基于Kdo的糖脂衍生物及其制备和抗菌应用
阅读说明：本技术 基于Kdo的糖脂衍生物及其制备和抗菌应用 (Kdo-based glycolipid derivatives, their preparation and their antibacterial applications ) 是由 冯颖乐 柴永海 刘爱云 张琦 于 2021-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于Kdo的糖脂衍生物及其制备和抗菌应用,所述衍生物的结构式为：式中R～1为脂肪族氨基(即CH-3(CH-2)-nNH-,n＝1～17),R～2＝-NH-3～+Cl～-；或者R～1为-OH或-O～-NH-4～+,R～2为RCONH-(R为C-(1～18)的饱和或者不饱和烷基)。本发明中的糖脂与已报道的糖脂相比,是基于革兰式阴性菌来源的重要单糖Kdo(3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸)制备的非天然糖脂类化合物,该类化合物可作为新型的抗菌物质。(The invention discloses a Kdo-based glycolipid derivative, a preparation method and an antibacterial application thereof, wherein the structural formula of the derivative is as follows: in the formula R 1 Is an aliphatic amino group (i.e. CH) 3 (CH 2 ) n NH‑，n＝1～17)，R 2 ＝‑NH 3 + Cl ‑ (ii) a Or R 1 is-OH or-O ‑ NH 4 + ，R 2 Is RCONH- (R is C) 1～18 Saturated or unsaturated alkyl groups). Compared with the reported glycolipids, the glycolipid is an unnatural glycolipid compound prepared based on an important monosaccharide Kdo (3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) from gram-negative bacteria, and the compound can be used as a novel antibacterial substance.)
技术领域
本发明属于糖脂类化合物的合成技术领域，具体涉及一种以革兰式阴性菌、植物、藻类等生物中的稀缺性单糖Kdo(3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸)为骨架的糖脂衍生物。该类化合物可以被作为潜在的新型抗菌化合物，从而用于抑制革兰式阳性菌和革兰式阴性菌的生长。
背景技术
天然的糖脂具有低毒、可降解、可再生、环境友好等优点，以槐糖脂、海藻糖脂及鼠李糖脂为代表的天然糖脂可以降低表面及界面张力，促使洗涤剂泡沫的形成以及润湿能力而被广泛应用于化妆品、医药、环境保护以及节能技术中。重要的是，糖脂还能诱导细胞膜中孔道或者离子通道的形成，破坏膜的完整性及渗透率。因此，糖脂还具有抗细菌、真菌、病毒及支原体的作用。此外，糖脂还能调节酶的活性而被用于提高或者抑制酶的活性(Carbohydr.Res.2015,416,59.)。
尽管如此，天然的糖脂具有微观不均一性，以结构明确的天然糖脂进行物理化学性质及功能研究具有极大的限制，目前主要集中在一些常见的糖脂如槐糖脂的研究上。基于化学合成糖脂的研究也仅仅是在简单的葡萄糖、甘露糖、乳糖等基础上进行的(Chem.Rev.2016,116,1693.)。
Kdo，即3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，是革兰氏阴性菌最外层脂多糖层的重要组成成份。在脂多糖合成过程中，Kdo的引入是脂多糖合成的关键性步骤。与此同时，大量研究表明Kdo的两种衍生物(2-脱氧-β-Kdo及8-氨基-2,8-二-脱氧-β-Kdo)在体外测试中对脂多糖合成中的关键性酶有着很好的抑制活性。然而，由于强烈的水溶性，该类化合物很难穿透细胞膜到达细胞体内发生抑制活性。为了解决该问题，有多个小组通过对Kdo衍生化，以期望筛选出对革兰氏阴性菌具有良好抑制效果的化合物(Nat.Prod.Rep.2010,27,1618–1629)。如Claesson等在8-氨基-2,8-二-脱氧-β-Kdo的8位引入氨基酸及二肽，其中通过N端引入的二肽类衍生物对几种革兰氏阴性菌表现出较好的抑制效果(J.Med.Chem.1987,30,2309-2313)。另外也有其它端位(Carbohydr.Res.1987,166,233-251)或者8位的Kdo衍生物被用于脂多糖合成中的关键性酶的抑制测试。但即使对酶有抑制活性的化合物，也未必就能实现对细菌的生长抑制(J.Med.Chem.1989,32,1069-1074.)。
发明内容
本发明的目的是提供一类基于Kdo的糖脂衍生物，以及该糖脂衍生物的制备方法和应用。
针对上述目的，本发明所采用的基于Kdo的糖脂衍生物的结构式如下所示：
式中，R1为脂肪族氨基，R2为-NH3 +Cl-，所述的脂肪族氨基为CH3(CH2)nNH-，n为1～17的整数；或R1为-OH或-O-NH4 +，R2为RCONH-，其中R为C1～18的饱和或不饱和烷基。
当上述结构式中的R1为脂肪族氨基，R2为-NH3 +Cl-时，所述糖脂衍生物的制备方法如下：
1、以甲醇或水为反应介质，将化合物1与碱按摩尔比为1:1～10，在0～50℃下反应1～24小时，分离纯化产物，得到化合物2，其反应方程如下：
2、将化合物2与脂肪族胺(CH3(CH2)nNH2，式中n为1～17的整数)、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)按摩尔比为1:1～2:1～3:1.5～2.5加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在0～40℃下反应3～24小时，分离纯化产物，得到化合物3，其反应方程如下：
3、将化合物3溶解于极性溶剂中，加入钯碳，通入氢气，并于室温搅拌1～12小时，得到还原产物，过滤除去钯碳后，所得溶液以氯化氢水溶液酸化处理得到目标化合物I，即糖脂衍生物，其反应方程式如下：
当上述结构式中R1为-OH或-O-NH4 +，R2为RCONH-时，其中R为C1～18的饱和或不饱和烷基，所述糖脂衍生物的制备方法如下：
1、将化合物1与有机膦按摩尔比为1:1～5溶于四氢呋喃与水的混合溶液中，在40～90℃下反应3～24小时，待反应液冷却到室温后，浓缩除去溶剂，柱色谱分离得化合物4，其反应方程式如下：
2、将化合物4与脂肪族羧酸、缩合剂、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)按摩尔比为1:1～2:1～3:1.5～2.5加入DMF中，在0～40℃下反应3～24小时，分离纯化产物，得到化合物5；或者将化合物4与五氟苯酚酯、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)按摩尔比1:1～2:1～2加入DMF中，在0～60℃下反应3～24小时，分离纯化产物，得到化合物5。其反应方程式为：
上述的脂肪族羧酸的结构式RCOOH和五氟苯酚酯的结构式中，R为C1～18的饱和或不饱和烷基。
3、将化合物5溶解与二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，室温搅拌下向其中加入碱水溶液，所述化合物5与碱的摩尔比1:1～8，并于室温下搅拌反应3～6小时，待反应完后，产物以酸性离子交换树脂中和，过滤浓缩得目标化合物II。目标化合物II进一步可以通过氨水处理，浓缩后得其铵盐，即目标化合物III，具体反应方程式如下：
上述制备方法中，所述的碱具体如氢氧化钠、氢氧化锂等；所述的缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)与1-羟基苯并三唑(HOBt)摩尔比为1～2:1的混合物；所述的有机膦具体如三甲基膦或三苯基膦等；所述的极性溶剂具体如乙醇、甲醇等醇类溶剂。
本发明所述的糖脂衍生物可制备成抗菌材料，用于革兰式阳性菌和革兰式阴性菌的生长抑制。
本发明的有益效果如下：
本发明基于糖脂类化合物可以通过对细菌膜结构的物理性破坏来实现抗菌效果，而Kdo衍生物又会对革兰氏阴性菌的关键性酶有抑制活性，通过在8-氨基-2,8-二-脱氧-β-Kdo骨架上引入烷基链来提高Kdo衍生物的穿膜能力，所得到的糖脂衍生物，尤其是阳离子型化合物对革兰氏阳性菌或者阴性菌具有良好到中等的抑制效果。
附图说明
图1是实施例1中终产物的核磁氢谱图。
图2是实施例2中终产物的核磁氢谱图。
图3是实施例3中终产物的核磁氢谱图。
图4是实施例4中终产物的核磁氢谱图。
图5是实施例5中终产物的核磁氢谱图。
图6是实施例3中终产物对大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌效果对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将100mg(0.36mmol)化合物1溶解于1mL甲醇中，室温搅拌下向其中滴加3.6mL0.5mol/L氢氧化锂水溶液，所得混合物于室温下搅拌2h后，以酸性离子交换树脂中和至中性，过滤浓缩得化合物2(87mg，0.36mmol，收率100％)，所得粗产物直接用于后续反应。
2、将87mg(0.36mmol)化合物2、116mg(0.43mmol)硬脂胺溶解于4mL DMF中，室温搅拌下向该溶液中依次加入89mg(0.46mmol)EDCI、63mg(0.47mmol)HOBt以及108μL(0.62mmol)DIPEA，室温搅拌8.5h后，浓缩除去溶剂，所得糖浆以CH2Cl2溶解后再以H2O洗，收集有机相并以Na2SO4干燥，过滤浓缩，柱色谱层析(CH2Cl2/MeOH＝10:1，v/v)得化合物3-1(80mg，0.16mmol，收率44％)。
所得化合物3-1的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.41(t,J＝5.8Hz,1H),5.28(d,J＝6.2Hz,1H),4.69(d,J＝5.4Hz,1H),4.34(d,J＝4.7Hz,1H),4.25(d,J＝6.2Hz,1H),3.87(d,J＝7.0Hz,1H),3.71(d,J＝4.3Hz,1H),3.57(dd,J＝12.8,2.3Hz,1H),3.28–3.14(m,3H),3.00(dd,J＝12.8,6.4Hz,1H),2.01(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),1.81(td,J＝12.1,6.5Hz,1H),1.42(s,2H),1.23(s,30H),0.85(t,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO)δ170.01,73.08,67.97,65.89,65.80,54.05,38.49,31.27,29.08,29.00,28.93,28.74,28.68,27.03,26.39,22.08,13.94；MALDI-TOF MS:[M+Na]+理论值:521.3679,计算值:521.3854.
3、将80mg(0.16mmol)化合物3-1溶解于5mL甲醇中，搅拌下向溶液中加入17mg10％Pd/C，减压除氧后，向反应瓶中通入氢气并室温搅拌反应12h。反应完后过滤除去Pd/C，并向滤液中加入0.5mL 1mol/L HCl水溶液，浓缩得白色固体化合物I-1(31mg，0.06mmol，收率32％)。
所得化合物I-1的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(t,J＝5.8Hz,2H),7.88(t,J＝5.8Hz,1H),4.30(dd,J＝6.0,1.5Hz,1H),3.86(td,J＝7.8,3.0Hz,1H),3.72(d,J＝2.8Hz,1H),3.44(ddd,J＝11.7,4.8,2.8Hz,1H),3.23(dd,J＝7.7,1.0Hz,1H),3.15–3.06(m,1H),3.06–2.97(m,1H),2.82–2.69(m,1H),2.03–1.81(m,2H),1.39(t,J＝6.9Hz,2H),1.22(s,30H),0.87–0.81(m,3H),见图1；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.84,76.40,72.61,65.97,65.81,65.59,42.81,38.62,31.33,29.15,29.10,29.08,29.05,28.81,28.75,28.15,26.47,22.12,13.95；MALDI-TOF MS:[M+H]+理论值:473.3949,实测值:473.3700.
实施例2
1、将200mg(0.73mmol)化合物1溶解于7mL四氢呋喃与去离子水体积比为6:1的混合溶液中，并加入526mg(1.78mmol)三苯基膦，所得混合物加热到60℃反应7h；待反应液冷却到室温后，浓缩除去溶剂，所得糖浆以去离子水溶解并以乙酸乙酯洗三次，浓缩水相得白色固体化合物4(172mg，0.68mmol，收率96％)。
所得化合物4的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.61–4.53(m,1H),4.30–4.18(m,2H),3.94(d,J＝2.5Hz,1H),3.93–3.87(m,1H),3.64–3.54(m,1H),3.49(dd,J＝8.5,0.8Hz,1H),3.01(dd,J＝13.4,3.4Hz,1H),2.93(dd,J＝13.4,5.7Hz,1H),2.20–2.09(m,2H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H).
2、将132mg(0.53mmol)化合物4、305mg(0.68mmol)十八碳羧酸五氟苯酚酯、111μL(0.64mmol)DIPEA加入3mL DMF中，于50℃下反应8h；待溶液冷却至室温后，减压浓缩除去溶剂，柱层析分离(CH2Cl2/MeOH＝10:1，v/v)得化合物5-1(113mg，0.22mmol，收率32％)。
所得化合物5-1的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.09(dd,J＝7.8,4.5Hz,1H),4.53(d,J＝6.24Hz,1H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),4.05(s,1H),4.00–3.85(m,2H),3.62(ddt,J＝12.2,5.4,2.5Hz,1H),3.44(d,J＝8.9Hz,1H),3.26(dt,J＝14.5,4.2Hz,1H),2.36–2.12(m,4H),1.69–1.54(m,2H),1.36–1.12(m,33H),0.93–0.83(m,3H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ176.55,172.11,74.81,72.42,68.83,66.62,66.20,61.57,42.92,36.49,31.90,29.70,29.69,29.68,29.64,29.55,29.36,29.34,29.32,29.01,25.70,22.67,14.18,14.10；MALDI-TOF MS:[M+Na]+理论值:538.3720,实测值:538.3184.
3、将75mg(0.14mmol)化合物5-1溶解于3mL二氯甲烷与甲醇体积比为1:1的混合溶液中，室温搅拌下向其中加入0.65mL 0.5mol/L氢氧化钠水溶液，于室温下搅拌3.5h后，产物以酸性离子交换树脂Dowex 50WX8中和，过滤浓缩得目标化合物II-1(59mg，0.12mmol，收率86％)。
所得化合物II-1的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.36(d,J＝5.3Hz,1H),3.72(d,J＝2.8Hz,1H),3.68–3.60(m,3H),3.38(ddd,J＝11.2,5.8,2.7Hz,1H),3.26(d,J＝8.7Hz,1H),2.88–2.78(m,1H),2.08(t,J＝7.4Hz,2H),2.00–1.84(m,2H),1.46(p,J＝7.2Hz,2H),1.21(s,26H),0.89–0.78(m,3H),见图2；13C NMR(100MHz,DMSO)δ172.50,75.62,72.01,67.26,66.61,65.93,42.77,35.53,31.35,29.11,29.06,28.95,28.77,25.40,22.15,14.01；MALDI-TOF MS:[M-H]-理论值:486.3436,实测值:486.8383.
向上述化合物II-1中加入过量的氨水/MeOH溶液，搅拌10min后，旋干，即可得到羧酸铵盐，即目标化合物III-1。
实施例3
1、将396mg(1.44mmol)化合物1溶解于6mL甲醇中，室温搅拌下向其中滴加13.34mL0.5mol/L氢氧化锂水溶液，所得混合物于室温下搅拌4h后，以酸性离子交换树脂中和至中性，过滤浓缩得化合物2(340mg，1.38mmol，收率96％)，所得粗产物直接用于后续反应。
2、将184mg(0.73mmol)化合物2、173mg(0.81mmol)饱和碳十四胺溶解于4mL DMF中，室温搅拌下向该溶液中依次加入172mg(0.90mmol)EDCI、118mg(0.56mmol)HOBt以及300μL(1.82mmol)DIPEA，室温搅拌12h后，浓缩除去溶剂，所得糖浆以CH2Cl2溶解后再以H2O洗，收集有机相并以Na2SO4干燥，过滤浓缩，柱色谱层析(CH2Cl2/MeOH＝10:1，v/v)得化合物3-2(206mg，0.47mmol，收率64％)。
所得化合物3-2的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.41(t,J＝5.7Hz,1H),5.29(d,J＝6.1Hz,1H),4.70(d,J＝5.4Hz,1H),4.35(d,J＝4.6Hz,1H),4.25(d,J＝6.1Hz,1H),3.93–3.83(m,1H),3.71(s,1H),3.56(dd,J＝12.8,2.2Hz,1H),3.46–3.37(m,1H),3.30–3.14(m,2H),3.00(dq,J＝12.5,6.7Hz,1H),2.02(dt,J＝12.4,4.4Hz,1H),1.81(td,J＝12.3,6.5Hz,1H),1.48–1.34(m,2H),1.23(s,22H),0.89–0.81(m,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.05,75.12,73.12,67.99,65.92,65.83,54.06,38.53,31.32,29.11,29.08,29.05,29.02,28.97,28.78,28.73,27.04,26.43,22.11,13.95；MALDI-TOFMS:[M+Na]+理论值:465.3053,实测值:465.2897.
3、将192mg(0.38mmol)化合物3-2溶解于10mL甲醇中，搅拌下向溶液中加入158mg10％Pd/C，减压除氧后，通入氢气并于室温搅拌12h。反应完后过滤除去Pd/C，并向滤液中加入1mL 1mol/L HCl水溶液，浓缩得白色固体化合物I-2(170mg，0.038mmol，收率100％)。
所得化合物I-2的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(s,2H),7.87(t,J＝5.7Hz,1H),4.32(d,J＝5.3Hz,1H),4.18–4.04(m,1H),3.87(td,J＝7.7,2.9Hz,1H),3.73(s,1H),3.45(ddd,J＝11.8,4.8,2.8Hz,1H),3.23(d,J＝7.9Hz,1H),3.19–2.97(m,2H),2.83–2.72(m,1H),2.06–1.83(m,2H),1.45–1.33(m,2H),1.23(s,22H),0.87–0.83(t,J＝6.9,3H),见图3；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.87,76.45,72.62,65.97,65.83,65.60,42.81,38.62,31.33,29.15,29.10,29.06,28.80,28.75,28.18,26.47,22.13,13.98；MALDI-TOF MS:[M+H]+理论值:417.3323,实测值:417.3350.
实施例4
1、将200mg(0.73mmol)化合物1溶解于14mL四氢呋喃与去离子水体积比为6:1的混合溶液中，并加入300mg(1.14mmol)三苯基膦，所得混合物加热到60℃反应12h；待反应液冷却到室温后，浓缩除去溶剂，所得糖浆以去离子水溶解并以乙酸乙酯洗三次，浓缩水相得白色固体化合物4(152mg，0.61mmol，收率84％)。
2、将100mg(0.40mmol)化合物4、271mg(0.69mmol)十四碳羧酸五氟苯酚酯、111μL(0.64mmol)DIPEA加入3mL DMF中，于50℃下反应8h；待溶液冷却至室温后，减压浓缩除去溶剂，柱层析分离(CH2Cl2/MeOH＝10:1，v/v)得化合物5-2(120mg，0.26mmol，收率49％)。
所得化合物5-2的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.91(t,J＝6.1Hz,1H),4.52(d,J＝6.7Hz,1H),4.23(q,J＝7.2Hz,2H),4.08(s,1H),4.00–3.86(m,2H),3.71–3.57(m,2H),3.46(d,J＝9.0Hz,2H),3.37–3.25(m,1H),2.36–2.22(m,2H),2.15(td,J＝12.9,6.7Hz,1H),1.70–1.58(m,2H),1.38–1.18(m,25H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.94,171.98,77.32,77.00,76.68,74.61,72.36,69.44,66.56,66.30,61.58,43.05,36.40,31.90,30.12,29.68,29.65,29.52,29.34,29.28,25.66,22.67,14.20,14.10；MALDI-TOF MS:[M+Na]+理论值:482.3094,实测值:482.2968.
3、将80mg(0.17mmol)化合物5-2溶解于3mL二氯甲烷与甲醇体积比为1:1的混合溶液中，室温搅拌下向其中加入0.65mL0.5mol/L氢氧化钠水溶液，所于室温下搅拌3.5h后，产物以酸性离子交换树脂Dowex 50WX8中和，过滤浓缩得化合物II-2(68mg，0.16mmol，收率94％)。
所得化合物II-2的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.71(s,1H),4.64(s,1H),4.33(s,1H),4.23(s,1H),3.73(s,1H),3.70–3.62(m,2H),3.43–3.26(m,2H),2.83(ddd,J＝13.7,6.7,3.4Hz,1H),2.09(t,J＝7.5Hz,2H),1.97–1.89(m,2H),1.52(t,J＝7.1Hz,3H),1.24(s,22H),0.90–0.82(t,3H),见图4；13C NMR(100MHz,DMSO)δ172.52,75.51,72.11,67.23,66.60,65.95,42.74,35.51,31.30,29.08,29.03,29.00,28.95,28.90,28.72,25.36,22.10,13.95；MALDI-TOF MS:[M-H]-理论值:430.2810,实测值:430.6582.
实施例5
1、该步骤与实施例2的步骤1相同。
2、将62.5mg(0.25mmol)化合物4、90mg(0.32mmol)亚油酸溶解于2mL DMF中，室温搅拌下向混合物溶液中加入198mg(0.38mmol)PyBOP、66μL(0.40mmol)DIPEA，室温搅拌反应16h后，浓缩，硅胶柱色谱分离，得化合物5-3(71mg，0.14mmol，56％)。
3、将71mg(0.14mmol)化合物5-3溶解于1.8mL甲醇中，室温搅拌下向其中加入0.45mL 0.5mol/L氢氧化钠水溶液，于室温下搅拌1.5h后以酸性离子交换树脂Dowex 50WX8中和，过滤浓缩得化合物II-3(44mg，0.091mmol，收率65％)。
所得化合物II-3的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,MeOD)δ5.41–5.31(m,2H),4.47(d,J＝6.1Hz,1H),4.00–3.91(m,2H),3.85(dd,J＝14.0,2.7Hz,1H),3.66(ddd,J＝11.8,4.6,2.9Hz,1H),3.55(d,J＝8.7Hz,1H),3.24(dd,J＝13.9,4.7Hz,1H),2.35–2.09(m,4H),2.09–1.97(m,4H),1.74–1.55(m,2H),1.47–1.21(m,20H),0.92–0.88(t,J＝6.7Hz,3H),见图5.
实施例6
实施例1和3制备的糖脂衍生物的体外抗菌活性测试
测试过程：分别选取两种革兰式阳性菌(粪肠球菌E.faecium和金黄色葡萄球菌S.aureus)以及两种革兰式阴性菌(大肠杆菌E.coli和绿脓杆菌P.aeruginosa)，采用倍比稀释法测定了以上所述糖脂衍生物对于细菌生长(24h)的抑制作用。以市售的两种抗生素万古霉素及庆大霉素为阳性对照。采用常量肉汤稀释法(Constant broth dilutionmethod)测MIC值，具体过程为：取384μL 4mg/mL的样品水溶液，加入1.808mL培养基中，混匀后，吸取1mL至第2管，在混匀后再吸取1mL至第3管，如此重复，并从最后第10管弃去1mL，第11管为不含药物的生长对照。配制得到样品浓度为768、384、192、96、48、24、12、6、3、1.5μg/mL。取新摇菌种0.2mL，100倍稀释至20mL，分别取1mL放入上述样品中，使菌液的浓度约为5*105CFU/mL。样品终浓度为384、192、96、48、24、12、6、3、1.5、0.75μg/mL，37℃培养箱中孵育培养24h后，目测溶液无浑浊及OD600所测数值与阴性对照相当者为MIC值，重复三次确定最终MIC值。
测试结果：实验结果表明化合物I-1表现出对革兰式阳性菌的良好抑制作用，对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的抑制浓度分别为12μg/mL和6μg/mL。而实施例3中含有C14烷基链的化合物I-2则对革兰式阳性菌和阴性菌均表现出良好的抑制活性，对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及粪肠球菌的抑制浓度依次为：24、24、24和12μg/mL。透射电子显微镜可观察到细菌与糖脂I-2共孵育24h后，细菌的膜结构会被破坏，从而导致细菌死亡，部分抗菌前后细菌状态见图6。
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