抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用
阅读说明：本技术 抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用 (Application of substance for inhibiting OaGS3 gene expression in regulating and controlling length of tetraploid wild rice grains ) 是由 李家洋 余泓 孟祥兵 张静昆 刘贵富 荆彦辉 陈明江 于 2021-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了调控OaGS3基因的物质在调控四倍体野生稻产量/籽粒长度中的应用。本发明的具体实施例证明通过编辑基因OaGS3,可实现籽粒长度的增加,从而选育产量较高的四倍体野生稻,推进四倍体野生稻的驯化与利用。(The invention provides application of a substance for regulating an OaGS3 gene in regulating and controlling the yield/seed length of tetraploid wild rice. The specific embodiment of the invention proves that the increase of the grain length can be realized by editing the gene OaGS3, so that the tetraploid wild rice with higher yield is bred, and the domestication and utilization of the tetraploid wild rice are promoted.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用。
背景技术
水稻是世界上最主要的粮食作物之一。水稻高产、稳产对于保障世界粮食安全具有重要意义。然而，城镇化进程加剧导致耕地面积锐减，极端天气频发增加了粮食稳产风险，传统育种技术带来的作物产量提升缓慢。粮食安全问题日益凸显，已逐渐成为人们面临的新挑战。
高秆四倍体野生稻O.alta为多年生异源四倍体水稻，主要分布于南美洲地区。与二倍体栽培稻相比，四倍体高秆四倍体野生稻表现出生物量大，多年生，再生能力强，胁迫适应性强等诸多优点。但未经人工驯化，籽粒小，千粒重仅为8.79克。通过基因组编辑的技术增加高秆四倍体野生稻的籽粒长度从而增加粒重，同时结合高秆四倍体野生稻诸多的优势，达到增加产量的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何使四倍体野生稻的产量增加。
为了解决以上技术问题，本发明提供了抑制OaGS3基因表达的物质在增加四倍体野生稻产量或籽粒长度中的应用，所示OaGS3基因编码OaGS3蛋白，所述OaGS3蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：
A1、氨基酸序列是序列表中序列5和序列6中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2、将序列表中序列5和序列6中任一种所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述应用中，序列表中的序列5由221个氨基酸残基组成，序列表中的序列6由211个氨基酸残基组成。
上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述应用中，所述OaGS3基因具体可为如下E1或E2所示的基因：
E1、编码链的编码序列(ORF)是序列表中序列3或序列4所示的DNA分子；
E2、核苷酸序列是序列表中序列1或序列2所示的DNA分子。
上述应用中，所述抑制OaGS3基因表达可通过对四倍体野生稻中OaGS3基因进行化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组实现的。
上述应用中，所述基因组定点编辑可采用锌指核酸酶技术(Zinc fingernuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(Transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统技术(Clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9系统)，以及其它能实现基因组定点编辑的技术实现的。
上述应用中，所述基因组定点编辑具体可借助CRISPR/Cas9系统实现。所述CRISPR/Cas9系统，其的靶序列为位于OaGS3基因中任一包括XXXNGG的核苷酸序列上的XXX序列；其中，XXX为所述的DNA分子序列中任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。
具体的靶序列可为序列表中序列1第392位-第411位所示的序列或序列2中第579位-第598位所示的序列。
上述应用中，所述物质可为CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；
2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
在本发明的具体的实施方式中，CRISPR/Cas9系统的重组载体包括重组载体VK005-OaGS3gRNA；重组载体VK005-OaGS3gRNA含有sgRNA表达盒和Cas9编码基因，能表达sgRNA和Cas9。
本发明还提供选育产量较高的四倍体野生稻(O.alta)的方法，包括如下步骤：抑制受体四倍体野生稻中所述OaGS3基因的表达，得到产量高于所述受体四倍体野生稻的目的四倍体野生稻。
本发明还提供选育籽粒长度较长的四倍体野生稻(O.alta)的方法，包括如下步骤：抑制受体四倍体野生稻中所述OaGS3基因的表达，得到籽粒长度长于所述受体四倍体野生稻的目的四倍体野生稻。
上述方法中，所述目的四倍体野生稻为满足如下条件的四倍体野生稻：CC亚基因组和DD亚基因组在sgRNA的靶点区域均发生突变。
上述方法中，所述目的四倍体野生稻理解为不仅包含第一代到第二代转基因四倍体野生稻，也包括其子代。对于转基因四倍体野生稻，可以在该物种中遗传该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种。所述转基因四倍体野生稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了增加四倍体野生稻产量或籽粒长度的试剂，所述试剂的活性成分为抑制编码所述OaGS3蛋白的基因的表达、降低所述OaGS3蛋白的丰度、和/或敲除编码所述OaGS3蛋白的基因的物质。
上述试剂中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；
2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
上述试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据四倍体野生稻增产效果或籽粒长度增加效果确定。
本发明还保护CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；
2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
本发明还提供如下Y1-Y5的任一应用：
Y1、上述的应用在四倍体野生稻驯化育种中的应用；
Y2、上述的方法在四倍体野生稻驯化育种中的应用；
Y3、上述的试剂在四倍体野生稻驯化育种中的应用；
Y4、上述的CRISPR/Cas9系统在四倍体野生稻驯化育种中的应用；
Y5、上述调控OaGS3基因的物质在水稻育种中的应用。
本发明提供了调控OaGS3基因的物质在调控四倍体野生稻产量/籽粒长度中的应用。本发明的具体实施例证明通过编辑基因OaGS3，可实现籽粒长度的增加，从而选育产量较高的四倍体野生稻，推进四倍体野生稻的驯化与利用。
附图说明
图1为本发明实施例1中O.alta中OaGS3基因靶位点图。
图2为本发明实施例1中VK005-OaGS3gRNA的构建图。
图3为本发明实施例2中部分T0扩增OaGS3-CC和OaGS3-DD的结果条带。
图4为本发明实施例2中部分基因组编辑T0材料突变测序结果图。其中，O.alta为野生型，T0-1和T0-2均为基因组编辑T0材料植株。
图5为本发明实施例2中部分基因组编辑材料和野生型籽粒长度表型照片。其中，O.alta为野生型，T0-1和T0-2均为基因组编辑材料株系。
图6为本发明实施例2中部分基因组编辑材料和野生型籽粒长度数据统计结果图。其中，O.alta为野生型，T0-1和T0-2均为基因组编辑材料株系。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为20，**代表显著性分析结果为P<0.01。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
双元载体VK005-01为北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(货号：VK005-01)中的Cas9/gRNA Vector。
下述实施例中的四倍体野生稻为四倍体野生稻Oryza alta 2007-24，即为文献1中第906页左栏1.1中的高秆四倍体野生稻种质材料(O.alta Swallen，染色体组为CCDD，编号为YD-7900)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所或国家种质南宁四倍体野生稻圃获得。文献1：梁云涛等，高秆四倍体野生稻愈伤组织诱导分化研究，西南农业学报，2014,27(3)，905-909。
下述实施例中所用转录本为T01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3’末端核苷酸。
实施例1、四倍体OaGS3靶位点的选择及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
一、靶序列的选择
四倍体高秆四倍体野生稻Oryza alta为异源四倍体，大部分基因在CC和DD亚基因组上都有拷贝。通过比对分析，Oryza alta中存在两个OaGS3的同源基因，位于CC亚基因组3号染色体上的基因命名为OaGS3-CC，另一位于DD亚基因组3号染色体上的基因命名为OaGS3-DD(核苷酸序列如序列2所示)。
OaGS3-CC由5926个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列1所示。其CDS序列如序列3所示，编码的蛋白序列如序列5所示。
OaGS3-DD由6193个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列2所示。其CDS序列如序列4所示，编码的蛋白序列如序列6所示。
如图1所示，在OaGS3-CC和OaGS3-DD第一个外显子保守区域上选择靶序列，具体序列如下:
靶序列：5’-CCGGCAGCGCCCGACCCCTG-3’(如序列1第392位-第411位所示或如序列2第579位-第598位所示)；
根据靶序列设计sgRNA记为OaGS3-sgRNA。
二、重组质粒的构建
合成下述带有接头序列(下划线部分)的单链引物:
VK005-OaGS3-F：(波浪线指示的序列为靶序列，下划线指示的序列为接头序列)；
VK005-OaGS3-R：(波浪线指示的序列与Target site 1反向互补，下划线指示的序列为接头序列)。
VK005-OaGS3-F和VK005-OaGS3-R进行引物退火，形成Oligo二聚体。将双元载体VK005-01进行BspQI单酶切，胶纯化回收约17kb左右的载体片段，在T4连接酶作用下与上述Oligo二聚体进行酶连，得到重组载体以如下测序引物进行测序：
VK005 primer:5’-GCCATGAATAGGTCTATGACC-3’。
经测序验证后的阳性质粒结构如图2所示，即在BspQI的酶切位点处正确插入sgRNA表达盒，将阳性质粒命名为VK005-OaGS3gRNA。VK005-OaGS3gRNA含有sgRNA表达盒和Cas9编码基因，能表达sgRNA和Cas9。
实施例2、转化四倍体水稻愈伤及表型鉴定
1、培育OaGS3基因敲除的四倍体野生稻O.alta植株
将实施例1得到的质粒VK005-OaGS3gRNA通过电激方法转化农杆菌EHA105，利用农杆菌侵染四倍体野生稻O.alta的愈伤组织，培育上述愈伤组织得转化苗。提取转化苗的基因组DNA，以特异引物扩增OaGS3-CC和OaGS3-DD。
用于扩增OaGS3-CC的引物对由OaGS3-CC-F和OaGS3-CC-R构成：
OaGS3-CC-F:5’-CCTCCGCCATTTATAATCCA-3’；
OaGS3-CC-R:5’-TATGCATTCGTGGTTTCAGC-3’。
用于扩增OaGS3-DD的引物对由OaGS3-DD-F和OaGS3-DD-R构成：
OaGS3-DD-F:5’-GCTGCCTTTCCATCATCATT-3’；
OaGS3-DD-R:5’-ATGTTGGGCCATGCATATTT-3’。
扩增产物电泳图见图3，选择基因组编辑材料，进行测序确定突变类型。部分结果见图4，OaGS3-CC和OaGS3-DD发生移码突变，导致蛋白序列改变，蛋白功能被破坏。含有基因编辑突变的转化苗即为T0代转基因四倍体野生稻(编号为T0-1、T0-2)。
2、OaGS3基因敲除的四倍体野生稻O.alta的表型
在中国科学院遗传与发育生物学研究所海南实验基地大田分别播种T0代T0-1株系、T0-2株系，正常农艺管理至成熟期收获籽粒，去掉顶端的芒后充分脱水，然后进行籽粒长度统计，保证至少3次生物学重复。
各株系的籽粒长度照片见图6，发现基因编辑株系T0-1株系、T0-2株系株系、籽粒长度均显著长于野生型。
因此，在四倍体野生稻Oryza alta中，可以通过编辑基因OaGS3，实现籽粒的快速驯化，使四倍体野生稻Oryza alta的籽粒变长，提升高秆四倍体野生稻增产潜力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用
<130> GNCSY210457
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5926
<212> DNA
<213> 野生稻(Oryza alta)
<400> 1
gcccactctc tcccctccat cattacttgc ccaaaaacgg caatcgatcc ccttggcctg 60
cttccatcca tccatgtgct cctcctccgc catttataat ccaccttact ccttatctcc 120
cagctccgtc ttccccgctg ctagctccaa ctgatcaaaa cagctagcta gctgctgcag 180
cgccggcccc tacctaccct accctactgc tcctactcat cgtcatcgtc ccggccccta 240
tatatagctg cacctctctc tctctctcca tatatactcc tctcgtttta gagtagcagt 300
agtagtagag ctcatcactt catctccatc ggagtgaata agtgatatgg caatggcggc 360
ggcggcggcg gcgccccggc ccaagtcgcc gccggcagcg cccgacccct gcggccgcca 420
ccgcctccag ctcgccgtcg acgcgctcca ccgcgagatc ggattcctcg aggtacaaat 480
atctatgtag tatatcagta ccattcatag ttcttgctac aaaaacaaaa caaaacaaaa 540
caaaaacatc tttcgtacaa atatctgtcg aatcatttgc ttctgcatgc atcactctca 600
ccttaagttt tccccagctt aaaaccactc cttttatctt catttttcct tttcttgaac 660
cgaactcatt tcatcttcat atactactct tagcatgcac cattttcttc tttcagtccc 720
ccaatactga tcctctcttc ccagccaaat cattaacacg aataagctta atcaaacaag 780
ttgatcaact gatgatcgaa tgaaacaaaa caaaaccgat cgaataggag tcaatgatac 840
cacctatagc tgaaaccacg aatgcatagc ttacctctac tcgatctgtt gactgttcaa 900
cactgcacta agacaccagt taataagccg attaattaaa ccattaaatg agcttaaccg 960
gcggctagct tcctcttcct ctgggcccgt gcggatcgta ccatcggttt gcgcgttcct 1020
ccacccaaac tctctgcctt gttattccct ttgtctacat gcatttgcat catcatcaca 1080
tcaccactac gtttcaattg gattttggtg gtctccaacc atatcatatt gctttttttt 1140
cttctctact acaatctcta gcggttttgt ggagtactaa agaaaacaac taactagcca 1200
gggtttgacg tctaatcaat tggtgatttt gttaatttca cctactattt tagactttac 1260
aggtcttcga gctatactac gatttatcga tgccatgcat caatcgatgc tggtccacgc 1320
tagtttctga gttatgacta gctcttttaa ttgggcttca cctacttaat taattaacca 1380
gtggctgcgt catttattga ccaacattgt catgttaccc caactgattt tttttataaa 1440
aaaactacca ccggatatat tattagttcg tgtatgtatc tgctcaagca gcgcatgcat 1500
atagtttttc gtgacacaaa atatgtactg tatgctcaaa agatctgttg ggattgtcat 1560
attcgccatt ataattaaaa tggtgatgcc cagctttttt tttctccaat aatttattgg 1620
cttaatttcc tgtgctgtta ggagtaaagc tattaattag caccattttt aaagcttcta 1680
aaatctaaat aaagtacgac actgcaacct tactgtatat gctgtgtttg ttcattagca 1740
gtggcagtac ttgctgtcta gctttaaatg ttttgggtgt taaaatatcc cccagacatc 1800
acctgaaaag ttgacaggct aaacacatgc tcatttccca cgtttactta aattaactcg 1860
aataaacaat tactccttct gtttcggaat ataaagaatt ttagataaat gtaacatatc 1920
ctactattac aaatctgaaa aaaaaacctg ttcaaattcg taatactagg atatcatatt 1980
tattcaaaat tcgttatatt ttgagatgta gggagtaata tttcttgcag ggtgaaataa 2040
attcaatcga agggatccac gctgcctcca gatgctgcag agagtaagat agccctgctg 2100
tttctttttg tacttcgatt tcttctcgtc tttagtaccc ttcccatgca ttcgcaaaat 2160
atacttacct cagtttttgg tcatggatag atgaccttcg accgttatct ttgtaagcat 2220
cttcaataaa aatagcttta aatgcagggt attaggtata tactttcaat tgcaaatgta 2280
atgtacagca tattgattct aaaaccttga caaatcaaag taaaaaaacc gaacatttga 2340
tttctggacg ttgggagttt ttttttcttt catcttttac aaatgagtac gttgtggaat 2400
catattgtgc aagcttttga gtctaattag gtatgagata ctatctacta gttgcttgag 2460
gtaaaacaaa atgtaattag gttacattta ctaaactgaa catttagtaa tgttttgtta 2520
aataacggta atttcaatgc atgcatgtcc tcccgtaaaa acagtgcaca gactgttcaa 2580
aaagtcattg cacaataact attcacatgg aactgtgaaa agtatatata ttggaacttt 2640
ctagatcctt ttgggaacat gggaaaagcc aagtcacgcg tggaatccct attccctgtg 2700
ttccttttga aaggatccag ttaagctaga actgaaaatt gtactactac tgagatgaaa 2760
ttactgcagg agcagaaagg ggggaaacct gtaaattaaa caagcctcaa aattcaacat 2820
cagcaaccga ctcatctagt gttcctgtgt tatgaaccag ccggcaacta tgcctctatg 2880
tagtgcattg aagcacctta acaatctatg gcggtcggtt ggaaacctca tataaatacc 2940
aaatttttta accggcatct cattagcaac actgatggag agaactaaag ttgtcggctt 3000
agaaaccaga caccttttag gtttcaaaaa taaaaaaaaa tactgactcg atgcatcgtc 3060
ttgaatctag ccgatgcttc gagcagcccc atcgccccga gaggacgact cccattctaa 3120
tatcatggac atggtaatac ataaatttac gaccagcaca tatgaaataa ccgaattaat 3180
tagttcagag tacttccact ttcgaatctt gtagaacttc tttcctttcg gaaacaaaag 3240
gggggaagaa ggaggtaaca acaaagggaa ccgagaacaa aataaatatg ccgatgtaca 3300
cgagcatgaa aatttaaaaa tctcacagga aaggagatca taaataaaga accaagaacc 3360
agctcactcg gtccagattc atgctcgtta gctagcttcc atgtagcaag aaggcacgca 3420
gccatcgcac atagtgtttg caatttcggc agccactaaa atttccgtgg ttgccgaaat 3480
tttgaaaaat tcatgaacgg tgttttctga ccttttttgt ttgaaatctt aacatatttt 3540
gactgaattt aaacaaattt cgaccaaatt cacaaatatt tgaaaaaaac caataatttc 3600
aggggggtgt ttgatcttgc cggtaggatc cgaaatttca aaccatgatc gcacgcttca 3660
ccgcttgtct gcatcgacgc agctactggc catgggaagc ctccccatgc aaccaagctt 3720
cactgagagg ccgcacccct accgaccgag gagaggtggc cgccgcggag aggagggccg 3780
tcgccatcgc gtcgccagtt agaggcaagc cgtcaccttg gcgtggccgc gtagaggagg 3840
gccgctgctg tcgtgtcgcg atcgtcatcg tcggcttggc ttggagaggt ggagagatgg 3900
aggaggagat aaggtgagag agatgagaga aaatattctg acggcttgtt tggcaacttg 3960
agggaagagg attgggagtt tagacgggaa aattgatggt gagatctgtc gatgggttat 4020
acctgcaaac cgtattcgga agatatcggg gtacgctggt actagggcct acacaatatc 4080
gtatcaagca ctcagagaca aatgtttata cgagttcaag ccctactcca gtttatatgg 4140
attatggatg gaacaccaca aggattacaa taggaaaaca taacaaccta tctaatttgc 4200
cgactaggat ccaccaagaa tggcccaacg agatctaatc gacgaatacg actgcggctt 4260
cctccgggtt gcttctcgct gtggttggtg gttaactccc tagggggcct tgtatttata 4320
ttgatcgctg cctttctctt caagtagaac tcaacaagac atatttggat acgagcctga 4380
ggagacctta tcttctttga ataggacttt aacaccttct gttccgagaa gataatttcc 4440
ttttatcctt gccgtatttt cttaattaaa ggtaccttcc cctatatttt taggtatatg 4500
gtattcgtat actccatgaa tctatgtatg gagatatgtt ttatccttta ccctgaaaag 4560
attaatctga gaatttgatt tttagtctca atctcttatt tgatagagat ggtgagaatt 4620
gatagagagt ttagttgaac attagatttt aaatgaaaat agaaggttga gatttgttta 4680
gacaaagtaa aggaggaatt ctctcttaat taccaccctc ttcccaggta ttagaaagaa 4740
gagagttcct cctgaatttc ctatccccat cccactacaa ctcccatatc tttcaaccaa 4800
acagaacatt taatagcctc atccctttaa acttttaatc cctttcaaaa actccctcca 4860
accaaacgga ccgcgaggag ataagagatg gatggtggag ataaggtcgc gctggtaagc 4920
ggggtccacg gtgatttttt tctccacccg tgttgctgct gcaattctat gtcggctaat 4980
aaaaaaatca gcatctatag tttctttatt tgtcccattg ttttaaaaaa ccgtacttat 5040
aataaatggt gtttttaata aaccagtacc tataaaatgt tataggtgtc ggtttttgat 5100
tttagattca tgtgaggagt cgagtaggcc agaaatagct tcatatttca tatatgcctg 5160
ttcaaggcat atatgaaggt gtccgttatt aggggttttg tagtaatgtt tgttggaatt 5220
aatcacttgt atattatgaa accgatggct ggcgaaactt tgtcaattgt gggcggtaag 5280
ctcacctaaa gcaaattgtt caaaacaagg ttaaagatga attttattaa tggattttgg 5340
tttggaaaaa ttttgtaggg ttgacgaatt catcggaaga actcccgaac cattcataac 5400
gatgtatgaa ttttcaggtc gagaatttgt ctttaacttg gcacaactgt tactttttct 5460
tattaattct ctgtttacaa gcagttcatc cgagaagcga agtcatgatc attctcacca 5520
cttttggaag aagtttcggt acttacttga ttcccggatc ttaatgtacg tatgcatctg 5580
cactgcgcta attattattt acaaaactga actatttaat aaacactaca aaatatttaa 5640
cttgcaaagt acatatttaa tcagggattt agtaaaccca ttccaatcta atgtcaccat 5700
atctgcatgc acggtccaca tggatgctgg tgtattaatt tctttttgtg ctagaatgga 5760
cgttttattt tcaattgtcg ttagtataca cctttacgca tcatctctct cctgcgcatt 5820
tgagaaaact tcttcctttg atgatagacg tggtcttatt cttcagtttg atttagtttc 5880
agatagaata aatattgttt attacttagt ttctctcctt cagtaa 5926
<210> 2
<211> 6193
<212> DNA
<213> 野生稻(Oryza alta)
<400> 2
acggctctga tccccgcggc gcagcggatc tagtccggat gggcagacga gacgagacga 60
gatgagatag atactagatc cgtccccgac aatctttcaa gccccgtggc cgtccctcct 120
ctgctcgatg tgccacgcct ctcagccttg ctgcctttcc atcatcatta ttcattcacg 180
cccaaagccc aaagcaattc acctctctct ctcgcacgaa tcgatagata cctgtaattt 240
cccccccgga aaagaaaaga gcggccattt ttctctcccc tccatcatta cttgcccaaa 300
aacggcaatc cctcctcccc catcgcctgc ttccatccat gtgcctccac cacctccgtc 360
ttccctccga ctgatcaaag cagctgctat cgctgctgca gcgccggcca tgcccgccct 420
ctagccccta cctaccctac cctaccctac tcggctactc ctactcctat atataccgtc 480
ctctctctct ctctctctct tgcgatatat ttcaagactc cagcgcgctc tccatcggag 540
tgatggcaat ggcggcggcg ccccggccca agtcgccgcc ggcagcgccc gacccctgcg 600
gccgccaccg cctccagctc gccgtcgacg cgctccaccg cgagatcgga ttcctcgagg 660
tacaacaata tccaatgtct tatcattccc tactccttct cttgcttcaa aaaaacatgt 720
cgtccatacc tcatattcat acacgtacgc tttttgctat cgctctctcc atgttttccc 780
aaccttaaaa accatcatgc atcatttgct tcttccgttc gacaaatcat ttgattagag 840
aagtttaaaa cattggaaca acaaatatgc atggcccaac attgctcctc tcgatctctt 900
ccctcagcca aattaacacg aacaaactta accaaacaag ttcaaccaac gatcggatag 960
gagtcaacca gcgctagcta gctgatgaac tagctagcaa gtccgttgac tgttcaacac 1020
taattaaggc accagttaat aagccgatta attaaacaat tatatgagct taacgggcgg 1080
ctagcttcgt cctctgggtc cgtgcggatc gtaccatcgg tttgcgcgtt cctccaccaa 1140
aactctctgc cttgttattc cctttgccta ggagcacata catttgcatg catcatcatc 1200
acatcaccag ttttaattgg attttaattt ggcggtctcc aaccatatca tattggtttt 1260
gttctctata ctagagtact ataatctcta gcggttttgt ggaactaaga aattataatt 1320
agccagggtt tgttaaccaa ttggtggttt agtttgttaa ttttagctag tactaggatt 1380
ttagacttag aggtcttcga gctactacta cgatatattg atgccatgca tcaatcgatg 1440
ctggtccatg ctagtttctg actagccctc ttaattgggc ttgacctact taattaatta 1500
accagtggct gcgtcactca ttgaccaaca ttgtcatgtt acccggactg atattttttt 1560
tataaaaaaa actaccaccg gtcgatatat tattagttag tgtatatatc tgctcaagca 1620
gcgcatgcac atggattttc gtcaaacaaa atatgtactg tatgctcaat gcatctgtgg 1680
gacgattgtc atattcgcct ttataattaa aatggtggtg cccagttgtt ttttttctcc 1740
aataatttat tgacttaaat ttcctgttct gttaggagta aaactattaa ttagcaccat 1800
tttaaaagtt tctaaaatct taataaagta tatgacactg caaccttact gtatatatat 1860
gttgtgtttg ttcattagca gtggcagtac ttgctgtcta actttaaatg ttttgggcgt 1920
taaaatatcc cccagacatc acctgaaaag ttgacaggct aaacacatgc ccatctccct 1980
cgtttactta aattaattcg aacaaacaac tatttcttgc agggtgaaat aaattcaatc 2040
gaagggatcc acgctgcctc cagatgctgc agagagtaag ttagccctgc tgtttctttt 2100
tgtacttcca tttcttctcg tctttaaact atccgcgacg ctacttactc taaattccta 2160
ctctaaagga atattccatg cctggtcagt gagattcctt actctatatc aaatcttccg 2220
cgctcgtgtt tactctatat cttcctctat aattttttaa ctatattttg aaaagtctat 2280
tttacctcct ccatcccccc aataaaaccc cgcactccta ctgcatcagc ggctcccccc 2340
cccgtcggtt gctccgccac cgccgatccc cctcccccgt gcccgaatcc ccccgccgca 2400
gccgtcgccg aatcccccct cccccagccg catcgcccct ccgccagccg catcggctcc 2460
tcccccgccg cccccgtcgc ccggcgtccc tctccctgcc gcggcttcgt cccgcatcag 2520
ctcctccccc ccgcctgtcg gccttcaccg cgccaacccg catcggctcg gaggcgcgga 2580
ggcggaggag ccgatggggc ggcgcgccgg ggcatcggcg gaggaagggc gtcgtggcgg 2640
atccgccgag ggagagcgct ctccgccgcg ccctccgccg agctctccgc ctcgctcgcc 2700
ctctccgcct cgcttgccct tccgctgtcg ctcgccgctg ctcctgcttc gttcccctcc 2760
tccccttctt ccgtccgtgc gcgggaggga cggacagttg gccgtcgccc gcgcgcgcgg 2820
cctatacagg ctgctacagt gctccgctac ggatagcgga gcactgtagc ccctggacga 2880
tacaggcgcc tttagcggat ggcgctgcag ccgcgccgtc cgctaccgcg gatagatcgc 2940
ggacggcgct gcggatagtc ttagtactct taccatgcat tcacaaaata tacttacctc 3000
ggttgatcat ggatagataa actttgaccg ttatcttttt aagcaacttc aataaaaata 3060
ggtttaaatg cagggtatta ggtatatatt ttcaattgca aatgtaacat acagcattga 3120
ttctaaaaca ttggcaaatc aaagtaaaaa actgaacatt tgatttaatt ctgaacgttg 3180
ggagtatttt ttttcatcat ttacaaatga gtacgttgtg gaattatatt gtgcaagctt 3240
ttgagactaa ttaggttata tgagatacta tctaccaagg ttgtcagtgt cttatgatac 3300
caggatccta ttaaagcgaa acgatattaa tcccatctag tatctaatta tcatagtatc 3360
tcatcttact atttatttcc atatgatcct acgaaatctt aggtagtatc ccgattctac 3420
gatccctctg atcctataaa atattattta aaataaggtg gattgaaaat aatatgaata 3480
aatatactca agtttacata aaaccaatta aatttatcaa aatcaatatt atatgcttta 3540
atttgtacaa catattatat attttatata aaaatgtata ctttctaaaa tctgttagta 3600
ttccgatcct atgatactac caataaaaaa cgattctacc tggtatctcc atatgctatc 3660
tattagttgc ttgaggtaaa acaaaatgta gttaggttac atttactaaa ctgaacattt 3720
agtaatgttt tgttaaataa cggtaatttc aatgcatgca tgtcctcccg taaaaacagt 3780
gcagagactg ttcaaaaagt cattgcacaa taactattca catggaactg tgaaaagtat 3840
atattggaac ttactagatc cttttgggaa catgggaaaa gccaaagtca cgtgtggaat 3900
ccctattccc tgtgttcttt ttgaaaggat ccagttatgg cccgtttagt tcgcgaaatt 3960
tttttcaaaa acatcacatc aaacgtttga ccgaatgtcg ggaggggttt tcggacacga 4020
atgaaaaaac taatttcacg gttagcctgt aaaccacgag acgaattttt ttgagcctaa 4080
ttaagccgtc aacatgtagg ttactgtagc acttacggct aattatggcg taattatgac 4140
aaaattaggc tcaaaagatt cgtctcgtcg tttacaatcc aactgtgcaa ttagtttctt 4200
tttttatcta tatttaatgc ttcatgcatg agtccaaaag tttgatgtga tgtttttggg 4260
gttttcgttt tgggaactaa acaaggcctt agctagaaga gtggaaattg tactactact 4320
gagatgaaat tacagcagga gcagaaaggg ggacaaactg aaaattaaac aagcctcaaa 4380
attcaacatc agcaaccgac tcatctagtg ttcctgtgtt atgaaccagc cggcaactat 4440
gcctctatgt agcgcattga agcaccttaa ctaagggcta tcaaggctgt gttaaactgt 4500
taatggtaca tatgcctttc agtttctgtc tgtactttag gttgctatac atcctatgaa 4560
catgttttct tgtctttctt cttacctcgg ttgaaaaacc catacaaata tcatttttta 4620
actgactact cactaaataa aaagaatcaa atgtgccgat ttaagaactg atgcctttaa 4680
aattttaata ataagaagaa aaataccagt tcgatgcatc gtctcgaatc gaccgaatcg 4740
aaccgatgct tcaaccggcc cccatccctc gagaggacga ctcccattct agaaacatgg 4800
acatggtaac acagaaattt tcgaccagca catatgaaat aaccgaatca attagttcag 4860
aatccttcca ctttcgaatc ttgtagaact tctatccttt cggaaacaag agggggaagg 4920
aggaggcaac aacaaagtat gggaactgag aacaaaataa atatgccgat gtacacaagc 4980
atgaaaagtt aaagatctca aaggaaagga gatcataaat caagaaccaa gaaccagctc 5040
actcggtcca gttcatgctc gttagctagc ttccatgtag caagaaggca cgcagccatc 5100
gcacatagtg tttgtaattt cggtagccac cgaaatttcg gtggttaccg aaattttgaa 5160
aaaaatcatg aatttcggtg ttttctgact gatttttttt tcaattttaa ctgagtttga 5220
acaaatttgg atcaaattca caaatatttg aaaaaatcca aaaaatttgg ggagatttga 5280
tcgtgccgat agggtccgaa atttcaaacc atgatcgcac acttcaccgc ttgtctgcat 5340
cgacgctggc cgtgggaagc ttccccgtgc aaccaagctt caccgagcgg ccgcacccct 5400
gccgatcgaa ggagaggtgg ccgccgtgga gaggagggcc gctgccgtcg cgtcgccggg 5460
tagaggcaag ccttcacctt ggcgtggccg cagacaggag ggccgctgct gtcgcgtaac 5520
ggccgtcgtc gccggcttgg cttggagagg tggagagaga tggaggagga gatgaggtta 5580
gagagagaga ggagaaagag gtaagaaaat atccagagga gataagagat gcatggtgga 5640
gataacgtcg cgctgggcaa gcgtggtcca cactgatttt ttccccgccc gtgtcgctgc 5700
tgcaattctg tgctggctaa taaaaaaaat cagataccta taaaatgtta tagatgtcgg 5760
tttttaattt taaactcatg tgagtagtcg ggtggataaa aaatggtctc gtctgccagt 5820
tgaatatgca tatataaaga cgtccactat tagggtttta tagtagttag ttagaattaa 5880
ttagttgcat attaaccaga aggctggcga aactttgtca attgtgggcg ctaatctcac 5940
ctgaagcaaa ttgttcaaaa caaggttaaa gatgattttt attaatgaat tttggcttgg 6000
aaaaattttg tagggttgac gaattcatcg gaagaactcc cgatccattc ataacgatgt 6060
atggattttc aggtcgagaa tttgtctttt aacttggcac aaccgtactt tttcttatta 6120
attctctgtt tacaagcagt tcatcggaga agcgaagtca tgatcattct caccacttat 6180
tgaagaagtt tcg 6193
<210> 3
<211> 666
<212> DNA
<213> 野生稻(Oryza alta)
<400> 3
atggcaatgg cggcggcggc ggcggcgccc cggcccaagt cgccgccggc agcgcccgac 60
ccctgcggcc gccaccgcct ccagctcgcc gtcgacgcgc tccaccgcga gatcggattc 120
ctcgagggtg aaataaattc aatcgaaggg atccacgctg cctccagatg ctgcagagag 180
gttgacgaat tcatcggaag aactcccgaa ccattcataa cgatttcatc cgagaagcga 240
agtcatgatc attctcacca cttttggaag aagtttcggt acttacttga ttcccggatc 300
ttaatgtacg tatgcatctg cactgcgcta attattattt acaaaactga actatttaat 360
aaacactaca aaatatttaa cttgcaaagt acatatttaa tcagggattt agtaaaccca 420
ttccaatcta atgtcaccat atctgcatgc acggtccaca tggatgctgg tgtattaatt 480
tctttttgtg ctagaatgga cgttttattt tcaattgtcg ttagtataca cctttacgca 540
tcatctctct cctgcgcatt tgagaaaact tcttcctttg atgatagacg tggtcttatt 600
cttcagtttg atttagtttc agatagaata aatattgttt attacttagt ttctctcctt 660
cagtaa 666
<210> 4
<211> 651
<212> DNA
<213> 野生稻(Oryza alta)
<400> 4
atggcggcgg cgccccggcc caagtcgccg ccggcagcgc ccgacccctg cggccgccac 60
cgcctccagc tcgccgtcga cgcgctccac cgcgagatcg gattcctcga gggtgaaata 120
aattcaatcg aagggatcca cgctgcctcc agatgctgca gagaggttga cgaattcatc 180
ggaagaactc ccgatccatt cataacgatt tcatcggaga agcgaagtca tgatcattct 240
caccacttat tgaagaagtt tcggtactta cttgattccc ggatcttaat gtacatatgc 300
atctgcactg tgctaattgg tgtgcattat atggtcgtaa gtcctagtta cttattattt 360
acaaaactga actaataaac actacaaaat atttaacttg caaagtatcc aatctaatgt 420
cactatatct gcatgcatgg tccacatgga cgctggtgta ttattttttt tgtgctagta 480
tggacgtttt attttcaatt gtcgcttagt atacaccgtt acgcatcata tctctcctgc 540
gcatttgaga aaacttcttc ctttgatgat agacgtgggc ttattcttca gtttgattta 600
gtttcagata gaataaatat tgtttaatac ttagtttctc tccttcagta a 651
<210> 5
<211> 221
<212> PRT
<213> 野生稻(Oryza alta)
<400> 5
Met Ala Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp
20 25 30
Ala Leu His Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile
35 40 45
Glu Gly Ile His Ala Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe
50 55 60
Ile Gly Arg Thr Pro Glu Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg
65 70 75 80
Ser His Asp His Ser His His Phe Trp Lys Lys Phe Arg Tyr Leu Leu
85 90 95
Asp Ser Arg Ile Leu Met Tyr Val Cys Ile Cys Thr Ala Leu Ile Ile
100 105 110
Ile Tyr Lys Thr Glu Leu Phe Asn Lys His Tyr Lys Ile Phe Asn Leu
115 120 125
Gln Ser Thr Tyr Leu Ile Arg Asp Leu Val Asn Pro Phe Gln Ser Asn
130 135 140
Val Thr Ile Ser Ala Cys Thr Val His Met Asp Ala Gly Val Leu Ile
145 150 155 160
Ser Phe Cys Ala Arg Met Asp Val Leu Phe Ser Ile Val Val Ser Ile
165 170 175
His Leu Tyr Ala Ser Ser Leu Ser Cys Ala Phe Glu Lys Thr Ser Ser
180 185 190
Phe Asp Asp Arg Arg Gly Leu Ile Leu Gln Phe Asp Leu Val Ser Asp
195 200 205
Arg Ile Asn Ile Val Tyr Tyr Leu Val Ser Leu Leu Gln
210 215 220
<210> 6
<211> 211
<212> PRT
<213> 野生稻(Oryza alta)
<400> 6
Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Ala Pro Asp Pro
1 5 10 15
Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His Arg Glu
20 25 30
Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile His Ala
35 40 45
Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe Ile Gly Arg Thr Pro
50 55 60
Asp Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg Ser His Asp His Ser
65 70 75 80
His His Leu Leu Lys Lys Phe Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Arg Ile Leu
85 90 95
Met Tyr Ile Cys Ile Cys Thr Val Leu Ile Gly Val His Tyr Met Val
100 105 110
Val Ser Pro Ser Tyr Leu Leu Phe Thr Lys Leu Asn Thr Leu Gln Asn
115 120 125
Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Ile Cys His Tyr Ile Cys Met His Gly Pro
130 135 140
His Gly Arg Trp Cys Ile Ile Phe Phe Val Leu Val Trp Thr Phe Tyr
145 150 155 160
Phe Gln Leu Ser Leu Ser Ile His Arg Tyr Ala Ser Tyr Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Phe Glu Lys Thr Ser Ser Phe Asp Asp Arg Arg Gly Leu Ile Leu
180 185 190
Gln Phe Asp Leu Val Ser Asp Arg Ile Asn Ile Val Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Leu Leu Gln
210