具体实施方式

本发明的发明内容(包括所有第一到另外的方面)在下文中仅通过引用的方式重复以避免重复。现在将描述本发明的具体但非限制性的实施方案。

通常，根据本发明的第一方面，提供供用于治疗人体或动物体的乳腺癌的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)。优选地，乳腺癌是三阴性乳腺癌。申请人出人意料地发现HPβCD可治疗、改善和/或预防实体瘤癌症，特别是乳腺癌，更特别是三阴性乳腺癌。这是特别令人惊讶和出乎意料的，因为环糊精通常只是药物组合物中的赋形剂，并且通常是无活性和/或惰性的。这种令人惊讶和出乎意料的效果另外有利，因为环糊精，及特别是HPβCD对于人和动物使用是安全的。此外，开发用于治疗三阴性乳腺癌的包含HPβCD的药物的费用问题将相对较低。不受理论的限制，申请人相信HPβCD从乳腺癌细胞中提取附加胆固醇，从而剥夺所述乳腺癌细胞用于细胞分裂和增殖的基本燃料，从而导致细胞死亡，如本文实验数据所支持的。

开发剂量方案的另外实验性协议也将及时进行。通常，给药于有此需要的人或动物的HPβCD的量有关于，但不限于，体重、肿瘤大小、肿瘤重量和/或癌症是否已经转移。

通常，当用于治疗乳腺癌时，2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)被配制为药物组合物。

药物组合物可经由肠胃外和/或非肠胃外途径给药。

肠胃外给药可包括但不限于经静脉内、皮下、肌肉内或植入人体或动物体内。

非肠胃外给药可包括但不限于将药物组合物经口服、直肠、阴道、舌下、口腔和鼻内递送到人体或动物体内。

药物组合物可包括赋形剂。应当理解，组合物中还可包括其他成分，诸如填充剂、掩味剂、着色剂、维生素、矿物质、其他活性药物成分(API)等。

药物组合物可另外包括来自环糊精家族的环糊精。

本发明扩展到如本文所描述的本发明的第二、第三、第四和第五方面。

实施例

下文中的实施例并不旨在以任何方式限制本发明的范围，并且仅提供实施例和/或说明本发明的某些实施方案。

在构成体外研究的四种不同细胞系中试验HPβCD的细胞毒性活性。这四种细胞系是：雌激素阳性(ER+)MCF7乳腺癌细胞、三阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞、MRC-5(正常人肺成纤维细胞)和HEK-293(正常人胚胎肾细胞)。在体外进行基于细胞毒性、细胞凋亡和胆固醇的测定。结果如下所示。还呈现体内研究(小鼠模型)，并且设想对ER+和三重阴性乳腺癌细胞的另外研究。基于初步研究(体外和体内)，将阐明综合作用机制。

细胞在补充有10％FCS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)(Gibco)的适当培养基中在37℃培养箱中在5％CO₂下培养。

体外研究：

生长抑制测定-MTT测定

使用四种不同的细胞系MCF7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)、MRC-5(肺成纤维细胞)和HEK-293(胚胎肾)。根据可用性，MRC-5和/或HEK-293用作对照细胞系。

为了确定HPβCD是否具有诱导癌细胞死亡的能力，进行使用MTT测定的初步筛选。选择处理24小时、48小时和72小时的三个不同时间点，以便建立HPβCD的效力。结果示出在图1至图4中。

表1：示出MCF7、MDA-MB-231、MRC-5和HEK-293细胞的IC₅₀值。

所获得的结果示出，在10mM浓度的HPβCD下，约45％的生长抑制。随后，随着HPβCD浓度的增加，生长抑制百分比不断增加。结果适用于所有三个时间点，因此指示其破坏线粒体过程的潜在能力(不受理论的限制)及其可能的缓慢作用(图1)。40μM白花丹素(PL)用作阳性对照，且分别在24小时、48小时和72小时示出几乎80％、90％和100％的生长抑制。白花丹素是众所周知的化合物，已被证明可抑制癌细胞的生长。

与MCF7一样，针对MDA-MB-231细胞，选择三个不同时间点24小时、48小时和72小时。所获得的结果示出，在10mM浓度的HPβCD下生长抑制约为45％，并且随着HPβCD浓度的增加，生长抑制百分比逐渐增加。所有三个时间点的结果均类似，因此指示HPβCD对不同乳腺癌细胞相当有效(图2)。40μM白花丹素(PL)用作阳性对照，且示出分别在24小时、48小时和72小时的几乎85％、92％和95％的生长抑制。

对于对照细胞系MRC-5和HEK-293，选择类似的时间点(24小时、48小时、72小时)以维持一致性。所获得的结果示出，在10mM浓度的HPβCD之前，生长抑制绝对为零。结果适用于两个时间点(24小时和48小时)。有趣的是，在72小时(图3和图4中的黑框)，即使是20mM也对细胞无毒，因而指示HPβCD实际上是在帮助细胞存活，且所有不健康的细胞均在重新编程并表现正常。50mM被认为对细胞毒性很大(图3和图4)，因为剂量太高。每个细胞均有特定药物浓度的阈值，超过该阈值就会变得有毒且每种药物均遵循剂量反应方法。在计算引起50％生长抑制所需浓度的IC₅₀值后，可看出，在24小时(表1)，在两种细胞系中引起50％生长抑制所需的浓度是几乎两倍的HPβCD浓度，而在72小时，与癌细胞相比，浓度上升至几乎五倍，因此指示HPβCD对癌细胞具有特异性毒性。

Cell-APOPercentage细胞凋亡测定

APOPercentage测定给出细胞中总细胞凋亡的量度。细胞凋亡是早期事件，且因此仅选择一个时间点(24小时)并对四种细胞系MCF7、MDA-MB-231、MRC-5和HEK-293细胞进行试验。10μM白花丹素用作阳性对照，而不是来自MTT的40μM，因为更高浓度的白花丹素对细胞毒性太大，且为了捕获早期活性，需要最佳剂量。

为了确认从MTT测定所获得的生长抑制实际上是由于细胞凋亡，根据已知方法进行Cell-APOPercentage细胞凋亡测定。

MCF7的结果在10mM的HPβCD浓度下为我们带来大约45％的细胞死亡。在所有处理中随着HPβCD浓度的增加，细胞死亡百分比不断增加(图5)。10μM白花丹素用作阳性对照且产生几乎90％的细胞凋亡。用APOPercentage染料染色后在光学显微镜下拍摄的照片(图6)验证我们的图形数据，其中可清楚地看到，随着HPβCD浓度的增加，染料的粉红色强度(在图的颜色版本中)不断增加，因此指示细胞凋亡增加。在黑白图像中，相对于背景的限定的深灰色斑点数量随着HPβCD浓度的增加而增加，指示细胞凋亡增加。

对于MDA-MB-231细胞，在10mM浓度的HPβCD下，所获得的结果为我们带来大约40％的细胞死亡(低于MCF7)(图7)。与MCF7一样，细胞死亡百分比在所有更高浓度的HPβCD下持续增加且在50mM HPβCD下达到的最大细胞死亡约为70％。10μM白花丹素用作阳性对照且观察到的细胞凋亡百分比几乎为90％。用APO Percentage染料染色后在光学显微镜下拍摄的图像验证我们的图形数据(图8)，其中与MCF7一样，我们可清楚地看到，随着HPβCD浓度的增加，染料的粉红色强度(在图的颜色版本中)不断增加，从而指示细胞凋亡的逐渐进展。在黑白图像中，相对于背景的限定的深灰色斑点数量随着HPβCD浓度的增加而增加，指示细胞凋亡的进展。

最后，对于正常细胞(MRC-5和HEK-293)，在HPβCD浓度为10mM之前，所获得的结果几乎接近零百分比细胞死亡(图9)。对于这两种细胞系，20mM和50mM分别为我们带来约15％和约18％的细胞死亡。用APO Percentage染料染色后在光学显微镜下拍摄的照片验证我们的图形数据(图10)，且很明显，在HPβCD浓度为10mM之前，细胞没有吸收染料。在更高的浓度下，我们确实看到很少的粉红色强度(在图的颜色版本中)，这由我们的图形数据证实，其因此确认HPβCD在毒理学上对正常细胞确实是良性的这一事实。在黑白图像中，相对于背景限定的斑点的数量没有增加太多。对于HEK-293细胞系对HPβCD的反应，参见图11和12，示出与MRC-5类似的情况。

线粒体外膜电位测定(MOMP)

细胞凋亡的关键标志之一是线粒体膜电位的丧失。为了研究这一方面，我们进行MOMP测定，其验证我们的Cell-APOPercentage测定。该测定对三种细胞系MCF7、MDA-MB-231和MRC-5进行。每个图的右上和下象限分别代表健康(FL2-A)和凋亡(FL1-A)细胞(参见图13至15)。

根据从MTT(IC₅₀值)和Cell-APOPercentage测定所获得的结果，很明显～10mM HPβCD通过癌细胞的细胞凋亡引起细胞生长抑制，而对正常细胞几乎没有影响。因此，我们仅选择10mM HPβCD作为HPβCD处理的唯一工作浓度。选择24小时时间点(HPβCD和10mM H₂O₂)，因为线粒体膜电位丧失是早期细胞事件。

针对MCF7所获得的结果(图13)示出在10mM浓度的HPβCD(经处理)下92.1％的凋亡群体，而未处理细胞中的健康群体为90.0％。阳性样品(10mM H₂O₂)中凋亡细胞的百分比为92.1％。与PL一样，H₂O₂是众所周知的导致细胞凋亡的试剂。

MDA-MB-231细胞在10mM浓度的HPβCD下产生78.1％的细胞死亡(图14)，而未处理的健康群体的细胞死亡率仍然相当高，为94.2％。正如预期的那样，阳性样品(10mM H₂O₂)产生非常高的92.4％凋亡细胞。

对于正常细胞(MRC-5)，所获得的结果在10mM HPβCD浓度下为我们带来98.2％的非凋亡/健康群体和12.8％的凋亡细胞(图15)。因此，确认HPβCD确实对正常细胞无毒，而对癌细胞则经由内在细胞凋亡途径而显著凋亡并导致线粒体膜电位的丧失。这是最令人惊讶和出乎意料的结果。

ROS测定(活性氧自由基)

为了另外验证细胞凋亡的发生并研究细胞凋亡的确切机制，进行ROS测定以捕获ROS的产生。这是因为ROS的生成也已被证明是细胞凋亡的特征。为了支持这一事实，在三种细胞系中进行ROS测定：MCF7、MDA-MB-231和MRC-5。与以前一样，HPβCD和阳性(10mM H₂O₂)被处理24小时。每个图中的右侧区段代表ROS的产生。

癌细胞通常具有增强的新陈代谢，因为它们与正常细胞相比分裂迅速，从而导致大量生成ROS。

从图16C可看出，10mM HPβCD处理的MCF7细胞中ROS产生的百分比为17.9％，而未处理的情况下为7.6％(图16A)。虽然与未处理样品相比，这大约高出2.5倍，但并不太显著，特别是如果我们查看在具有非常高的88.5％ROS生成的阳性样品中的ROS产生(图16B)以及在10mM HPβCD处理下示出10.8％的ROS活性的正常细胞(MRC-5)中的ROS生成的水平(图18C)。

MDA-MB-231细胞产生与MCF7类似的结果，且10mM HPβCD处理的ROS产生百分比为13.7％(图17C)，而未处理的情况下为3.7％。同样，与未处理细胞相比，这大约高出4倍，但这种情况在我们查看示出73％ROS产生的阳性样品(图17B)和在10mM HPβCD处理下看到10.8％ROS产生的正常细胞(图18C)中时并不太惊人。

MRC-5细胞在未处理细胞中通常示出2.8％的ROS活性(图18A)，并且与MCF和MDA-MB-231细胞一样，在10mM HPβCD处理(10.8％)下，ROS产生上升至几乎4倍。因此，推断虽然HPβCD确实会导致细胞凋亡，但并不是经由大量产生ROS而引起的。往往观察到细胞凋亡中ROS的下调，并且考虑到ROS在生理过程中具有重要作用，这种情况可能发生。很有可能是负责维持自由基的过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶等解毒酶过度表达。然而，需要另外的研究来阐明确切的机制。

半胱天冬酶3/7测定

内在途径后的细胞凋亡的最后步骤是活化执行者半胱天冬酶(executionercaspase)，如半胱天冬酶3和半胱天冬酶7，这引起细胞色素c的释放。因此，为了确认细胞死亡是由于线粒体介导的细胞凋亡途径，进行半胱天冬酶3/7测定。

半胱天冬酶在响应于无数细胞死亡刺激时被活化并分解细胞。半胱天冬酶3和半胱天冬酶7参与细胞凋亡中发生的大部分蛋白水解切割。作为经由线粒体内在途径确认和验证细胞凋亡的最后步骤，对以下三种细胞系进行半胱天冬酶3/7测定：MCF7、MDA-MB-231和HEK-293。HPβCD和阳性(40μM PL)处理24小时。在上图中每个象限的特定角落中清楚地指示死亡/凋亡细胞的百分比。

对于MCF7细胞，未处理细胞中观察到的总凋亡为6.4％(图19A)，而在经处理细胞(10mM HPβCD)中，凋亡上升至12.5％(图19C)，这与未处理样品相比几乎增加两倍。对于阳性样品(40μM PL)，总凋亡群体为23.55％(图19B)。总体低半胱天冬酶3/7活性是因为MCF7细胞一般不表达半胱天冬酶3活性，且这已被充分报道。因为此特定测定给出半胱天冬酶3和半胱天冬酶7的测量值，因此即使半胱天冬酶7活性相当高，细胞凋亡的总体测量值也被半胱天冬酶3活性的缺失所抵消。因此，MCF7中的细胞死亡活性完全归因于半胱天冬酶7，并且很有可能MCF7细胞中的半胱天冬酶7活性总体上相当低。

另一方面，MDA-MB-231细胞示出更好的半胱天冬酶3/7活性。在未处理细胞中，总凋亡群体达到19.6％(图20A)，其在10mM HPβCD处理的样品中上升至48.75％(图20C)。上述确认在MDA-MB-231细胞中，HPβCD确实经由内在途径起作用并导致线粒体破裂，从而活化执行者半胱天冬酶3和半胱天冬酶7。在阳性样品(40μM PL)中，总凋亡群体为80.45％(图20B)。

在正常细胞(HEK-293)中，未处理细胞中的总健康群体为71.90％(图21A)，其在10mM HPβCD处理的样品中仅部分下降(图21C)并下降至66.75％。在阳性样品(40μM PL)中，总凋亡群体为72.4％(图21B)。这现在绝对保证HPβCD确实对正常细胞无毒。HPβCD的无毒性稍后在我们的体内测定中被另外验证。

胆固醇定量测定

为了研究从所有上述测定中观察到的细胞凋亡是否是由于胆固醇耗竭所致，对所有三种细胞系进行胆固醇测定：MCF7、MDA-MB-231和MRC-5。HPβCD和阳性PL(已知胆固醇耗竭剂)被处理24小时。

众所周知，癌细胞的胆固醇水平升高，因为胆固醇是细胞膜的组成部分，并且被癌细胞募集以进行快速分裂。

HPβCD和阳性(40μM PL)处理24小时。这种测定为我们带来总胆固醇、胆固醇酯和游离胆固醇的估计值。

针对MCF7的结果(图22)清楚地示出，与未处理细胞相比，HPβCD处理的细胞在从1mM、5mM、10mM、20mM和50mM开始的所有浓度下均使总胆固醇含量降低。在10mM(这是我们从早期测定中筛选出的安全使用浓度)下，与未处理样品相比，总胆固醇水平降低至75％以上。

与MCF7相比，MDA-MB-231细胞的胆固醇水平较低(图23)。结果清楚地示出，与未处理细胞相比，HPβCD处理的细胞在从1mM、5mM、10mM、20mM和50mM开始的所有HPβCD浓度下均使总胆固醇含量降低。在10mM下，与未处理样品如MCF7细胞相比，总胆固醇水平降低至50％以上(图23)。

与MCF7和MDA-MB-231细胞相比，非癌性MRC-5细胞的胆固醇水平较低，因为它们分裂的积极性较低，且因此需要较少的胆固醇。结果清楚地示出，与未处理细胞相比，HPβCD处理的细胞在从1mM、5mM、10mM、20mM和50mM开始的所有浓度下使总胆固醇含量降低(图24)。与类似于MCF7和MDA-MB-231细胞的未处理样品相比，在10mM下，总胆固醇水平降低至50％以上，但此耗竭足以实际杀死细胞，如从我们早期测定中观察到的。量化总胆固醇含量后，可看出，与正常MRC-5细胞相比，MCF7和MDA-MB-231细胞具有大约7.7和2.7倍的胆固醇。

胆固醇染色

为了另外验证从胆固醇测定中观察到的胆固醇耗竭，进行基于非律平的胆固醇染色。使用MCF7、MDA-MB-231细胞。由于不可用，无法使用HEK-293细胞。HPβCD和阳性(5mMMBCD)处理24小时。与PL一样，MBCD也是众所周知的胆固醇耗竭剂。

荧光显微镜已成为研究蛋白细胞内转运的强大工具。非律平与胆固醇特异性结合且可带来整体量化，且最近已在临床上用于诊断C型尼曼匹克症(Type C Niemann-Pickdisease)。

对于用非律平染色后的MCF7细胞，未处理样品(图25A)和10mM HPβCD处理的样品(图25C)在使用NIH的ImageJ软件测量的荧光强度方面示出显著差异。与未处理细胞相比，经处理细胞的荧光减少到四分之一。这与我们的胆固醇定量测定一致，其中10mM HPβCD处理导致几乎75％胆固醇耗竭。

与定量后的未处理样品相比，阳性样品(5mM MBCD)的荧光几乎减少到三分之一(图25B)。

类似地，对于MDA-MB-231细胞，未处理细胞(图26A)和10mM HPβCD处理的细胞(图26C)之间的荧光强度存在显著差异。

用ImageJ量化后，与未处理细胞相比，经处理细胞的荧光减少到六分之一。这再次与我们的胆固醇定量测定数据相关，其中在10mM HPβCD下，可看到几乎50％的总胆固醇被耗竭。与定量后的未处理样品相比，阳性样品(5mM MBCD)的荧光几乎减少到八分之一(图25B)。因此，可肯定，由我的HPβCD导致的细胞凋亡确实是由于胆固醇的整体耗竭。虽然无法对正常细胞进行研究，但我们已经充分了解到，与前面提到的癌细胞相比，它们的胆固醇水平确实较低，且因此会示出显著较少的荧光。

蛋白印迹法

为了深入研究胆固醇耗竭的更详细机制，对SREBP-1蛋白(已知参与胆固醇稳态的转录因子)进行蛋白印迹分析。使用来自MCF7、MDA-MB-231和MRC-5细胞的裂解物。10mM HPβCD处理24小时。SREBP是负责参与脂肪酸合成的重要酶的基因表达的关键要素，其包括SREBP 1和SREBP 2。SREBP的下调可能与细胞生长和迁移的退化相关，并且还已经被表明在若干种癌症中引起细胞凋亡。为了研究SREBP的这一特征，进行蛋白印迹分析以看出HPβCD处理是否确实改变SREBP水平。

对于MCF7，在使用Image LabTM软件的量化后，可看出，等量加载相应样品后，与未处理的裂解物(图27B)相比，经处理(10mM HPβCD)蛋白样品(图27A)的SREBP-1活性降低到约五分之一)。因此，指示SREBP-1在HPβCD处理后显著下调。

在MDA-MB-231中，也进行类似的观察。使用Image LabTM软件的定量后，可看出，等量加载相应样品后，与未处理的裂解物相比，经处理(10mM HPβCD)蛋白样品(图28A)的SREBP-1活性降低到约五分之二(图28B)。

有趣的是，在正常MRC-5细胞中，量化后，观察到SREBP-1活性在未处理的(图29A)和经处理的裂解物(图29B)中保持相等并保持在基础水平。此蛋白印迹分析是个确认，且证明HPβCD处理显著降低癌细胞中的SREBP-1活性，而在正常细胞中它保持不变且不影响胆固醇的生物合成

体内研究(小鼠异种移植物)

因为在我们的体外测定中确定HPβCD对乳腺癌的效力，所以在小鼠模型中进行彻底研究(裸鼠，MF-1品系)。MCF-7和MDA-MB-231细胞被注射到32只小鼠中(每种细胞类型16只)，且在肿瘤发展后，用HPβCD(3000mg/kg b.w.)处理。在整个研究过程中遵循每周三次的剂量处理计划。

为了检查HPβCD是否可用作未来的抗乳腺癌药物，制备小鼠异种移植物。MCF7细胞(500万)被注射到16只小鼠中，每周补充β-雌二醇。针对三阴性诱导乳腺癌(MDA-MB-231)的研究已完成。在16只小鼠中注射多达400万个细胞。这又细分为三组，即：晚期、中期和早期雌激素阴性癌症。将4只小鼠分为未处理组(未接受HPβCD)、经处理组(晚期)4只、经处理组(中期)3只和经处理组(早期)3只。

细胞注射后约5周后，在未处理组(n＝4)中观察到肿瘤且两周后平均大小上升至13178.12mm³(图30A、B、C)。这是因为MDA-MB-231细胞天生具有极强攻击性，这就是除了容易引起化疗的副作用外，还有任何适当治疗的原因。由于人道终点，这4只小鼠此时不得不被安乐死。在晚期经处理组中，当肿瘤大小在900mm³至1350mm³之间时开始处理(图30A、B、C)。在遵循其中HPβCD腹膜内给药10次(每天一次)的严格10剂量方法达2-3周后，我们看到肿瘤的进展显著减少，且与未处理组相比，肿瘤的平均大小显著降低至73.9％(图30C)。

在中期组(n＝3)中，当肿瘤大小达到～250mm³时开始处理。同样，在10剂次HPβCD处理后，我们看到肿瘤的平均大小下降至784.18mm³，与未处理组相比，这是惊人的94％减少(图31B、C)。考虑到MDA-MB-231细胞的侵袭性以及HPβCD驯服它们的能力相当惊人，这非常了不起。最后，在早期组(n＝3)中，当肿瘤大小为～20mm³时开始处理(图33A、B)。HPβCD给药10剂，且大约一周半后，肿瘤完全治愈(图34A、B)。然后将这3只小鼠饲养4周以检查肿瘤是否复发，因为雌激素阴性肿瘤极有复发倾向。复发试验4周后(图35)，清楚地观察到肿瘤没有复发。由于资金和技术限制，这些小鼠无法长期保留。

如图36所示，在未处理、中期和晚期MDA-MB-231小鼠中进行小鼠的苏木精和伊红染色。

结论(体内研究)

申请人相信，供用于治疗和/或预防乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)至少改善现有技术中已知的缺点，其中通常已知三阴性乳腺癌仍然对化疗治疗方案保持无反应。此外，HPβCD的使用不包括典型化疗治疗方案的严重副作用，其中改进接受乳腺癌治疗的人或动物的患者依从性和生活质量。

小鼠的苏木精和伊红染色：

肿瘤的显微镜检查(见表2和图36)示出实体生长模式，一些切片显示在骨骼肌之间解剖肿瘤细胞。MDA-MB-231小鼠中未处理、中期和晚期的苏木精和伊红检查示出在图36中。单个细胞显著多形性，且核质比提高。肿瘤细胞核边界不规则，且细胞呈囊泡状，有一至多个突出的核仁。活跃的有丝分裂活动明显。然而，没有记录神经周围和淋巴血管浸润的区域。

未处理组中的肿瘤切片在占所检查组织的1-5％的外周示出局灶性坏死区域。一个案例(UT3)显示广泛肌肉浸润。鉴定出凋亡细胞。来自这组肿瘤的一个案例(UT10)显示最大数量的有丝分裂(每10个高倍视野77个)。存在许多非典型有丝分裂。中期组肿瘤的切片示出整个肿瘤中有分散坏死灶，约占检查的总肿瘤的6-10％。注意到活跃有丝分裂活动，类似于在未处理组中可见的情况。观察到非典型有丝分裂象。这组肿瘤中的凋亡细胞数量与未处理组中的数量相当。

晚期组的切片示出整个肿瘤有坏死囊，其中一些显示大面积局部区域的坏死。坏死区域远比其他两组中可见的区域明显。一个案例(晚期12)示出坏死占检查组织的20％，因此说明与未处理组中观察到的相比，坏死增加到大约4倍。在这组肿瘤中注意到更多数量的凋亡细胞，其中晚期组与未处理组相比，凋亡细胞数量示出增加到大约1.7倍，以及与中期组相比，凋亡细胞数量示出增加到2.9倍。晚期组的有丝分裂活性是其他两组肿瘤中指出的活性的大约1.1倍。

表2.MDA-MB-231苏木精和伊红染色(H&E)切片的案例研究

因此，从小鼠研究的结论可推断，可能在人类中，如果肿瘤在晚期或中期被诊断出，HPβCD处理可减缓癌症的进展，从而提高人类的预期寿命且如果在早期阶段被诊断出。还假设可治愈乳腺癌，通常是三阴性乳腺癌，完全没有化疗的任何严重的复杂性和副作用。

HPβCD不诱导肝毒性

AST/ALT测定

安乐死后，分析小鼠血清的AST/ALT(丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶)水平，以观察HPβCD处理是否对经处理小鼠的肝脏有任何毒性作用(图37)。AST/ALT比值给出肝脏毒性或损伤的估计值。试验示出，HPβCD对小鼠没有毒性作用。所有早期和中期组的AST/ALT比值与未处理组无差异，均在推荐比值2以下，除晚期组AST水平外，其他数值均低于参考范围(40U/L)。在后几组中，AST/ALT比值为2.2，略高于推荐限值，但未发现与未处理组有统计学差异。这些结果示出，HPβCD在给药于小鼠时没有引起毒性。在这方面，请查看图37。

在MDA-MB-231细胞上进行另外的工作以鉴定癌细胞模型中的作用机制(使用RT-PCR[逆转录聚合酶链反应]阵列和染色)，并且验证作用机制并确认如上所述的药物-蛋白相互作用。

HPβCD作用机制的鉴定

运行PCR(聚合酶链反应)阵列以鉴定用HPβCD处理后癌细胞中的基因表达变化。差异表达的基因及其对癌症的意义，一些基因被选择用于另外的药物-蛋白相互作用研究。

RT2 ProfilerTMPCR Array人类脂蛋白信号和胆固醇代谢(MCF7和MDA-MB-231)的结果如图38所示。

RT2 ProfilerTMPCR Array人类乳腺癌(MCF和MDA-MB-231)的结果如图39所示。

基因表达分析后，从此阵列中选择五个基因。在MDA-MB-231细胞中，观察到Akt1上调，这表明乳腺癌细胞迁移例如通过调节TSC2、palladin和EMT蛋白而减少。作为Wnt通路的重要抑制剂的SFRP1是已知肿瘤抑制基因，其在多种肿瘤中表观遗传沉默也被观察到上调。有趣的是，作为管腔类肿瘤特别是乳腺癌的有用标记物的GATA3在用HPCD治疗后下调，表明该化合物作为可能治疗的功效。先前的研究强调，通过在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中的雌激素和生长因子以及通过雌激素受体阴性细胞中的未知机制而增加CTSD基因转录，因此使其成为一个有趣的研究候选者。从上述基因表达研究中观察到，CTSD在MDA-MB-231细胞中上调，而在MCF7中显著下调，这可表明HPβCD处理很可能是致病因子。最后但并非最不重要的是，选择导致乳腺癌进展和间充质循环肿瘤细胞扩散的ADAM23。在我们的案例中，ADAM23在MDA-MB-231细胞中上调，在MCF7中下调许多倍，这使其成为有趣的研究目标，并且可在所有方面验证HPβCD作为潜在药物的功效，并且还可研究HPβCD的潜在作用机制。

图40中的图示示出，在用HPβCD处理后，大多数参与胆固醇相关途径的基因被下调。这一信息首次在癌细胞中生成。这一观察结果强烈表明HPβCD通过扰乱癌细胞中的胆固醇稳态而起作用，且胆固醇耗竭可用作治疗癌症的治疗策略。

这些结果显示HPβCD阻断癌细胞中的若干种信号通路，尤其是DNA损伤和修复、AKT信号传导、Hedgehog信号传导和作为肿瘤的转移的原因的EMT(上皮向间充质转化)。在类固醇受体介导的信号传导中没有观察到显著变化，因此表明HPβCD不依赖于激素受体来诱导其作用(参见图41)。

图42中的图示示出，在用HPβCD处理后，类似于MDA-MB-231细胞，大多数参与胆固醇相关途径的基因被下调。这一观察结果强烈表明HPβCD通过扰乱癌细胞中的胆固醇稳态而起作用，且胆固醇耗竭可用作治疗癌症的治疗策略。

上述结果显示与MDA-MB-231细胞获得一样的类似趋势，并且观察到HPβCD阻断信号传导通路，如DNA损伤和修复、AKT信号传导、Hedgehog信号传导和作为肿瘤的转移的原因的EMT(上皮向间充质转化)。同样，在类固醇受体介导的信号传导中没有观察到显著变化，因此表明HPβCD不依赖于激素受体来诱导其作用(参见图43)。

确认作用机制

基于RT-PCR阵列数据来鉴定HPβCD和选定蛋白之间的药物-蛋白相互作用

基于以下蛋白在MCF7和MDA-MB231这两者中的基因表达分析，从阵列中选择六种蛋白：Akt1、ADAM23、Cathepsin D(CTSD)、SFRP1、GATA3和ABCA1，主要关注MDA-MB-231，因为用其完成小鼠研究。

确定HPβCD对Akt1、ADAM23、Cathepsin D(CTSD)、SFRP1、GATA3和ABCA1的结合亲和力。

使用BioNavisTM420A ILVES MP-SPR(BioNavis，坦佩雷，芬兰(Tampere,Finland))在25℃下进行HPβCD对六种人类蛋白的结合亲和力测定。作为运行缓冲液，使用脱气PBS Tween 20。重组蛋白作为配体以0.5ug/ml固定化在功能化3D羧甲基葡聚糖传感器(CMD 3D 500L；BioNavis，坦佩雷，芬兰)上。通过以下实现配体的固定化：根据由制造商(BioNavis，芬兰)提供的方案，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)[德国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich,Germany)]和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)[德国西格玛奥德里奇]活化后的胺偶联实现，以达到<200RU。没有固定化蛋白的参考通道用作非特异性结合和折射率变化的对照。作为分析物，HPβCD被制备成0、1.25、2.5、5和10nM的等分试样，以50μl/min的流速注入每个流动池中3次。仅用缓冲液的注射用作对照。使配体和分析物之间结合3分钟并监测解离共10分钟。在使用TraceDrawer软件1.8版(Ridgeview Instruments，瑞典)使用全局拟合对传感图进行双重参考后，对动力学稳态平衡常数数据进行处理。

结果：

HPβCD与六种人类蛋白相互作用(图44)。HPβCD与人类蛋白的动力学分析示出，在纳摩尔范围内与SFRP1的亲和力最高，而ADAM3蛋白在微摩尔范围内的结合亲和力最低(表3)。

表3.HPCD与人重组蛋白相互作用的动力学数据

HPβCD与各种人类蛋白的直接相互作用动力学由SPR分析确定的结合率(Ka)、解离率(Kd)和稳态亲和力(KD)表示。配体代表CMD 3D 500L芯片表面上的相应固定化蛋白，分析物(HPβCD)以50μl/min的流速注入该芯片表面至少3次。在作为基线的双重参考(没有蛋白固定化的芯片表面和没有分析物注入的缓冲液的折射率变化)后，分析数据。数据表示为平均值加/减测量标准误差。确定的卡方(χ2)值示出1:1langmuir曲线拟合残差。

结论

1.HPβCD与蛋白结合的亲和力依次为，亲和力高：SPRF1>ABCA1>AKT1>GATA3>Cathepsin>ADAM3，亲和力低。

2.结合率，快速结合：SFRP1>AKT1>ABCA1>GATA3>Cathepsin>ADAM3最慢结合。

3.解离速率，解离快：SRFP1>ADAM>AKT>ABCA>GATA3>Cathepsin解离慢。

使用非律平对小鼠肿瘤组织进行的胆固醇染色

图45示出小鼠切片的非律平染色(针对胆固醇)。未处理4例，中期3例，晚期4例。结果示出，与未处理相比，中期和晚期肿瘤中的胆固醇降低。

结果示出，随着鉴定出胆固醇的显著降低，HPβCD到达肿瘤并从肿瘤中提取胆固醇。这确认HPβCD通过提取胆固醇来减小肿瘤大小，从而阻止癌细胞的增殖。

使用非律平对癌细胞进行的胆固醇染色

图46示出MDA-MB-231细胞的针对胆固醇的非律平染色。结果示出，与未处理细胞相比，经处理细胞中胆固醇降低。

使用BODIPY对癌细胞进行的脂质染色

图47示出MDA-MB-231细胞的针对脂滴的BODIPY染色。绿色代表脂质染色，而蓝色是核染色。结果示出与未处理细胞相比，经处理细胞中的脂滴减少。脂滴储存胆固醇，而HPβCD能够减少胆固醇在癌细胞中的积累和储存。

使用Alexa Flour对癌细胞中脂筏进行的染色

图48示出用于脂筏解离的MDA-MB-231细胞的ALEXA FLUOR染色。结果示出与未处理细胞相比，经处理细胞中的脂筏减少。

结论

进行的不同活动使我们能够确定：

1.HPβCD在细胞和小鼠模型中的抗肿瘤潜力，

2.鉴定癌细胞模型中的作用机制，以及

3.验证作用机制并确认药物-蛋白相互作用。

我们已经确认HPβCD影响癌细胞中的若干种分子机制，尤其是胆固醇相关通路(如小鼠肿瘤样品和RT-PCR数据所确认)，从而为HPβCD的抗癌潜力确定证据。我们还鉴定细胞中的若干个蛋白靶标，这些靶标已被确认与HPβCD结合。其中一个关键蛋白是SFRP1，已知它可调节癌症相关的信号通路，SFRP1示出在纳摩尔范围内与HPβCD最强的结合。这意味着HPCD稳定蛋白在细胞中的作用。在包括乳腺癌的许多癌症中均发现SFRP1的下调，因此，此蛋白的延长表达将有助于防止癌症进展。在我们的研究中，我们发现HPβCD上调SFRP1的mRNA的表达，并且它还与蛋白结合。

总之，我们已经确认HPβCD通过耗竭癌细胞中的胆固醇来抑制肿瘤的生长和进展，这是若干个胆固醇相关途径的分子水平变化的结果。通过调节若干种与癌症相关的信号传导通路来放大这些效应，最终抑制癌细胞的生长。HPβCD的主要优点是安全性，因为它对人类无毒(如先前研究所确认)，因此为癌症治疗提供全新途径。

我们已经示出HPβCD对乳腺癌肿瘤，尤其是三阴性乳腺癌(TNBC)的疗效。我们还阐明其分子的作用机制。对于患有TNBC的患者来说，HPCD可为极具成本效益的治疗方法，而迄今为止，除了手术和化疗外，HPCD没有其他治疗方法，这两种方法均有严重的副作用，存活率不到5年。

还对MCF-7细胞诱导的ER+乳腺癌小鼠模型的进行另外工作。

HPβCD显著减小雌激素阳性乳腺癌的肿瘤大小

还试验HPβCD对异种移植小鼠模型中雌激素阳性MCF7细胞诱导的肿瘤的抗癌作用。这项研究没有完成，因为16只小鼠中仅4只小鼠出现肿瘤发展。但是出现肿瘤发展的小鼠用HPβCD进行处理，且观察到96.6％的肿瘤减少(图49和50)。图49示出照片，其示出4只小鼠(ER+)中肿瘤发展的照片。(A)示出小鼠29号肿瘤173.21mm³，(B)示出小鼠30号肿瘤163.46mm³，(C)示出小鼠31号肿瘤188.01mm³，和(D)示出小鼠32号肿瘤103.74mm³。

图50(A)至(D)示出用HPβCD处理5周的ER+小鼠的照片。(A)示出小鼠29号，其中肿瘤完全治愈，(B)示出小鼠32号，其中肿瘤完全治愈，(C)示出小鼠31号，其中肿瘤减小至21.28mm³，和(D)示出小鼠30号，其中肿瘤完全治愈。平均肿瘤大小为5.3mm³。肿瘤减小96.6％。

使用非律平对癌细胞进行的胆固醇染色

结果示出，与未处理细胞相比，经处理细胞中胆固醇减少(参见图51)。图51(A)至(C)示出MCF7细胞的针对胆固醇的非律平染色，其中(A)未处理，(B)为阳性且(C)经处理。(D)以图形方式示出，与未处理细胞相比，经处理细胞中胆固醇减少。

使用BODIPY对癌细胞进行的脂质染色

结果示出与未处理细胞相比，经处理细胞中的脂滴减少。脂滴储存胆固醇，且HPβCD能够减少胆固醇在癌细胞中的积累和储存(参见图52)。图52(A)至(C)示出MCF7细胞的针对脂滴的BODIPY染色。绿色(黑白图中较暗的区域)示出脂质染色，而蓝色(黑白图中较亮的限定区域)是核染色。(A)未处理，(B)为阳性，(C)经处理。(D)以图形方式示出结果，其中与未处理细胞相比，经处理细胞中的脂滴减少。脂滴储存胆固醇，且HPβCD能够减少胆固醇在癌细胞中的积累和储存。

使用Alexa Fluor对癌细胞中脂筏进行的染色

结果示出与未处理细胞相比，经处理细胞中的脂筏减少(参见图53)。图53(A)至(C)示出MCF7细胞针对脂筏解离的ALEXA FLUOR染色，其中(A)未处理，(B)为阳性，(C)经处理。(D)以图形方式示出结果，其中与未处理细胞相比，经处理细胞中的脂筏减少。

HPβCD可安全用于人类和动物，并且提供可的解决方案，从而为其中实体瘤通常转移并导致死亡的三阴性乳腺癌提供成本效益且高效的治疗方案。此外，因为已知HPβCD在人体临床试验中是安全的，且因此药物注册程序可快速进行。申请人惊讶地发现HPβCD不与健康细胞相互作用，但对乳腺癌细胞具有显著影响。

虽然已经关于特定实施方案和/或其实施例详细描述本发明，但是应当理解，本领域技术人员在获得对前述内容的理解后可容易地想到这些实施方案的更改、变型和等价物。因此，本发明的范围应该被评估为权利要求及其任何等效物的范围，该权利要求被附加到本文。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.供用于治疗人体或动物体内的三阴性乳腺癌的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)。

2.根据权利要求1所述的供用的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，其中所述2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)被配制成药物组合物。

3.根据权利要求2所述的供用的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，其中所述药物组合物用于经由肠胃外和/或非肠胃外途径给药。

4.根据权利要求3所述的供用的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，其中所述肠胃外给药选自以下组中的至少一种：经静脉内、肌肉内或植入所述人体或动物体内。

5.根据权利要求3所述的供用的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，其中所述非肠胃外给药选自以下组中的至少一种：将所述药物组合物经口服-、直肠-、阴道-、舌下-、口腔-和鼻内-递送到所述人体或动物体内。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的供用的2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，其中所述药物组合物还包括赋形剂和/或附加活性药物成分。