连接，并降解所关注的靶蛋白质，预期达到治疗效果。
在一个优选实施方式中，根据本发明的包含p62配体、靶结合配体及连接子的嵌合化合物具有其中该p62配体与该靶结合配体通过连接子连接的嵌合化合物形式，更优选地，其可具有以下化学式1的结构。
[化学式1]
其中，A代表靶结合配体，B代表p62配体。在化学式1中，A与B可分别连接至至少一个连接子。
在本发明中，靶结合配体是与体内的特定靶蛋白质(更具体地，待靶向的引起疾病的病理蛋白质)或者细胞器或聚集体结合的配体。这些靶蛋白质包括但不限于优选地与癌症相关的蛋白质及与各种蛋白质构象性疾病相关的蛋白质。这些靶结合配体在使用上没有特定的限制，只要它们是可与待预防、改善及治疗的疾病相关的蛋白质、优选与由病理蛋白质引起的疾病、癌症、蛋白质构象性疾病、顽固性疾病或遗传疾病相关的靶蛋白质、细胞器或聚集体结合的那些即可。具体实施方式可包括但不限于选自于由以下表1所示的化合物所组成的组中的一或多个，或从这些结构衍生出的衍生结构。
所述“衍生”结构是指其中靶结合配体的一部分结构通过与连接子结合而修饰的结构(例如，靶结合配体与连接子的连接部分因取代基中的羧基与具有氨基的连接子结合产生的酰氨基团而改变)。
[表1]
化学式1中连接A与B的连接子在使用上没有特别限制，只要其具有其中A与B二者在结构上相连的结构即可。例如，此连接子可为-Q-(CH2CH2O)x-(CH2)y-P-或-Q-(CH2CH2CH2O)x-(CH2)y-P-或-Q-(CH2CH2NH)x-(CH2)y-P-或-Q-(CH2CH2CONH)x-(CH2)y-P-(其中,Q包括-NH-、-O-、＝N--N(CH3)-，其是通过与靶结合配体结合而修饰的部分；P包括-NH-、-O-、-CH2-、-C(＝O)-，其是通过与p62配体结合而修饰的部分；x是0至4的整数；且y是0至3的整数)，但不限于此。优选地，P与p62配体间的键可为-CONH-、-O-、-NH-、-NHCO-或-COO-，为了形成此键，可对p62配体的一部分(例如，Rc部分和靶结合配体的部分)进行结构修饰，这些修饰方法是本领域公知的。
在本发明中，p62配体是指p62，更具体地，与p62的ZZ结构域结合的材料。由于与p62 ZZ结构域结合，这些p62配体可增加p62的寡聚合及活化自噬，特别是大自噬。在优选实施方式中，该p62配体可具有以下化学式2的结构。
[化学式2]
其中,
W是C6-C10芳基；
L是-(CH2)n1-或-O-(CH2)n2-CH(OH)-，条件是-O-(CH2)n2-CH(OH)-中的O与苯环键合，其中n1是1至4的整数；
n2是1至4的整数；
m是0至2的整数；
Ra是R1或-OR1，
其中R1是氢或-(CH2)n3-R'1，
R'1是未经取代的苯基或经羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、硝基、氨基、(C1-4烷基)氨基或二(C1-4烷基)氨基取代的苯基，
n3是1至6的整数；
Rb是-OR2，
其中R2是氢或-(CH2)n4-R'2，
R'2是未经取代的苯基或经羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、硝基、氨基、(C1-4烷基)氨基或二(C1-4烷基)氨基取代的苯基，
n4是1至6的整数；
Rc是-(CH2)n5-OH、-(CH2)n5-NH-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NH2、-CH(R3)-COOH或-CH(COO-R4)-CH2CH2CH2-NH-C(＝NH)NH2、-(CH2)n5-O-(CH2)n5-OH、-CONH(CH2)n5-OH、-CO(CH2)n6-OH、-(CH2)n6-CH(NH2)-COOH、-(CH2)n6-CONH2，
n5是2至4的整数，
n6是1至4的整数，
R3是氢或C1-4烷基，
R4是C1-4烷基，且
Rd是氢、卤素、C1-4烷氧基或C1-4烷基。
优选地，W可为苯基。
优选地，L是-(CH2)n1-或-O-(CH2)n2-CH(OH)-，但条件是-O-(CH2)n2-CH(OH)-中的O与苯环键合。
优选地，n1可为0至1的整数。
优选地，n2可为1至2的整数。
优选地，Ra可为氢或-O-(CH2)n3-R'1。
优选地，R'1可为未取代的苯基或经羟基、氟、氯、溴、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基、氨基或二甲氨基取代的苯基。
优选地，n3可为1至4的整数。
优选地，Rb可为羟基或-O-(CH2)n4-R'2。
优选地，R'2可为未取代的苯基或经羟基、氟、氯、溴、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基、氨基或二甲氨基取代的苯基。
优选地，n4可为1至4的整数。
优选地，Rc可为-(CH2)n5-OH、-(CH2)n5-NH-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NH2、-(CH2)n5-O-(CH2)n5-OH、-CONH(CH2)n5-OH、-CO(CH2)n6-OH、-(CH2)n6-CH(NH2)-COOH或-(CH2)n6-CONH2。
优选地，n5可为2至3的整数。
优选地，n6可为1至2的整数。
优选地，Rd可为氢、卤素、C1-2烷氧基或C1-2烷基。
对于与连接子的结合，所述p62配体可以衍生物的形式(其中一些基团已被修饰为可促进与该连接子结合的形式)连接至该连接子。这可由本领域技术人员依据p62配体的类型、连接子的类型和它们的结合形式适当地使用已知的技术进行变化，且这些修饰的衍生物形式也包括在本发明的p62配体内。
在一具体实施方式中，根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物可为以下表2所示的化合物，但不限于此。
[表2]
同时，本发明的化合物可以药学上可接受的盐形式存在。作为盐，可使用通过药学上可接受的游离酸所形成的加成盐。本文中所使用的术语“药学上可接受的盐”是指由化学式1至3表示的化合物的任何有机或无机加成盐，其中由盐所引起的不良作用并不损害在对患者展现相对无毒的和非有害的有效活性的浓度下的化合物的有益效果。
酸加成盐可通过常用方法，例如通过将化合物溶解于过量的酸水溶液中且使用水可混溶性有机溶剂(诸如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈)沉淀所得盐来制备。作为另选，可加热含等摩尔量的化合物和酸的水或醇(例如，乙二醇单甲醚)，且随后所得混合物可通过蒸发来干燥或经沉淀的盐可在抽吸下过滤。
在此情况下，游离酸可为无机酸或有机酸。无机酸的实例包括但不限于盐酸、磷酸、硫酸、硝酸及锡酸。有机酸的实例包括但不限于甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、顺丁烯二酸、丁二酸、草酸、苯甲酸、酒石酸、反丁烯二酸、杏仁酸、丙酸、柠檬酸、乳酸、乙醇酸、葡糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖醛酸、天冬氨酸、抗坏血酸、碳酸、香草酸及氢碘酸。
此外，可使用碱制备药学上可接受的金属盐。碱金属或碱土金属盐可例如通过将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤未溶解的化合物盐且随后蒸发过滤物直至干燥来获得。此时，作为金属盐，特别是钠、钾或钙盐在药学上是合适的，但本发明不限于此。此外，相应的银盐可通过用适当银盐(例如，硝酸银)使碱金属或碱土金属盐反应来获得。
除非本文中另外指出，否则本发明的化合物的药学上可接受的盐包括酸性或碱性基团的盐，其可存在于化学式1的化合物中。例如，药学上可接受的盐包括羟基的钠、钙及钾盐；以及氨基的其他药学上可接受的盐，包括氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乙酸盐、丁二酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、杏仁酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate/mesylate)及对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonate/tosylate)。可使用现有技术中已知的盐制备方法来制备盐。
本发明的化学式1的化合物的盐为药学上可接受的盐，且可不经特别限制使用，只要其为展现出等效于化学式1的化合物的药理学活性的盐即可。
此外，根据本发明的由化学式1表示的化合物包括但不限于，不仅其药学上可接受的盐，而且所有溶剂化物或水合物以及可由其制备的所有可能的立体异构体。本发明化合物的所有立体异构体(例如，可由于各种取代基上的不对称碳而存在的那些)，包括对映异构体形式及非对映异构体形式，均涵盖于本发明的范围内。本发明的化合物的个别立体异构体可例如基本上不含其他异构体(例如，作为具有指定活性的纯或基本上纯的光学异构体)或可例如作为外消旋体或与所有其他立体异构体或其他选出的立体异构体共混。本发明的化合物的手性中心可具有如由IUPAC 1974建议所定义的S或R构型。外消旋形式可通过物理方法分析，诸如非对映异构体衍生物的分步结晶、分离或结晶，或通过手性柱层析分离。个别光学异构体可由外消旋体通过任何适合的方法来获得，包括但不限于用光学活性酸形成盐然后结晶。
由化学式1表示的化合物的溶剂化物及立体异构体可由化学式1表示的化合物使用现有技术中已知的方法来制备。
此外，根据本发明的由化学式1表示的化合物可以结晶形式或非结晶形式制备，当化合物以结晶形式制备时，其可任选地为水合或溶剂化的。在本发明中，化学式1的化合物可不仅包括化学计量的水合物，而且包括含有各种水量的化合物。根据本发明的化学式1的化合物的溶剂化物既包括化学计量溶剂化物也包括非化学计量溶剂化物。
根据本发明的化学式1的化合物可用以下示例性性方法制备，其具体实例与以下实施例中描述的反应式中相同。
在本发明的制备方法中，反应式中所使用的反应物可为商购的化合物，或可通过直接进行一个或多个本领域已知的反应或经过适当地修改该反应的反应合成。例如，考虑骨架结构中所含的反应官能团和/或杂元素的存在、类型和/或位置，按照一系列顺序进行一个或多个反应来合成该反应物，但不限于此。
根据本发明的化学式1的化合物充当与p62的ZZ结构域结合且同时与靶蛋白质、细胞器及聚集体结合的嵌合配体，从而活化p62的功能，并将侵犯细胞的靶蛋白质、细胞器(内质网、线粒体、过氧化物酶体等)、胞内结构体(发炎体、应激颗粒等)、病原体(病毒、细菌等)及聚集体递送至自噬进行降解，与p62相似。
因此，在另一方面，本发明提供一种用于自噬活化的药物组合物，其包含化学式1的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构物、水合物、溶剂化物或前药。
根据本发明的化学式1的化合物可通过将靶蛋白质、细胞器及聚集体递送至自噬并将它们降解来消除病理蛋白质相关的疾病的病理蛋白质、细胞器及聚集体。此外，化学式1的化合物是p62配体，其与p62 ZZ结构域结合并活化p62蛋白的PB1结构域及LIR结构域，从而p62产生寡聚合及形成聚集体，同时增加靶蛋白质、细胞器及聚集体与p62蛋白向自噬小体的递送。通过以上方法，靶蛋白质、细胞器及聚集体被有效地消除(见图1)。此靶蛋白质可为病理蛋白质相关疾病的主要蛋白质，更特别地是选自由以下所组成的组中的至少一种：朊病毒蛋白(prion protein)、淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein；APP)、α-突触核蛋白、超氧化歧化酶1、tau蛋白(tau)、免疫球蛋白、淀粉样蛋白A、甲状腺素运载蛋白、β2-微球蛋白、胱抑素C、载脂蛋白A1、TDP-43、胰岛淀粉样蛋白多肽、ANF、胶溶素、胰岛素、溶菌酶、血纤维蛋白原、亨廷顿蛋白、α-1-抗胰蛋白酶Z、晶状体球蛋白、c9开放阅读框72(c9orf72)、胶质纤维酸性蛋白、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、视紫质(rhodopsin)及脊髓小脑性共济失调蛋白(ataxin)以及具有聚-Q延伸的其他蛋白质。
因此，在又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含化学式1的AUTOTAC嵌合化合物、其药学上可接受的盐、立体异构物、水合物、溶剂化物或前药。该药物组合物用于预防或治疗由靶结合配体靶向的疾病。非限制性地，此疾病可为靶标，只要其可与靶结合配体结合即可，优选地，其可为癌症或蛋白质构象病，更优选地，其包括各种当靶向及降解特定蛋白时可预期具有疗效的疾病，如罕见或顽固性疾病或遗传疾病。根据本发明的药物组合物的特征在于直接消除诱导上述疾病的致病蛋白。
在另一方面，本发明提供一种用于致病病理蛋白质及错误折叠蛋白质的自噬递送或降解的药物组合物，其包括该化学式1的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构物、水合物、溶剂化物或前药。
如本文中所使用的术语“蛋白质构象病(proteinopathy)”或“与蛋白质聚集有关的疾病”是指其特征在于存在错误折叠蛋白质聚集体的那些疾病，其实例包括但不限于神经退行性疾病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、角膜病变、色素性视网膜炎、2型糖尿病和囊性纤维化等。
根据本发明的术语“聚集(aggregation)”是指典型地一种或多种类型的蛋白质的寡聚或多聚复合物的形成，其可伴随着将额外生物分子如碳水化合物、核酸及脂质整合至复合物中。这些聚集蛋白质可在特定组织中，更优选在神经组织或大脑组织中形成沉积物。聚集的程度视特定疾病而定。
本文中的神经退行性疾病优选选自由以下组成的组：莱姆疏螺旋体病(Lymeborreliosis)、致死性家族性失眠症、库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease；CJD)、多发性硬化(MS)、痴呆、阿兹海默氏病、癫痫症、帕金森氏病、中风、亨廷顿氏病、皮克氏病、肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓小脑共济失调、其他聚-Q疾病、遗传性脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多发性神经病、原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、注射局部淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病性淀粉样变性、亚历山大氏病(Alexander disease)及芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。
本发明的药物组合物的剂量可视患者的体重、年龄、性别或健康状况、饮食、施用时期、施用方法、排泄物及疾病的严重程度而在较宽广范围内变化。然而，有效剂量通常为约1ng至10mg/天，且尤其针对成年人(60kg)为约1ng至1mg/天。由于剂量可视各种条件而变化，对于相关领域技术人员将显而易见的是可增加或减少剂量。因此，本发明的范围不受前述剂量以任何方式限制。关于施用的次数，可在所需范围内进行每天一次或经划分的若干次施用，且施用时期抑或不受特定限制。
如本文中所使用，术语“治疗”是指通过施用本发明的药物组合物来缓解或有利地改变各种与错误折叠蛋白质聚集有关的疾病以及经靶向蛋白质降解的疾病的症状的所有措施。
如上文所描述，本发明的化合物展现以下效果：(1)诱导p62寡聚合及结构活化；(2)增强p62-LC3结合，及(3)增强p62向自噬小体的递送；(4)活化自噬；以及最后(5)消除靶向的蛋白质。因此，含有作为活性成分的此化合物的药物组合物可用于预防、改善或治疗与各种期望疾病，优选癌症或蛋白质构象病。
例如，本发明的组合物可进一步包括药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。组合物可以各种形式使用，诸如粉剂、颗粒剂、锭剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、喷雾剂的口服剂型及无菌可注射溶液的注射，其根据预期用途中的每一种的目的通过常规方法来配制。组合物可经由各种途径施用，包括口服施用或静脉内、腹膜内、皮下、经直肠及局部施用。可包括于此组合物中的适合载剂、赋形剂或稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。此外，本发明的组合物可进一步包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂、芳香剂、乳化剂和防腐剂等。
用于口服施用的固体制剂包括锭剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊等，且这些固体剂型通过使本发明的组合物与一或多种赋形剂，诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶等混合来调配。此外，可使用除简单赋形剂以外的润滑剂，诸如硬脂酸镁及滑石。
用于口服施用的液体制剂可说明为悬浮液、溶液、乳液和糖浆等，且可包括各种赋形剂，诸如保湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂等以及作为常用稀释剂的水及液体石蜡。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳液试剂、冻干剂及栓剂。非水性溶剂及悬浮剂可包括丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油及诸如油酸乙酯的可注射酯。作为栓剂的基质，可使用Witepsol、聚乙二醇、Tween 61、可可脂、月桂酯或甘油明胶等。在另一方面，注射剂可包括常规添加剂，诸如助溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂或防腐剂。
制剂可根据常规混合、颗粒化或涂布方法来制备，且含有对医学治疗、尤其对于预防、改善或治疗与蛋白质聚集有关的疾病有效的量的活性成分。
在此情况下，本发明的组合物以药学有效量施用。如本文中所使用的术语“药学有效量”是指在适用于任何医学治疗的合理权益/风险比下足以治疗疾病而且不足以引起副作用的量。有效量的水平可视患者的健康状况、疾病类型、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的灵敏度、施用方法、施用时间、施用途径、排泄速率、治疗持续时间、组合、包括同时使用其他药品的因素及医学领域中熟知的其他因素而测定。本发明的组合物可作为个别治疗剂或与其他治疗剂组合施用，且其可与常规治疗剂同时或依次施用，并且施用一次或多次。考虑所有以上因素，施用可提供最大效果而无副作用的最少量为至关重要的，其可由本领域技术人员容易地测定。
例如，剂量可视施用途径、疾病的严重程度、性别、体重和年龄等而增加或减少，且本发明的范围不受前述剂量以任何方式限制。
根据本发明的化合物的优选剂量可根据患者的病况及体重、疾病的严重程度、药物的类型以及施用途径及持续时间而改变，但其可由本领域技术人员适当选择。
在另一方面，本发明提供预防、改善或治疗疾病、优选癌症、病理蛋白相关的疾病、与蛋白聚集有关的疾病的方法，其包括对有需要的受试者施用本发明的药物组合物。
在又一方面，本发明提供(i)增加靶蛋白质的降解的方法、(ii)增加细胞器及结构体的降解的方法；(iii)增加各种侵犯细胞的病毒及细菌的降解的方法、(iv)将药物或小分子化合物递送至自噬及溶酶体的方法、(v)p62的自身寡聚及自噬活化的方法及(vi)通过将细胞中的特定蛋白质连接至p62且将其递送至自噬来增加通过溶酶体的降解的方法，其包括化学式1的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构物、溶剂化物、水合物或前药。
在另一方面，本发明提供一种使用药物且通过内体将此药物递送至溶酶体的方法，在该药物中，根据本发明的嵌合化合物连结至治疗抗体，该治疗抗体特异性地结合至暴露在细胞膜上的蛋白质。该治疗性抗体可以没有限制地使用，只要其能展现针对需要治疗的疾病的药学活性即可。
如本文中所使用，术语“受试者”指包含人类、猴、牛、马、绵羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔或豚鼠的所有动物，其具有要预防、改善或治疗的靶疾病。所述靶疾病，优选为癌症、与病理蛋白相关的疾病或与错误折叠蛋白聚集有关的疾病可通过向受试者施用本发明的药物组合物来有效地预防、改善或治疗。此外，因为本发明的药物组合物充当p62配体以活化自噬，由于自噬活化从而消除错误折叠蛋白质的聚集体，且因此展现与这些聚集蛋白质有关的疾病的预防或治疗效果，其可通过与现有治疗剂组合施用来展现协同效果。
如本文中所使用，术语“施用”是指以某些适当方法将物质的处方量引入至患者中，且本发明的组合物可经由通用途径中的任一者施用，只要其可达至靶组织即可。例如，可进行腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用及直肠内施用，但本发明不限于这些例示的施用模式。此外，本发明的药物组合物可使用任何能够将活性成分递送至靶细胞的装置施用。优选施用模式及制剂为静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射或静脉内滴注等。可注射制剂可使用盐水、诸如林格氏溶液的水溶液及非水性溶液，诸如植物油、高脂肪酸酯(例如，油酸乙酯等)、醇(例如，乙醇、苯甲醇、丙二醇、甘油等)来制备。可注射制剂可包括药学载剂，包括用于预防退化症的稳定剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、BHA、生育酚、EDTA等)、乳化剂、用于pH控制的缓冲剂及用于抑制微生物生长的防腐剂(例如，硝酸苯汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)。
在另一方面，本发明提供一种用于预防或改善蛋白质构象病的食品组合物，其包含化学式1的AUTOTAC嵌合化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药。食品组合物为健康功能性食品且其可经由制剂自身使用或作为健康功能性食品的添加剂包含于其他健康功能性食品中。健康功能性食品是指具有诸如疾病的预防或改善、生物防御、免疫、康复的恢复、衰老抑制等身体调节功能的食品，且其在长期服用时应对人体无害。活性成分的混合量可适当地视使用的目的(预防、保健或治疗性处理)而定。
食品的种类不受特定限制。可添加以上物质的食品的实例为肉、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、甜饼、披萨饼、拉面、其他面条、胶状物、包括冰淇淋的乳制品、汤类、饮料、茶、饮品、酒精饮料及维生素复合物等，且其包括常识中的所有保健功能性食品。
本发明的食品组合物可包含在制备食品或食品添加剂中所使用的常用成分，特别是，调味剂；天然甜味剂，诸如，如葡萄糖、果糖等单糖，如麦芽糖、蔗糖等双糖，及作为天然碳水化合物的糊精、环糊精，或合成甜味剂，诸如糖精、阿斯巴甜；营养素；维生素；电解质；着色剂；有机酸；保护性胶体粘性剂；pH调节剂；稳定剂；防腐剂；甘油；酒精；碳酸饮品上所使用的碳酸化剂等。
在本发明的特定实施方式中，以化学式1表示的新颖的AUTOTAC嵌合化合物1至13是新合成的。此外，为了评估根据本发明的新颖的AUTOTAC嵌合化合物是否可增加培养细胞中的自噬现象，用根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物处理主要表达靶蛋白质的细胞系(MCF7、NTERA-2、ACHN、U87-MG、LNCaP、HEK293T)或基因重组细胞系(SH-SY5Y-tau、HeLa-HttQ97、PC12-a-synA30P)并进行培养，然后利用免疫印迹法证实在培养细胞中的靶蛋白质降解活性。结果，不仅逐步证实了以根据本发明的AUTOTAC化合物按浓度处理的自噬介导的各靶蛋白质的降解作用，还证实了降解功效优于构成该嵌合化合物的p62配体或靶蛋白质的作用。因此，证实根据本发明的AUTOTAC化合物活化p62蛋白并使其寡聚合，由此递送至自噬小体，同时选择性且有效地消除与各种靶疾病(如癌症相关蛋白质或蛋白质构象病)相关的蛋白质及其聚集体。
实施例
下文将参考实施例详述本发明。然而，这些实施例仅出于说明性目的，且本发明并不受这些实施例的限制。
依照下列实施例1至13的方法，制备根据本发明的式1-13化合物。
[表3]
在用于合成本发明的化合物的起始材料方面，各种合成方法均为已知的，假如可从市场上购得，则可购自供应商。试剂供应商的实例包括Sigma-Aldrich、TCI、Wako、Kanto、Fluorchem、Acros、Alfa和Fluka等，但不限于此。
本发明的化合物可使用以下一般方法及程序，从方便取得的起始材料制得。至于典型或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力)等等，除非另有说明，否则亦可使用其它工艺条件。最佳的反应状态可随着所使用的特定反应物或溶剂而变。这些条件可由本领域技术人员通过常规优化程序确定。
以下描述实施例1至13的制备方法。
实施例1：(2E,4E,6E,8E)-N-(2-(2-(2-(((R)-3-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酰胺(RTEG-1104)的制备
步骤1)制备3,4-双(苯甲氧基)苯甲醛(1101)
在将3,4-二羟基苯甲醛(0.50g，3.62mmol)溶于无水DMF(5ml)后，加入碳酸钾(K2CO3，1.50g，10.86mmol)，然后于该反应中慢慢加入溴甲苯(0.92mL，7.96mmol)且在60℃下搅拌4个小时。反应完全时，令反应混合物冷却至室温，用纯化水稀释，并用乙醚(50ml)萃取二次。用纯化水(50ml)洗涤有机层二次，然后再用饱和氯化钠水溶液(50ml)洗涤一次。然后，于该有机层中加入无水硫酸钠并搅拌，接着在减压下过滤。将滤出溶液浓缩，然后利用柱层析法纯化，获得3,4-双(苯甲氧基)苯甲醛(1101，1.04g，产率：90％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ9.81(s,1H),7.49-7.31(m,12H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.27(s,2H),5.22(s,2H)；ESIMS m/z：319.33[M+H]+。
步骤2)制备3,4-双(苯甲氧基)酚(1102)
将二氯甲烷(15ml)加至并溶于3,4-双(苯甲氧基)苯甲醛(1101，1.00g，3.0mmol，1eq.)中，然后于该反应中加入mCPBA(0.78g，4.5mmol，1.5eq.)并于室温下搅拌4个小时。用乙酸乙酯稀释该反应混合物，用饱和碳酸钠水溶液洗涤，然后分离有机层。用氯化钠水溶液洗涤有机层，然后用无水硫酸钠脱水且于减压下过滤。将滤出溶液浓缩，然后再溶于甲醇(10ml)中。于其中加入6N NaOH，在室温下搅拌30分钟。于该反应中加入4N HCl溶液，进一步搅拌30分钟。用乙酸乙酯(50ml)稀释反应混合物，用盐水洗涤，用无水硫酸钠脱水及在减压下过滤。将滤出溶液浓缩，然后利用柱层析法纯化(己烷/乙酸乙酯之比＝7/3)，获得3,4-双(苯甲氧基)酚(1102，0.87g，产率：90％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.25–7.42(m,10H),6.80(d,1H,J＝9.0Hz),6.48(d,1H,J＝3.0Hz),6.29(dd,1H,J＝3.0及9.0Hz),5.08(d,4H,J＝15Hz),4.55(s,1H)；ESIMS m/z:307.25[M+H]+。
步骤3)制备R-2-((3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(1103)
用乙醇(10ml)稀释3,4-二苯甲氧基酚(1102，306mg，1.0mmol)，然后依次加入KOH水溶液(KOH 66mg，1.2mmol，1ml)及(R)-2-(氯甲基)环氧乙烷(410ul，5.0mmol)。在室温下搅拌反应混合物5个小时，然后在减压下除去有机溶剂。再次用乙酸乙酯稀释浓缩的反应混合物，用水洗涤然后用盐水洗涤。用无水硫酸钠对萃取的有机层进行脱水，然后在减压下过滤。浓缩滤出的有机层，利用柱层析法纯化，获得纯R-2-((3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(1103，297mg，产率：82％)。ESIMS m/z：363.5[M+H]+。
步骤4)制备(R)-1-((2-(2-(2-胺乙氧基)乙氧基)乙基)氨基-3-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)丙-2-醇(AL-1)
将R-2-((3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(1103，270mg，0.75mmol)溶于无水乙醇(5ml)中，然后加入2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-1-胺)(880mg，5.9mmol)并在室温下搅拌8个小时。通过TLC确认反应后，在减压下浓缩反应溶剂。于浓缩的反应中加入水，用二氯甲烷萃取(3×5mL)。用无水硫酸钠对萃取的有机层进行脱水，然后在减压下过滤。浓缩滤出的有机层，利用柱层析法纯化(二氯甲烷：甲醇＝19：1)，获得(R)-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基-3-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)丙-2-醇(AL-1，267mg，产率：70％)。ESIMS m/z：511.5[M+H]+。
步骤5)将(R)-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基-3-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)丙-2-醇(AL-1，100mg，0.19mmol)溶于DMF(4ml)中，然后依次加入1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，44mg，0.285mmol)、羟苯并三唑(HOBt，38.5mg，0.285mmol)及视黄酸(60mg，0.2mol)。然后，于其中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.6ml)，且于室温下搅拌12个小时。于该反应中加入水，然后用乙酸乙酯萃取二次，然后用盐水洗涤有机层一次。用无水硫酸钠对有机层进行脱水，及在减压下过滤。在减压下使滤液浓缩，并利用高分辨率液相色谱法纯化，获得白色固体，(2E,4E,6E,8E)-N-(2-(2-(2-(((R)-3-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酰胺(RTEG-1104，60mg，产率：41％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)1.01(s,6H),1.53(m,2H),1.74-1.79(m,5H),1.96(m,2H),2.12(s,3H),2.42(s,3H),2.56-2.81(m,4H),3.04(m,2H),3.52-3.54(m,6H),3.67(m,2H),3.95-4.05(m,3H),5.16(s,4H),5.37(br s,1H),5.91(br s,1H),6.22(s,2H),6.51(s,4H),6.57-6.61(m,2H),6.98(d,1H),7.32-7.48(m,10H),8.51(br s,1H)；ESI-MS计算m/z C49H64N2O7[M+H]+794.35测得793.06
实施例2：(2E,4E,6E,8E)-N-(2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酰胺的制备(RTEG-1105)
步骤1)制备2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)乙-1-胺(AL-2)
将3,4-双(苯甲氧基)苯甲醛(1101，0.5g，1.57mmol)溶于乙腈(ACN，10ml)中，然后于其中加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(468mg，1.88mmol)，并在60至70℃下搅拌5个小时。冷却至室温后，慢慢地于反应中加入硼氢化钠(NaBH4，106mg，2.82mmol)，然后在室温下搅拌约5个小时。于该反应溶液中加入水使反应完全，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，并使用硫酸钠进行脱水。将滤出溶剂浓缩，然后再次溶于二氯甲烷(6ml)中。于其中加入三氟乙酸(TFA，2ml)，在室温下搅拌2个小时，然后在减压下将溶剂浓缩。利用柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝15：1)纯化浓缩物，得到淡黄色液体，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)乙-1-胺(AL-2，590mg，产率：84％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)2.59(t,2H),3.32-3.61(m,12H),4.62(br s,1H),5.10(s,4H),6.82(d,1H),6.97(d,1H,7.06(s,1H),7.30-7.46(m,10H)。
步骤2)用与实施例1的步骤5相同的方法，合成(2E,4E,6E,8E)-N-(2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酰胺(RTEG-1105)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)1.01(s,6H),1.54(m,2H),1.75-1.80(m,5H),1.98(m,2H),2.12(s,3H),2.42(s,3H),2.72(t,2H),3.04(t,2H),3.51-3.54(m,6H),3.67(t,2H),3.76(s,2H),5.14(s,4H),6.22(m,2H),6.37(br s,1H),6.51(s,4H),6.80(d,1H),6.87(d,1H),6.99(s,1H),7.31-7.46(m,10H),8.41(br s,1H)；ESI-MS计算m/z C47H60N2O5[M+H]+734.3测得733.01
实施例3：(R)-N-(15-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-14-羟基-3,6,9-三噁-12-氮杂十五基)-4-苯丁酰胺(PBA-1104)的制备
步骤1)将2,2'-(2,2'-氧双(乙烷-2,1-二基)双(氧基))二乙胺(21g，73.1mmol)溶于二氯甲烷(400ml)中，然后依次加入羟苯并三唑(HOBt，12.3g，91.5mmol)与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，17.6g，91.5mmol)。于其中加入三乙胺(Et3N，18.5g，180mmol)并冷却至0℃。将4-苯丁酸(15g，91.5mmol)溶于二氯甲烷(200ml)中，然后加至该反应，接着在室温下搅拌12个小时。用水稀释反应混合物，然后用二氯甲烷萃取(50ml×3次)，用无水硫酸钠对有机层进行脱水并过滤。在减压下浓缩滤液，然后利用硅胶柱层析法纯化，得到黄色液体，N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-苯丁酰胺(TL-1，12g)。ESIMS m/z：339.1[M+H]+。
步骤2)将N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-苯丁酰胺(TL-1，100mg，0.295mmol)溶于甲醇(6ml)中，然后于其中加入R-2-((3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(1103，128mg，0.354mmol)，在50℃下搅拌10个小时。在减压下浓缩反应混合物，并用硅胶柱层析法纯化，得到白色固体，(R)-N-(15-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-14-羟基-3,6,9-三噁-12-氮杂十五烷基)-4-苯丁酰胺(PBA-1104，2013mg，产率：50％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)1.25(s,1H),1.92(m,2H),2.31(t,2H),2.56-2.81(m,4H),3.28(m,2H),3.51-3.53(m,10H),3.67(t,2H),3.95-4.20(m,3H),5.14(s,4H),5.37(br s,1H),5.90(br s,1H),6.57(s,1H),6.67(d,1H),6.96(d,1H),7.16(m,3H),7.30(mk 8H),7.45(m,4H)；ESI-MS计算m/z C41H52N2O8[M+H]+701.5测得700.87
实施例4：N-(1-(3,4-双(苯甲氧基)苯基)-5,8,11-三噁-2-氮杂十三烷-13-基)-4-苯丁酰胺(PBA-1105)的制备
步骤1)制备N-(1-(3,4-双(苯甲氧基)苯基)-5,8,11-三噁-2-氮杂十三烷-13-基)-4-苯丁酰胺(PBA-1105)
将N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-苯丁酰胺(TL-1)(10g，29.6mmol)溶于甲醇(MeOH，150mL)中，然后于其中加入3,4-二羟基苯甲醛(10.3g，32.3mmol)。然后，在65℃下搅拌该混合物约5个小时。冷却至室温后，加入硼氢化钠(NaBH4，2.2g，57.9mmol)，并在室温下搅拌约5个小时。于该反应溶液中加入水使反应完全，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，使用硫酸钠去除水。将滤出溶剂浓缩，然后利用使用硅胶的柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇＝15：1)。从而获得黄色液体，N-(1-(3,4-双(苯甲氧基)苯基)-5,8,11-三噁-2-氮杂十三烷-13-基)-4-苯丁酰胺(PBA-1105)(10.3g)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm)7.45-7.42(m,4H),7.36-7.29(m,7H),7.27-7.26(m,1H),7.18-7.15(m,3H),6.99(d,1H),6.83(d,1H),6.41(brs,1H),5.15(d,4H),3.71(s,2H),3.60-3.55(m,10H),3.55-3.49(m,2H),3.42-3.39(m,2H),2.75-2.73(m,2H),2.65-2.61(m,2H),2.18-2.15(m,2H),1.97-1.93(m,2H),1.25(brs,1H)；ESI-MS计算m/zC39H48N2O6[M+H]+641.00测得640.82
实施例5：3-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(2-(2-(2-((3-((4-氟苯甲基)氧基))苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)苯胺(Anle138b-F105)的制备
步骤1)制备3-((4-氟苯甲基)氧基)苯甲醛(YT-102)
将碳酸钾(K2CO3，112.5g，0.81mol)及1-(溴甲基)-4-氟苯(95g，0.50mol)加至配制于乙腈(ACN，500mL)中的3-羟苯甲醛(50g，0.41mol)的溶液中。令混合物在60℃下搅拌约10个小时。反应完成后，过滤并浓缩反应溶液。于其中加入石油醚/乙酸乙酯(PE/EA，20：1，20mL)，进一步搅拌约1个小时，然后通过过滤器浓缩。从而获得灰白色固体，3-((4-氟苯甲基)氧基)苯甲醛(YT-102，25g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.98(s,1H),7.54-7.50(m,5H),7.36(m,1H),7.23(m,2H),5.18(s,2H)
步骤2)制备叔丁基3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑-1-甲酸酯(T-1)
将3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑(200mg，0.58mmol)溶于二氯甲烷(DCM，4mL)中，然后加入三乙胺(TEA，88mg，0.87mmol)及二碳酸二叔丁酯(Boc2O，153mg，0.70mmol)。在室温下搅拌该混合物约4个小时。反应完成后，浓缩滤出的溶液，利用使用硅胶的柱层析法纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：5)。从而获得白色固体，叔丁基3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑-1-甲酸酯(T-1，200mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)8.09-7.43(m,5H),7.11-6.94(m,3H),6.08(s,2H),1.34(d,J＝20Hz,9H)
步骤3)制备3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5-氮杂十三烷-13-基)氨基)苯基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁基酯(TL-2)
将3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁基酯(T-1，200mg，0.45mmol)溶于二甲基亚砜(DMSO，4mL)中，然后于其中加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-1，168mg，0.68mmol)及叔丁醇钾(t-BuOK，101mg，0.90mmol)。在120℃下搅拌该混合物约16个小时。将反应化合物过滤并浓缩，然后利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化。从而获得淡黄色固体，叔丁基3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5-氮杂十三烷-13-基)氨基)苯基)-1H-吡唑-1-甲酸酯(TL-2，180mg)。
步骤4)制备N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1H-吡唑-5-基)苯胺(TL-3)
将叔丁基3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5-氮杂十三烷-13-基)氨基)苯基)-1H-吡唑-1-甲酸酯(TL-2，180mg，0.29mmol)溶于乙酸乙酯(EA，4mL)中，然后于其中加入盐酸/乙酸乙酯(1mL，3N)溶液。在室温下搅拌该混合物约2个小时。将反应化合物过滤并浓缩。从而获得白色固体，N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1H-吡唑-5-基)苯胺(TL-3，100mg)。
步骤5)制备3-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(2-(2-(2-((3-((4-氟苯甲基)氧基))苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)丙胺(Anle138b-F105)
将N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1H-吡唑-5-基)丙胺(TL-3，90mg，0.22mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后加入3-((4-氟苯甲基)氧基)苯甲醛(YT-102，50mg，0.22mmol)，在65℃下搅拌。然后，在5℃下于其中加入硼氢化钠(NaBH4，16mg，0.44mmol)，然后进一步搅拌约1个小时。将反应化合物浓缩，然后利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化。从而获得无色液体，3-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1H-吡唑-5-基)-N-(2-(2-(2-((3-((4-氟苯甲基)氧基))苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)丙胺(Anle138b-F105，15mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)13.08(brs,1H),7.47(q,J＝6Hz,2H),7.37-7.31(m,2H),7.21-7.17(m,3H),7.11(t,J＝8Hz,1H),7.00-6.96(m,5H),6.88-6.82(m,2H),6.56(d,J＝8Hz,1H),6.04(s,2H),5.59(brs,1H),5.04(s,2H),3.66(s,2H),3.60-3.52(m,6H),3.47(t,J＝6Hz,2H),3.26-3.22(m,2H),2.61(t,J＝5.6Hz,2H)；ESI-MS计算m/z C36H37FN4O5[M+H]+625.10测得624.71
实施例6：(3R,4S,5S,6R)-5-甲氧基-4-((2R,3R)-2-甲基-3-(3-甲基丁-2-烯-1-基)环氧乙烷-2-基)-1-噁螺[2.5]辛烷-6-基(13E,15E,17E,19E)-1-(3-(苯甲氧基)苯基)-12-氧代-5,8-二噁-2,11-二氮杂二十一-13,15,17,19-四烯-21-酸酯(烟曲霉素-105)的制备
步骤1)制备3-(苯甲氧基)苯甲醛(201)
将碳酸钾(K2CO3，112.5g，0.81mol)及溴甲基苯(85g，0.50mol)加至配制于乙腈(ACN，500mL)中的3-羟苯甲醛(50g，0.41mol)溶液中。在60℃下搅拌该混合物约10个小时。反应完成后，将反应溶液过滤，然后浓缩。然后，于其中加入石油醚/乙酸乙酯(PE/EA，20：1，20mL)，进一步搅拌约1个小时，接着通过过滤器浓缩。从而获得灰白色固体，3-(苯甲氧基)苯甲醛(201，25g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.97(s,1H),7.54-7.51(m,3H),7.47(d,J＝7.2Hz,2H),7.42-7.34(m,4H),5.19(s,2H)
步骤2)制备2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(3-(苯甲氧基)苯甲基)乙烷-1-胺(AL-3)
将3-(苯甲氧基)苯甲醛(201，50g，235.8mmol)溶于甲醇(MeOH，500mL)中，然后于其中加入2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))二乙胺(L-2，34.9g，235.8mmol)。在65℃下搅拌该混合物约6个小时。冷却至室温后，加入硼氢化钠(NaBH4，8.95g，235.8mmol)，在50℃下搅拌一整夜。加入水使反应完全，用乙酸乙酯(EtOAc，50mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机层，然后通过添加硫酸钠(Na2SO4)除去水。将溶液浓缩，然后利用使用硅胶的柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇＝12：1)。从而获得黄色液体，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(3-(苯甲氧基)苯甲基)乙烷-1-胺(AL-3，20g)。1H NMR(DMSO+D2O，400MHz)δ(ppm)7.41-7.29(m,5H),7.18(t,J＝8Hz,1H),6.94(s,1H),6.86-6.81(m,2H),5.03(s,2H),3.60(s,2H),3.45-3.42(m,6H),3.33(t,J＝5.6Hz,2H),2.57-2.52(m,4H)；ESI-MS计算m/z C20H28N2O3[M+H]+345.10测得344.46
步骤3)制备(3R,4S,5S,6R)-5-甲氧基-4-((2R,3R)-2-甲基-3-(3-甲基丁-2-烯-1-基)环氧乙烷-2-基)-1-噁螺[2.5]辛烷-6-基(13E,15E,17E,19E)-1-(3-(苯甲氧基)苯基)-12-氧代-5,8-二噁-2,11-二氮杂二十一-13,15,17,19-四烯-21-酸酯(烟曲霉素-105)
将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(3-(苯甲氧基)苯甲基)乙烷-1-胺(AL-3，70mg，0.22mmol)溶于二氯甲烷(DCM，2mL)中，然后于其中加入烟曲霉素(Fumagillin)(100mg，0.22mmol)、羟基苯并三唑(HOBT，34mg，0.25mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，48mg，0.25mmol)及三乙胺(Et3N，44mg，0.44mmol)。在30℃下搅拌该混合物约10个小时。反应完成后，用二氯甲烷(DCM，50mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，及使用硫酸钠除去水。将滤出的溶剂浓缩，然后利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化。从而获得黄色固体，(3R,4S,5S,6R)-5-甲氧基-4-((2R,3R)-2-甲基-3-(3-甲基丁-2-烯-1-基)环氧乙烷-2-基)-1-噁螺[2.5]辛烷-6-基(13E,15E,17E,19E)-1-(3-(苯甲氧基)苯基)-12-氧代-5,8-二噁-2,11-二氮杂二十一-13,15,17,19-四烯-21-酸酯(烟曲霉素-105，3mg)。ESI-MS计算m/z C46H60N2O9[M]+784.90测得784.99
实施例7：3-(3,5-二氯苯基)-5-((R)-15-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)-14-羟基-6,9-二噁-3,12-二氮杂十五烷基)-5-甲基噁唑烷-2,4-二酮(烯菌酮-2204)的制备
步骤1)制备3-羟基-4-苯乙氧基苯甲醛(A-1)
将3,4-二羟基苯甲醛(200g，1.4mol)溶于乙腈(ACN，2L)中，然后于其中加入碳酸钾(K2CO3，260g，1.9mol)及1-(2-溴乙基)苯(267g，1.4mol)。在80℃下搅拌该混合物约16个小时。使用盐酸(1.5L，1N)使反应完全后，用乙酸乙酯(EA，1L×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，用硫酸钠除去水，然后过滤。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝20：1至10：1)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，3-羟基-4-苯乙氧基苯甲醛(A-1，320g)。ESI-MS计算m/z C15H14O3[M+H]+243.0测得242.27
步骤2)制备3,4-二苯乙氧基苯甲醛(2201)
将3-羟基-4-苯乙氧基苯甲醛(A-1，320g，1.32mol)溶于四氢呋喃(THF，5L)中，然后于其中加入2-苯乙醇(193.5g，1.59mol)、三苯基膦(PPh3，520g，1.98mol)及偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，400g，1.98mol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。于反应溶液中加入水(100mL)使反应完全，用乙酸乙酯(100mLx2)萃取。于萃取的有机溶剂层中加入硫酸钠，以除去水，过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)纯化浓缩的化合物。从而获得白色固体，3,4-二苯乙氧基苯甲醛(2201，160g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.81(s,1H),7.51(dd,J＝8Hz和1.6Hz,1H),7.40-7.17(m,12H),4.27(t,J＝6.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(q,J＝6.4Hz,4H)；ESI-MS计算m/z C23H22O3[M+H]+346.90测得346.43
步骤3)制备3,4-二苯乙氧基酚(2202)
将3,4-二苯乙氧基苯甲醛(2201，160g，0.46mmol)溶于二氯甲烷(DCM，2L)中，然后于其中加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA，119g，069mmol)。在室温下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，将该溶液过滤，然后浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：5)纯化浓缩的溶液。从而获得灰白色固体，3,4-二苯乙氧基酚(2202，100g)。ESI-MS计算m/z C22H22O3[M+H]+335.00测得334.42
步骤4)制备(R)-2-((3,4-二苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-2)
将3,4-二苯乙氧基酚(2202)(5g，15mmol)溶于乙醇(EtOH，50mL)中，然后于其中加入水(2.5mL)及氢氧化钾(KOH，1.93g，34.5mmol)。然后，加入(R)-2-(氯甲基)环氧乙烷(8g，87mmol)并在室温下搅拌约16个小时。于该反应溶液中加入水(50mL)使反应完全，用乙酸乙酯(EA，20mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂，用硫酸钠除去水，过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)萃取浓缩的溶液。从而获得白色固体，(R)-2-((3,4-二苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-2，2.5g)。ESI-MS计算m/zC25H26O4[M+H]+391.00测得390.48
步骤5)制备(R)-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)丙-2-醇(AL-4)
将(R)-2-((3,4-二苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-2，20g，51.2mmol)溶于乙腈(ACN，200mL)中，然后于其中加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙胺(L-2，15.2g，102.5mmol)。在70℃下搅拌该混合物约40个小时。反应完成时，过滤该反应溶液并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝100：1至30：1)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色液体，(R)-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)丙-2-醇(AL-4，12g)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ(ppm)8.52(s,3H),7.30-7.20(m,10H),6.85(d,J＝8Hz,1H),6.60(d,J＝2.8Hz,1H),6.47(dd,J＝8Hz和2Hz,1H),4.16(t,J＝6.8Hz,3H),4.08(t,J＝6.8Hz,2H),3.96(q,J＝4Hz,2H),3.79(t,J＝5.2Hz,2H),3.70(m,7H),3.32-3.25(m,3H),3.17-2.98(m,8H)；ESI-MS计算m/z C31H42N2O6[M+H]+539.20测得538.69
步骤6)制备液态3-(3,5-二氯苯基)-5-((R)-15-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)-14-羟基-6,9-二噁-3,12-二氮杂十五烷基)-5-甲基噁唑烷-2,4-二酮(烯菌酮-2204)
将(R)-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)丙-2-醇(AL-4，120mg，0.22mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后于其中加入烯菌酮(Vinclozolin)(117mg，0.33mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，过滤该溶液并浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化该浓缩的溶液。从而获得无色液体，3-(3,5-二氯苯基)-5-((R)-15-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)-14-羟基-6,9-二噁-3,12-二氮杂十五烷基)-5-甲基噁唑烷-2,4-二酮(烯菌酮-2204，15mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)1.65(m,3H),2.65(m,4H),2.97(m,4H),3.17(m,2H),3.42(m,8H),3.57(d,J＝8Hz,1H),3.80(m,3H),4.02(t,J＝8Hz,2H),4.13(t,J＝8Hz,2H),4.90(b,1H),5.33(m,2H),6.20(m,1H),6.38(d,J＝8Hz,1H),6.54(m,1H),6.82(d,J＝8Hz,1H),7.25(m,11H),7.49(d,J＝1Hz,1H),7.76(s,1H),9.70(s,1H)；ESI-MS计算m/z C43H51Cl2N3O9[M+H]+825.00测得824.79
实施例8：(R)-1-(4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯氧基)-3-((2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙-2-醇(PHTPP-1304)的制备
步骤1)制备4-(苯甲氧基)-3-羟苯甲醛(A-3)
将3,4-二羟苯甲醛(500g，3.62mol)溶于乙腈(ACN，7L)中，然后于其中加入碳酸氢钠(NaHCO3，395g，4.71mol)及苄溴(BnBr，619g，3.62mol)。在80℃下搅拌该混合物约16个小时。使用盐酸(3L，1N)使反应完全，用乙酸乙酯(3L×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，用硫酸钠除去剩余的水，过滤除去杂质并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(EA/PE＝20：1至10：1)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，4-(苯甲氧基)-3-羟苯甲醛(A-3，250g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.76(s,1H),9.65(s,1H),7.49(d,J＝6.8Hz,2H),7.42-7.34(m,4H),7.29(d,J＝2Hz,1H),7.19(d,J＝8Hz,1H),5.23(s,2H)
步骤2)制备4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯甲醛(1301)
将4-(苯甲氧基)-3-羟苯甲醛(A-3，120g，526mmol)溶于四氢呋喃(THF，2L)中，然后于其中加入3-苯丙-1-醇(85.9g，631mmol)、三苯基膦(PPh3，206.9g，789mmol)及偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，159.5g，789mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，将反应混合物过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯甲醛(1301，100g)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.82(s,1H),7.55-7.50(m,3H),7.38(t,J＝7.2Hz,3H),7.36-7.34(m,1H),7.29-7.25(m,3H),7.21-7.16(m,3H),5.26(s,2H),4.04(t,J＝6.4Hz,2H),2.76(t,J＝8Hz,2H),2.04(t,J＝7.2Hz,2H)
步骤3)制备4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)酚(1302)
将4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯甲醛(1301，100g，289mmol)溶于二氯甲烷(DCM，900mL)中，然后于其中加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA，74.7g，433mmol)。在室温下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，过滤该反应混合物，然后浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：5)纯化浓缩的溶液。从而获得灰白色固体，4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)酚(1302，66g)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)9.00(s,1H),7.44-7.18(m,10H),6.81(d,J＝8Hz,1H),6.39(d,J＝2.8Hz,1H),6.22(dd,J＝8.8Hz和2.8Hz,1H),4.96(s,2H),3.90(t,J＝6Hz,2H),2.74(t,J＝8Hz,2H),2.01(q,J＝5.6Hz,2H)
步骤4)制备(R)-2-((4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-4)
将4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)酚(1302，40g，60mmol)溶于乙醇(EtOH，800mL)中，然后于其中加入水(40mL)及氢氧化钾(KOH，8.0g，143mmol)。然后，加入(R)-2-(氯甲基)环氧乙烷(33.2g，359mmol)，然后在室温下搅拌约16个小时。反应完成时，于反应溶液中加入水(1600mL)使反应完全，用乙酸乙酯(1600mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，然后用硫酸钠除去剩余的水。利用过滤器除去杂质，然后浓缩，利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，(R)-2-((4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-4，30g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)7.46-7.17(m,10H),6.93(d,J＝8.8Hz,1H),6.61(d,J＝3.2Hz,1H),6.43(dd,J＝8.8Hz和2.8Hz,1H),5.02(s,2H),4.23(dd,J＝7.6Hz和2.8Hz,1H),3.97(t,J＝6.4Hz,2H),3.75(dd,J＝7.2Hz和1.6Hz,1H),3.28(m,1H),2.82(dd,J＝5.2Hz和4Hz,1H),2.75(t,J＝7.6Hz,2H),2.73-2.67(m,1H),2.01(m,2H)
步骤5)制备(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-4)
将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(L-3，5g，33mmol)溶于二氯甲烷(DCM，100mL)中，然后于其中加入三乙胺(TEA，4.1g，40mmol)及二碳酸二叔丁酯(Boc2O，8.1g，37mmol)。在室温下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，过滤该反应混合物，然后浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(EA/PE＝1：3至1：1)纯化浓缩的溶液。从而获得无色液体，(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-4，4.2g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)6.74(m,1H),4.56(t,J＝5.6Hz,1H),3.51-3.46(m,6H),3.42-3.37(m,4H),3.07-3.03(m,2H),1.37(s,9H)
步骤6)制备(2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-4)
将(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-4，300mg，1.2mmol)溶于四氢呋喃(THF，5mL)中，然后于其中加入4-[2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]酚(PHTPP，509mg，1.2mmol)、三苯基膦(PPh3，377mg，1.44mmol)及偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，291mg，1.44mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，中止反应，过滤该溶液并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(DCM/MeOH＝100：1至50：1)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-4，200mg)。
步骤7)制备2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(TL-5)
将(2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-4，200mg，0.31mmol)溶于乙酸乙酯(EA，4mL)中，然后于其中加入盐酸(g)/乙酸乙酯(1mL)。在室温下搅拌该混合物约2个小时。反应完成后，终止反应，过滤该溶液并浓缩。对浓缩的溶液进行纯化处理，从而获得黄色固体，2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(TL-5，120mg)。
步骤8)制备(R)-1-(4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯氧基)-3-((2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙-2-醇(PHTPP-1304)
将2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(TL-5，120mg，0.22mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后于其中加入(R)-2-((4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-4，117mg，0.33mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，终止反应，过滤该溶液并浓缩，利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(R)-1-(4-(苯甲氧基)-3-(3-苯丙氧基)苯氧基)-3-((2-(2-(2-(4-(2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙-2-醇(PHTPP-1304，15mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)1.99(m,2H),2.73(m,6H),3.55(m,8H),3.80(m,5H),3.94(t,J＝8Hz,2H),4.13(t,J＝4Hz,2H),4.99(s,2H),6.40(d,J＝8Hz,1H),6.55(d,J＝4Hz,1H),6.89(d,J＝8Hz,1H),7.04(d,J＝8Hz,2H),7.18(t,J＝4Hz,3H),7.27(dd,J＝4Hz和4Hz,3H),7.35(m,4H),7.44(m,5H),7.61(m,2H),8.07(s,1H),8.42(s,1H)；ESI-MS计算m/zC51H50F6N4O7[M+H]+945.10测得944.97
实施例9：(R,Z)-4-((2-(2-(2-((3-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚氨基)-2-苯基-4H-色烯-5,6,7-三醇(贝加因-2204)的制备
步骤1)制备(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-1)
将2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))二乙胺(L-2，5g，33.7mmol)溶于二氯甲烷(DCM，100mL)中，然后于其中加入二碳酸二叔丁酯(Boc2O，7.36g，33.7mmol)。在室温下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，过滤该反应溶液并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：3至1：1)纯化浓缩的溶液。从而获得无色液体，(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-2，2.2g)。
步骤2)制备(Z)-(2-(2-(2-((5,6,7-三羟基-2-苯基-4H-色烯-4-亚基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-6)
将(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-6，300mg，1.21mmol)溶于甲醇(MeOH，5mL)中，然后于其中加入5,6,7-三羟黄酮(贝加因(Baicalein)，326mg，1.21mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，过滤该反应溶液并浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(Z)-(2-(2-(2-((5,6,7-三羟基-2-苯基-4H-色烯-4-亚基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-6，120mg)。
步骤3)制备(Z)-4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)亚氨基)-2-苯基-4H-色烯-5,6,7-三醇(TL-7)
将(Z)-(2-(2-(2-((5,6,7-三羟基-2-苯基-4H-色烯-4-亚基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-6，120mg，0.24mmol)溶于乙酸乙酯(EA，2mL)中，然后于其中加入盐酸(g)/乙酸乙酯(1mL)。在室温下搅拌该混合物约2个小时。反应完成时，用乙酸乙酯萃取反应混合物，过滤并浓缩。从而获得黄色固体，(Z)-4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)亚氨基)-2-苯基-4H-色烯-5,6,7-三醇(TL-7，90mg)。
步骤4)制备(R,Z)-4-((2-(2-(2-((3-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚氨基)-2-苯基-4H-色烯-5,6,7-三醇(Baicalein-2204)
将(Z)-4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)亚氨基)-2-苯基-4H-色烯-5,6,7-三醇(TL-7，90mg，0.22mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后于其中加入(R)-2-((3,4-二苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-2，87mg，0.22mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，过滤该反应溶液并浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(R,Z)-4-((2-(2-(2-((3-(3,4-二苯乙氧基苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚氨基)-2-苯基-4H-色烯-5,6,7-三醇(贝加因-2204，12mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)2.91(m,7H),3.35(m,11H),3.80(m,3H),3.96(t,J＝8Hz,2H),4.08(t,J＝8Hz,2H),6.32(dd,J＝4Hz和4Hz,1H),6.37(s,1H),6.47(s,1H),6.76(d,J＝12Hz,2H),7.25(m,10H),7.58(t,J＝4Hz,3H),7.99(d,J＝8Hz,2H),8.42(s,1H)；ESI-MS计算m/z C46H50N2O10[M+H]+791.20测得790.91
实施例10：(E)-5-(4-(2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙烯基)苯-1,3-二醇(白藜芦醇-1105)的制备
步骤1)制备2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(AL-5)
将3,4-双(苯甲氧基)苯甲醛(1101，25g，78.6mmol)溶于甲醇(MeOH，250mL)中，然后于其中加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇(L-3，11.7g，78.6mmol)。在65℃下搅拌该混合物约6个小时。冷却至室温后，进一步加入硼氢化钠(NaBH4，3g，78.6mmol)，然后在50℃下搅拌一整夜。于该反应溶液中加入水使反应完全，用乙酸乙酯(EtOAc，50mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的化合物，用硫酸钠除去剩余的水。过滤后，将溶液浓缩且利用使用硅胶的柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝20：1)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色液体，2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(AL-5，13g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)7.46-7.30(m,10H),7.06(d,J＝1.6Hz,1H),6.97(d,J＝8Hz,1H),6.82(d,J＝1.2Hz,1H),5.10(d,J＝4Hz,4H),3.61(s,2H),3.50-3.39(m,11H),2.58(t,J＝6Hz,2H)ESI-MS计算m/z C27H33N5O5[M+H]+452.10测得451.56
步骤2)制备(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(AL-6)
将2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(AL-5，500mg，1.11mmol)溶于二氯甲烷(DCM，6mL)中，然后于其中加入三乙胺(TEA，168mg，1.66mmol)及二碳酸二叔丁酯(Boc2O，290mg，1.33mmol)。在室温下搅拌该混合物约4个小时。反应完成时，将反应溶液过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：5至1：1)纯化浓缩的溶液。从而获得无色的(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(AL-6，520mg)。
步骤3)制备(E)-(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)(2-(2-(2-(4-(3,5-二羟苯乙烯基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(ATL-1)
将(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(AL-6，300mg，0.54g)溶于四氢呋喃(THF，5mL)中，然后于其中加入白藜芦醇(Resveratrol)(149mg，0.65mmol)、三苯基膦(PPh3，214mg，0.82mmol)及偶氮二甲酸二异丙酯DIAD(165mg，0.82mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，将反应溶液过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝100：1至50：1)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(E)-(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)(2-(2-(2-(4-(3,5-二羟苯乙烯基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(ATL-1，200mg)。
步骤4)制备(E)-5-(4-(2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙烯基)苯-1,3-二醇(白藜芦醇-1105)
将(E)-(3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)(2-(2-(2-(4-(3,5-二羟苯乙烯基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(ATL-1，200mg)溶于乙酸乙酯(EA，4mL)中，然后于其中加入盐酸(g)/乙酸乙酯(1mL)。在室温下搅拌该混合物约2个小时。反应完成后，将反应溶液过滤，然后浓缩。利用高解析液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，(E)-5-(4-(2-(2-(2-((3,4-双(苯甲氧基)苯甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙烯基)苯-1,3-二醇(白藜芦醇-1105，15mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)2.58(t,J＝4Hz,2H),3.45(t,J＝4Hz,2H),3.51(m,2H),3.57(m,4H),3.73(m,2H),4.06(m,2H),5.07(m,4H),6.12(m,1H),6.40(m,2H),6.90(m,7H),7.39(m,12H),9.20(s,2H)；ESI-MS计算m/zC41H43NO7[M+H]+662.10测得661.80
实施例11：(R)-2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-14-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-5,8-二噁-2,11-二氮杂十四烷-13-醇(BTA-1-1104)的制备
步骤1)制备2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5-氮杂十三烷-13-基-甲磺酸酯(L-5)
将(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-4，1g，4.0mmol)溶于二氯甲烷(DCM，15mL)中，然后于其中加入三乙胺(TEA，0.486g，4.8mmol)及甲磺酰氯(MsCl，0.504g，4.4mmol)。在室温下搅拌该混合物约4个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤，然后浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：5至1：1)纯化浓缩的溶液。从而获得无色液体，2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5氮杂十三烷-13-基-甲磺酸酯(L-5，1g)。
步骤2)制备(2-(2-(2-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)(甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-8)
将2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5-氮杂十三烷-13-基-甲磺酸酯(L-5，300mg，0.92mmol)溶于二甲基亚砜(DMSO，5mL)中，然后于其中加入2-(4’-甲氨基苯基)苯并噻唑(BTA-1，220mg，0.92mmol)及叔丁醇钾(t-BuOK，154mg，1.37mmol)。在120℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，将反应溶液过滤，然后浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色液体，(2-(2-(2-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)(甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-8，180mg)。
步骤3)制备N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-甲苯胺(TL-9)
将(2-(2-(2-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)(甲基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-8，180mg，0.38mmol)溶于乙酸乙酯(EA，4mL)中，然后于其中加入盐酸(g)/乙酸乙酯(1mL)。在室温下搅拌该混合物2个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤，然后浓缩。从而获得黄色固体，N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-甲苯胺(TL-9，120mg)。
步骤4)制备(R)-2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-14-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-5,8-二噁-2,11-二氮杂十四烷-13-醇(BTA-1-1104)
将N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-甲苯胺(TL-9，120mg，0.33mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后于其中加入(R)-2-((3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)甲基)环氧乙烷(1103，117mg，0.33mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤，然后浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(R)-2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-14-(3,4-双(苯甲氧基)苯氧基)-5,8-二噁-2,11-二氮杂十四烷-13-醇(BTA-1-1104，8mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)1.15(d,J＝8Hz,3H),1.23(s,1H),2.67(m,4H),3.50(m,11H),3.81(m,4H),5.01(s,2H),5.10(s,2H),6.27(d,J＝8Hz,1H),6.41(d,J＝8Hz,1H),6.69(m,3H),6.91(d,J＝12Hz,1H),7.38(m,12H),7.79(d,J＝8Hz,2H),7.89(d,J＝8Hz,1H),7.90(d,J＝8Hz,1H),8.40(s,1H)；ESI-MS计算m/z C43H47N3O6S[M+H]+734.10测得733.92
实施例12：(1E,6E)-1-(4-(2-(2-(2-(((R)-3-(3-(苯甲氧基)-4-苯乙氧基苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-甲氧苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)庚-1,6-二烯-3,5-二酮(姜黄素-1204)的制备
步骤1)制备4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基苯甲醛(1201)
将4-(苯甲氧基)-3-羟苯甲醛(A-3，50g，219mmol)溶于四氢呋喃(THF，1L)中，然后于其中加入2-苯乙醇(32.1g，263mmol)、三苯基膦(PPh3，86.2g，329mmol)及偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，66.4g，329mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基苯甲醛(1201，25g)。
1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.82(s,1H),7.52(dd,J＝8Hz和2Hz,1H),7.43-7.40(m,5H),7.37-7.32(m,3H),7.28-7.21(m,4H),5.21(s,2H),4.26(t,J＝6.4Hz,2H),3.05(t,J＝6.4Hz,2H)
步骤2)制备4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基酚(1202)
将4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基苯甲醛(1201，50g，150mmol)溶于二氯甲烷(DCM，500mL)中，然后于其中加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA，39g，225mmol)。在室温下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：5)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基酚(1202，32mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.00(s,1H),7.36-7.20(m,10H),6.78(d,J＝8Hz,1H),6.43(d,J＝2.8Hz,1H),6.22(dd,J＝8Hz和2.8Hz,1H),4.86(s,2H),4.13(t,J＝6.8Hz,2H),3.02(t,J＝6.4Hz,2H)
步骤3)制备(R)-2-((4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(1203)
将4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基酚(1203，40g，64mmol)溶于乙醇(EtOH，800mL)中，然后于其中加入水(40mL)及氢氧化钾(KOH，8.2g，146mmol)。然后，加入(R)-2-(氯甲基)环氧乙烷(34.6g，374mmol)，进一步在室温下搅拌16个小时。于反应溶液中加入水(1600mL)使反应完全，用乙酸乙酯(1600mL×3)萃取。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层及用硫酸钠除去剩余的水。过滤所产生的材料除去杂质，并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)纯化浓缩的溶液。从而获得白色固体，(R)-2-((4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(1203，34g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)7.38-7.20(m,10H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.64(d,J＝2Hz,1H),6.41(dd,J＝8.8Hz和2.8Hz,1H),4.93(s,2H),4.25-4.17(m,3H),3.75(dd,J＝11.2Hz和6.4Hz,1H),3.28(m,1H),3.03(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(t,J＝4.4Hz,1H),2.67(dd,J＝5.2Hzhe 2.8Hz,1H)
步骤4)制备(2-(2-(2-(4-((1E,6E)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)-3,5-二氧代庚-1,6-二烯-1-基)-2-甲氧苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-10)
将(2-(2-(2-羟乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(L-4，300mg，1.2mmol)溶于四氢呋喃(THF，5mL)中，然后于其中加入姜黄素(curcumin)(442mg，1.2mmol)、三苯基膦(PPh3，377mg，1.44mmol)及偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，291mg，1.44mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝100：1至50：1)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(2-(2-(2-(4-((1E,6E)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)-3,5-二氧代庚-1,6-二烯-1-基)-2-甲氧苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-10，200mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)9.87(brs,1H),7.57(dd,J＝16Hz和4Hz,2H),3.34(dd,J＝12Hz和1.6Hz,2H),7.24(dd,J＝8Hz和1.2Hz,1H),7.16(dd,J＝8Hz和1.2Hz,1H),7.02(d,J＝8Hz,1H),6.85-6.74(m,4H),6.08(s,1H),4.13(t,J＝4Hz,2H),3.83(m,6H),3.75(t,J＝4Hz,2H),3.59(q,J＝4Hz,2H),3.52(q,J＝4Hz,2H),3.40-3.38(m,4H),3.06(q,J＝6Hz,2H),1.36(s,9H)
步骤5)制备(1E,6E)-1-(4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-甲氧苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)庚-1,6-二烯-3,5-二酮(TL-11)
将(2-(2-(2-(4-((1E,6E)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)-3,5-二氧代庚-1,6-二烯-1-基)-2-甲氧苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-10，200mg，0.33mmol)溶于乙酸乙酯(EA，4mL)中，然后于其中加入盐酸(g)/乙酸乙酯(1mL)。在室温下搅拌该混合物约2个小时。反应完成后，萃取化合物，过滤，然后浓缩。从而获得黄色固体，(1E,6E)-1-(4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-甲氧苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)庚-1,6-二烯-3,5-二酮(TL-11，120mg)。
步骤6)制备(1E,6E)-1-(4-(2-(2-(2-(((R)-3-(3-(苯甲氧基)-4-苯乙氧基苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-甲氧苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)庚-1,6-二烯-3,5-二酮(姜黄素-1204)
将(1E,6E)-1-(4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-甲氧苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)庚-1,6-二烯-3,5-二酮(TL-11，120mg，0.24mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后于其中加入(R)-2-((4-(苯甲氧基)-3-苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(1203，90mg，0.24mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤，然后浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色固体，(1E,6E)-1-(4-(2-(2-(2-(((R)-3-(3-(苯甲氧基)-4-苯乙氧基苯氧基)-2-羟丙基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-3-甲氧苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧苯基)庚-1,6-二烯-3,5-二酮(姜黄素-1204，12mg)。1H NMR(DMSO-d6+D2O,400MHz)δ(ppm)2.81(m,1H),2.92(m,3H),3.00(t,J＝6.4Hz,2H),3.56(m,9H),3.80(m,9H),3.97(b,2H),4.09(m,2H),4.14(t,J＝6.4Hz,2H),4.88(s,2H),6.36(dd,J＝8.8Hz和2.8Hz,1H),6.56(d,J＝2.8Hz,1H),6.79(m,4H),6.97(d,J＝8Hz,1H),7.23(m,14H),7.53(d,J＝16Hz,2H),8.33(s,1H)；ESI-MS计算m/z C51H57NO12[M]+876.10测得876.01
实施例13：(R)-1-(3-苯乙氧基苯氧基)-3-((2-(2-(2-((6-(三氟甲氧基))苯并[d]噻唑-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙-2-醇(利鲁唑-204)的制备
步骤1)制备3-苯乙氧基酚(A-5)
将间苯二酚(50g，0.45mol)溶于乙腈(ACN，500mL)中，然后于其中加入碳酸钾(K2CO3，112.5g，0.81mol)及(2-溴乙基)苯(83.2g，0.45mol)。在60℃下搅拌该混合物约10个小时。反应完成后，萃取化合物，过滤并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(石油醚/乙酸乙酯＝5：1)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色液体，3-苯乙氧基酚(A-5，25g)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm)7.31-7.23(m,5H),7.11(t,J＝8Hz,1H),6.50-6.39(m,3H),4.74(s,1H),4.14(m,2H),3.08(t,J＝7.2Hz,2H)
步骤2)制备(R)-2-((3-苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-6)
将3-苯乙氧基酚(A-5，25g，116.8mmol)溶于乙醇(EtOH，500mL)中，然后于其中加入水(25mL)及氢氧化钾(KOH，11.1g，278.3mmol)。然后，加入(R)-2-(氯甲基)环氧乙烷(64.6g，698.8mmol)，然后在室温下搅拌约16个小时。于反应溶液中加入水(1000mL)使反应完全，用乙酸乙酯(500mL×3)萃取化合物。用盐水洗涤萃取的有机溶剂层，用硫酸钠除去剩余的水。过滤所产生的材料除去杂质并浓缩。利用使用硅胶的柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1：15至1：10)纯化浓缩的溶液。从而获得黄色液体(R)-2-((3-苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-6，18g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)7.32-7.28(m,4H),7.24-7.14(m,2H),6.52(m,3H),4.29(dd,J＝11.2Hz和2Hz,1H),4.16(t,J＝6.8Hz,2H),3.79(m,1H),3.34(s,1H),3.01(t,J＝6Hz,2H),2.82(t,J＝4Hz,1H),2.69-2.67(m,1H)
步骤3)制备(2-(2-(2-((6-(三氟甲氧基)苯并)[d]噻唑-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-12)
将2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三噁-5氮杂十三烷-13-基-甲磺酸酯(L-5，300mg，0.92mmol)溶于二甲基亚砜(DMSO，5mL)中，然后于其中加入利鲁唑(Riluzole)(214mg，0.92mmol)及叔丁醇钾(t-BuOK，154mg，1.37mmol)。在120℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，萃取化合物，过滤，然后浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得淡黄色液体，(2-(2-(2-((6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-12，180mg)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ(ppm)8.27-8.25(m,1H),7.78(d,J＝1.6Hz,1H),7.41(d,J＝8Hz,1H),7.18(dd,J＝8Hz和1.6Hz,1H),6.74(m,1H),3.63-3.51(m,12H),3.05(q,J＝6Hz,2H),1.36(s,11H)
步骤4)制备N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺(TL-13)
将(2-(2-(2-((6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(TL-12，180mg，0.39mmol)溶于乙酸乙酯(EA，4mL)中，然后于其中加入盐酸(g)/乙酸乙酯(1mL)。在室温下搅拌该混合物约2个小时。反应完成时，萃取化合物，过滤并浓缩。从而获得黄色固体，N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺(TL-13，120mg)。
步骤5)制备(R)-1-(3-苯乙氧基苯氧基)-3-((2-(2-(2-((6-(三氟甲氧基))苯并[d]噻唑-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙-2-醇(利鲁唑-204)
将N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺(TL-13，120mg，0.33mmol)溶于甲醇(MeOH，2mL)中，然后于其中加入(R)-2-((3-苯乙氧基苯氧基)甲基)环氧乙烷(A-6，89mg，0.33mmol)。在65℃下搅拌该混合物约16个小时。反应完成后，萃取化合物，过滤并浓缩。利用制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)纯化浓缩的溶液。从而获得无色液体，(R)-1-(3-苯乙氧基苯氧基)-3-((2-(2-(2-((6-(三氟甲氧基))苯并[d]噻唑-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)丙-2-醇(利鲁唑-204，15mg)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2.60(m,4H),3.00(t,J＝8Hz,2H),3.52(m,10H),3.85(m,3H),4.15(t,J＝8Hz,2H),6.48(dd,J＝12Hz和8Hz,3H),7.18(m,3H),7.31(d,J＝4Hz,4H),7.43(d,J＝12Hz,1H),7.75(s,1H)；ESI-MS计算m/z C31H36F3N3O6S[M+H]+636.10测得635.70
实验例1.利用免疫印迹法评估培养细胞中p62蛋白的寡聚合活性
为了评估化合物1至13(实施例1至13)的p62蛋白寡聚合活性的功效，收集HEK293细胞系，其是人胚胎肾源性细胞。用实施例的化合物及p62配体化合物YTK-1105处理细胞，并用DMSO处理的细胞作为对照组。
为测量以这些化合物处理的细胞中的胞内p62蛋白活化及寡聚合，将各细胞分配至100pi皿中。在进一步培养24个小时后，收集细胞，如此细胞完全地贴附至板的表面。于各样品中注入100ul的裂解缓冲液(20mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、2mMNaF、2mM EDTA、2mMβ-甘油磷酸盐、5mM正钒酸钠、1mM PMSF、亮抑酶肽、抑肽酶)，将细胞裂解。根据测得的总蛋白浓度，用测试化合物在室温下处理各样品2个小时，然后加入样品缓冲液，使其在95℃下反应10分钟。反应后，从样品中取25ul并将其分配于各个丙烯酰胺凝胶孔中，然后进行免疫印迹法。免疫印迹显示来自三个或更多个独立实验的代表性结果。结果示于图2a至2c中。
如图2a至2c所示，证实与作为对照组的DMSO处理时的不同，当用根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物及p62配体化合物YTK-1105处理时，导致p62蛋白的单体减少，同时低聚物及高分子聚集体增加。
实验例2.利用免疫印迹法评估培养细胞中的靶蛋白质降解
为了评估化合物(实施例1至13)的靶蛋白质降解功效，将主要表达靶蛋白质的细胞系(MCF7、NTERA-2、ACHN、U87-MG、LNCaP、HEK293T)或基因重组细胞系(SH-SY5Y-tau、HeLa-HttQ97、PC12-a-synA30P)培养在12孔板中，且按浓度以相应的AUTOTAC嵌合化合物处理，然后进行如实验例1中的免疫印迹法。免疫印迹显示来自三个或更多个独立实验的代表性结果。结果示于图3a、3b及3c中。
如图3a、3b及3c所示，证实当用根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物处理时，靶蛋白质水平随着化合物的浓度逐渐增加。
实验例3.利用免疫印迹法评估培养细胞中的靶蛋白质降解机制
为了评估前述化合物(实施例1-13)的靶蛋白质降解机制是否由自噬介导，将主要表达靶蛋白质的细胞系或基因重组细胞系培养在12孔板中，且单独用2.5μM的对应的AUTOTAC嵌合化合物处理或结合10μM的羟氯喹(HCQ)(一种自噬-溶酶体途径的抑制剂)处理，然后进行如实验例1的免疫印迹法。免疫印迹显示来自三个或更多个独立实验的代表性结果。结果示于图4a及4b中。
如图4a及4b所示，证实当单独用根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物处理时，该靶蛋白质水平减少，而当结合HCQ(自噬-溶酶体途径的抑制剂)处理时，降低的靶蛋白质水平再次增加。
实验例4.利用免疫印迹法比较评估培养细胞中的靶蛋白质降解功效
为评估化合物(实施例1至13)的靶蛋白质降解功效是否优于该p62配体或该靶蛋白质配体(其是嵌合组份)的靶蛋白质降解功效，将主要表达靶蛋白质的细胞系或基因重组细胞系培养在12孔板中，且用相应的AUTOTAC嵌合化合物、p62配体或靶蛋白质配体处理，然后进行如实验例1的免疫印迹法。免疫印迹显示来自三个或更多个独立实验的代表性结果。结果示于图5a至5c中。
如图5a至5c所示，证实与用p62配体或靶蛋白质配体处理后的相比，用根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物处理后的靶蛋白质水平显著地减少。
实验例5.利用免疫荧光染色及共聚焦显微镜评估培养细胞中P62介导的递送靶标蛋白质的活性
为证实用化合物(实施例1-13)处理后p62介导递送靶蛋白质至自噬的功效，使用p62及各靶蛋白质作为标记，进行免疫荧光染色。将玻璃罩置于用于免疫荧光染色的24孔板上，培养主要表达靶蛋白质的细胞系或基因重组细胞系。分配细胞并培养24个小时，然后用2.5μM根据本发明的新颖的AUTOTAC嵌合配体处理。将细胞进一步培养24个小时以发挥化合物的作用，除去培养基，在室温下使用甲醛固定细胞。为了防止非特异性染色，让细胞与封闭溶液在室温下反应1个小时，然后使用该封闭溶液处理稀释成特定比率的p62抗体及靶蛋白质抗体，然后在室温下反应1个小时。在用PBS洗涤抗体处理的细胞三次后，使用封闭溶液将山羊来源二抗稀释至特定比例，然后在室温下反应30分钟。再次用PBS洗涤细胞三次，并进行对胞内核染色的DAPI染色处理，然后使用共聚焦显微镜观察p62与LC3的表达水平、胞内荧光斑点形成及胞内共存的水平。结果示于图6a至6c中。免疫荧光染色显示来自三个或更多个独立实验的代表性结果。
如图6a至6c所示，证实在用根据本发明的AUTOTAC嵌合化合物处理后，胞内p62蛋白的荧光斑点的形成、胞内靶蛋白质的荧光斑点的形成及其局部共存增加。
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