水稻叶色控制基因sel、其突变基因及其在水稻叶色改良中的应用

文档序号：729371 发布日期：2021-04-20 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 水稻叶色控制基因sel、其突变基因及其在水稻叶色改良中的应用 (Rice leaf color control gene SEL, mutant gene thereof and application thereof in rice leaf color improvement ) 是由叶靖张小明叶胜海翟荣荣朱国富巫明明于 2021-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种水稻叶色控制基因SEL、其突变基因及其在水稻叶色改良中的应用。水稻叶色控制基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示,其编码基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示,全长1092bp。该基因发生纯合突变后可导致叶绿素合成受阻,叶绿体发育不正常,苗期黄化致死,在苗期可以作为一种标记性状,对目标性状进行选择。本发明还公开了一种对水稻叶色改良具有重要价值的黄化致死突变体sel,其杂合型植株SEL/sel,在生育前期表现出正常叶色表型,抽穗后叶色开始变淡,后期叶片枯萎慢。可将其应用于水稻叶色改良工作中,特别是针对叶色较深杂交稻,能够使其叶色变淡,并延迟叶片衰老,对进一步提高水稻产量具有重要的意义。(The invention discloses a rice leaf color control gene SEL, a mutant gene thereof and application thereof in rice leaf color improvement. The amino acid sequence of the rice leaf color control gene code is shown as SEQ ID NO: 2, the cDNA sequence of the coding gene is shown as SEQ ID NO.1, and the total length is 1092 bp. The homozygous mutation of the gene can cause chlorophyll synthesis obstruction, chloroplast abnormal development and yellowing death in the seedling stage, and the gene can be used as a marker character to select target characters in the seedling stage. The invention also discloses a yellowing lethal mutant SEL with important value for improving the leaf color of rice, wherein a heterozygous plant SEL/SEL shows a normal leaf color phenotype in the early growth stage, the leaf color becomes light after heading, and the leaf withering is slow in the later stage. The method can be applied to the rice leaf color improvement work, particularly for hybrid rice with darker leaf color, can lighten the leaf color and delay the leaf senescence, and has important significance for further improving the rice yield.)

水稻叶色控制基因SEL、其突变基因及其在水稻叶色改良中的应用

技术领域

本发明属于水稻遗传育种的领域，具体涉及水稻叶色控制基因、及其突变基因在水稻叶色改良中的应用。

技术背景

水稻是我国最重要的粮食作物之一，然而很多水稻品种存在叶色较深，生育后期叶片早衰的现象，特别是籼稻品种，生育期较短，叶片衰老快，籽粒灌浆时间短，严重影响其产量的进一步提升。下一步如何继续提高水稻单产满足日益增长的粮食需求成为研究的最主要方向之一，培育高光效、持绿性强的“理想株型”是其中重要的途径。

利用传统育种手段改良杂交稻叶色较深，费时、费力且效率低，而叶色突变体是研究水稻叶绿素代谢和叶绿体发育的理想材料，对其进行研究有助于理解叶绿素代谢和叶绿体发育的机制，提高水稻光合效率和光合时间，对改良水稻叶色具有重要价值。在己经报道的水稻叶色突变体中，只有少数会致死，且致死突变体中绝大多数是白化致死，关于黄化致死的报道极少。

发明内容

本发明提供了水稻叶色控制基因及其突变基因，还提供了上述基因的用途。

本发明提供了分离的水稻叶色控制基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述的水稻叶色控制基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了分离的水稻叶色突变基因，其在SEQ ID NO.1所示序列中取代、插入或缺失一个或多个核苷酸，导致其不编码SEQ ID：2所示的氨基酸序列。

其中，所述的水稻叶色突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了包含所述水稻叶色控制基因或水稻叶色突变基因的载体。

本发明提供了包含所述水稻叶色控制基因或水稻叶色突变基因的细胞。

本发明提供了所述的水稻叶色突变基因在水稻叶色改良中的应用。

其中所述应用包括：将所述的水稻叶色突变基因转入所需改良的水稻品种中。

本发明鉴定了控制水稻叶色的新基因SEL，研究发现其突变体sel有2个碱基发生缺失，导致移码突变。

由于水稻突变体sel为苗期致死，只能在苗期作为一种标记性状，对目标性状进行选择，如在杂交制种过程中，突变体黄化致死，可以简单自行除杂，提高杂种的纯度。此外，带有该突变基因的杂合型植株SEL/sel，在生育前期表现出正常叶色表型，抽穗后叶色开始变淡，后期叶片持绿时间长。由于无融合生殖的方式可以将F₁的杂种优势固定，故可将该杂合型基因应用于改良叶色较深杂交稻中，并延迟叶片衰老，灌浆后期仍能维持较好的光合机能，在光合时间上具有明显优势，有利于水稻产量的进一步提高。

附图说明

图1为野生型水稻及黄化致死突变体sel的表型以及光合色素比较；其中A-D依次分别为：A.野生型和sel发芽9d植株表型；B.发芽9d叶绿素含量测定；C.发芽12d植株表型；D.发芽15d植株表型；bar＝1cm；

图2为抽穗20天野生型及杂合型植株SEL/sel的性状比较；

图3为基因定位示意图；

图4为功能互补试验T0代转基因苗(左sel/1390：突变体sel转化空载pCUbi1390；右sel/1390：SEL：突变体sel转化互补载体pCUbi1390:SEL)；

图5为苗期野生型和突变体sel的叶绿体超微结构的透射电镜图。

具体实施方式

实施例1：sel突变体的分离和遗传分析

水稻黄化致死突变体sel，由粳型水稻品种日本晴自然变异获得。和野生型相比，突变体sel从芽期到四叶期，所有叶片都表现为黄色，且叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)和类胡萝卜素(car)含量都显著下降(图1中A-B)。四叶期后突变体sel第四片叶先衰老，继而第三片叶枯萎，最后整个植株死亡(图1中C-D)。这些结果表明突变体sel叶绿素合成受阻，无法正常生长。纯合的突变体sel黄化致死，然而，带有该突变基因的杂合型植株SEL/sel在抽穗后叶色较淡，抽穗20天后野生型叶尖开始变枯，而杂合型植株SEL/sel叶片仍能维持正常表型，并未衰老(图2)

由于纯合的突变体sel黄化致死，因此利用突变体杂合株系自交获得种子，单株收获分别播种，获得了5个表型分离的群体。对这5个分离群体中发现1726株绿苗和527株黄化致死苗，符合3:1的分离比(χ²＝3.11<χ² _0.05＝3.84)表明该突变性状是由单个隐性核基因控制的。

实施例2：SEL基因的精细定位和互补验证

为了克隆SEL基因，我们将突变体杂合(SEL/sel)株系与籼稻品种9311杂交，F₁单株收获并播种，选择能够分离出黄叶表型的F₂群体用于基因定位。经过混池筛选和单株验证，SEL基因被初定位于第1染色体上的RM5794和RM12272之间。根据日本晴和籼稻品种9311序列的差异，在RM5794和RM12272区间内开发了新的标记，引物序列见表1，用于交换单株的筛选，通过染色体步移的方法，将SEL定位于标记B3和B5之间，物理距离约43.3kb(图3)。

表1 SEL的精细定位引物信息

该区间有6个开放阅读框(ORF)，测序结果显示突变体sel在ORF4内有两个碱基的缺失，导致移码突变。为了进一步证实候选基因，我们通过将野生型ORF4的启动子连接cDNA后连接到载体pCUbi1390，构建得到互补载体pCUbi1390:SEL，再转化到突变体sel中来进行遗传互补实验，以突变体sel转化空载体pCUbi1390作为对照。所有阳性转基因株系都能恢复正常叶色表型(图4)。这些结果证实ORF4就是控制sel表型的基因。SEL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，突变体sel在该基因的第136-137位碱基“ca”缺失导致移码突变。

实施例3：叶绿体透射电镜的观察

通过对苗期野生型和突变体sel的叶绿体超微结构进行透射电镜观察发现：野生型叶绿体内部存在排列整齐、结构清晰晰的类囊体片层结构，而突变体sel的叶绿体排列紊乱、数量较少、层次不清(图5)。光合作用的产物以淀粉的形式进行贮藏，贮藏的淀粉常以颗粒状态存在，称淀粉粒。野生型体内的叶绿体内的淀粉粒数目较多且体积较大，而突变体内有很多空小泡且无明显的淀粉粒。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 水稻叶色控制基因SEL、其突变基因及其在水稻叶色改良中的应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1092

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcggcac actcccacgt catccccttc ctctccccgg cggcgacgtc cgcgcgctgc 60

tccccctacg gccaccgccg ccgcggccgc gcggggctcc tgcggtgcgc ggcggcggcg 120

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atttttcctt ga 1092

<210> 2

<211> 363

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

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35 40 45

Leu Gly Arg Leu Ile Gln Glu Lys Ala Lys Ser Asp Val Glu Lys Leu

50 55 60

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Leu Leu Thr Tyr Trp Asn Leu Ala Asp Thr Asp Arg Val Leu Asp Glu

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Leu Thr Ser Lys Gly Gly Asn Pro Glu Leu Gln Leu Gly Phe Arg Lys

145 150 155 160

Pro Ala Val Ile Met Ile Val Gly Val Asn Gly Gly Gly Lys Thr Thr

165 170 175

Ser Leu Gly Lys Leu Ala Tyr Arg Phe Lys Asn Glu Gly Val Lys Val

180 185 190

Leu Met Ala Ala Gly Asp Thr Phe Arg Ala Ala Ala Arg Asp Gln Leu

195 200 205

Glu Val Trp Ala Glu Arg Thr Gly Ser Glu Ile Val Ile Asp Asn Asp

210 215 220

Lys Lys Ala Lys Pro Ala Ser Val Leu Ser Gln Ala Val Lys Arg Gly

225 230 235 240

Lys Arg Glu Gly Phe Asp Leu Val Leu Cys Asp Thr Ser Gly Arg Leu

245 250 255

His Thr Asn Tyr Gly Leu Met Glu Glu Leu Val Ser Cys Lys Lys Val

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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<210> 3

<211> 1090

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atggcggcac actcccacgt catccccttc ctctccccgg cggcgacgtc cgcgcgctgc 60

tccccctacg gccaccgccg ccgcggccgc gcggggctcc tgcggtgcgc ggcggcggcg 120

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cgagaagctc ttctccggct tctccaagac ccgcgagagc ctctccgtcg tcgacgagct 240

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gcgtgaagga tttgatcttg ttctttgcga cacgtcagga cgacttcata caaattatgg 780

tctgatggaa gaattggttt cctgcaagaa agtcatagct aaagcccttc cgggtgctcc 840

taatgagatc ttgctggttc tggatggcac gactggcttg aatatgctac aacaagcgag 900

ggagttcaat gatgttgttg gagtcacagg attcgtccta acaaagcttg atggaactgc 960

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<210> 4

<211> 23

<212> DNA