具体实施方式

在以下讨论中，术语“食品”还包括饮料。术语“水”包括饮用水，但术语“水”也包括在需要水中的微生物中的一种或多种微生物的定量测量结果的其他情况下使用的水。

如上所述，食品、饲料和水生产者使用定量技术来测定食品、饲料(例如动物饲料)、水和相应加工环境中微生物(诸如细菌病原体)的量。定量技术用于例如评估在食品生产期间使用的病原体干预过程的有效性。此类分析可导致更有效的风险分析，并导致开发更有效的方式来降低食品、饲料和水供应中病原体的水平。然而，上文讨论的用于在生物测定物中测定病原体的量的传统方法是耗时、繁琐且容易出错的。它们可能需要专门的培养基，并且可能花费一天或更多天来给出结果。

分子方法(例如LAMP或PCR)也可用于定量从样本中提取的病原体。病原体量化的分子方法在比更传统的方法更短的时间量(例如以小时为单位，而不是一天或多天)内提供结果。此外，它们不限于对总细菌和指示细菌进行量化，而且还可用于对特定细菌、酵母、霉菌或其他病原体进行定量。在实施过程中，生产者通过基于来自样本的测试结果从由已知核酸浓度构建的标准曲线外推样本中的病原体量来确定该量。然而，由已知核酸浓度构建的标准曲线可能不能很好地对应于从例如生产环境收集的样本中的生物体计数。

例如，qPCR被广泛用作检测多种细菌的分子方法。qPCR也可用于对给定量的样本中存在的病原体进行绝对量化。包含已知量的靶DNA(质粒、基因组DNA或其他核酸分子)的标准曲线与未知样本平行运行。基于标准曲线、用于核酸提取和分析的反应效率和稀释步骤，可估计未知样本中病原体的绝对数目。在这些类型的分析中，使用线性回归模型，扩增效率变得关键，并且每次运行需要运行标准，从而增加成本、时间、可能的样本污染。此外，当使用细胞计数(而不是DNA)时，标准曲线方法的使用有限。出于这些原因，传统的方法比用于微生物量化的分子方法更优选。

如上所述，基于诸如核酸扩增(例如，LAMP或PCR)的分子方法的测定是高效的。然而，它们可受到基质衍生物质的存在的影响，该基质衍生物质可干扰或阻止反应正确地进行，这一过程称为抑制。在食品生产中，基质衍生物质(诸如香料和环境样本)可充当可干扰核苷酸扩增测定(诸如PCR和LAMP)的抑制剂，从而导致假阴性结果。

可能难以消除抑制。小心的样本处理可用于例如移除抑制物质。然而，不能依赖样本处理来完全移除抑制物质。

扩增对照也可用于控制抑制。此类对照可用于例如验证测定是否已正确执行。通常，内部扩增对照(IAC)是存在于与样本或靶核酸提取物完全相同的反应中的非靶DNA序列。如果其被成功地扩增以产生信号，则认为反应中靶信号的任何不产生表示样本不包含靶病原体或生物体。然而，如果反应既不产生来自靶的信号也不产生来自IAC的信号，则其表示反应已失败，这表明当事实上靶生物体存在时不存在靶生物体(即，“假阴性”)。因此，在扩增循环期间检测假阴性对于可靠的测试可能是关键的。

扩增对照的添加增加了分子方法的复杂性和成本。当应用分子方法检测或定量样本中的靶生物体时，甚至在面对抑制的情况下，消除扩增对照的使用将是有利的。因此，下文给出了用于识别和校正抑制的方法。这些方法可例如用于校正核苷酸扩增中的量化，而无需内部或外部扩增对照。

以下公开内容描述了用于在生物测定物中定量病原体的系统和方法。以下公开内容还描述了用于在病原体量化的分子方法中训练和使用机器学习系统的系统和方法，从而提高病原体量化的准确性，并减少或消除对每次运行准备和使用标准曲线的需要。在本文所述的一些示例性方法中，LAMP生物发光测定和/或PCR测定(例如，qPCR测定)可用于训练运行中，以扩增以已知初始量存在于样本中的靶核酸(例如，与靶生物体相关联的核酸)并检测在靶核酸扩增期间在样本内生成的光。在本文所述的其他示例性方法中，可使用如下测定：诸如切口酶扩增反应(NEAR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或转录介导扩增(TMA)测定。

可使用此类测定的任何合适的变型。可使用的传统LAMP测定的变型可包括比色LAMP(cLAMP)测定，其中经由观察随核酸扩增发生的pH敏感性比色染料的颜色变化，可使由LAMP期间质子积聚驱动的pH变化可视化。其他此类变型可包括浊度-LAMP测定，其中焦磷酸镁在LAMP期间的形成导致浊度，该浊度与核酸收率相关联地增加并且可实时定量。在传统LAMP测定和/或PCR测定的此类变型中使用的材料和方法可为本领域的技术人员所理解的，因此在此不再详细描述。应当理解，本文所述的示例性核酸扩增技术及其变型并非旨在进行限制。相反，任何合适的核酸扩增技术可用于本文所述的技术中，诸如在用于扩增靶核酸的训练运行中。

可将来自训练运行的数据馈送到机器学习系统中以训练机器学习系统。然后，受过训练的机器学习系统可用于估计样本(诸如食品样本、饲料样本、水或来自食品或饲料加工环境的环境样本)中存在的靶生物体的未知初始量。在本文所述的其他示例性方法中，LAMP生物发光测定和/或PCR测定(例如，qPCR测定)可用于扩增存在于具有已知初始量的靶生物体的一系列样本中的靶核酸(例如，与靶生物体相关联的核酸)的训练运行中。该方法收集每个样本的表示在靶核酸扩增期间在样本内生成的光的数据，并且将所收集的数据与已知量的靶核酸或与已知量的检测到的生物体相关联。然后将来自训练运行的数据馈送到机器学习系统中以训练机器学习系统。然后可使用受过训练的机器学习系统来估计样本(诸如食品样本、饲料样本、水或来自食品或饲料加工环境的环境样本)中存在的靶生物体的未知初始量。

在本文所述的其他示例性方法中，LAMP生物发光测定和/或PCR测定(例如，qPCR测定)可用于获得对应于从特定环境(例如，家禽加工工厂或干酪工厂)收集的样本的数据。使用传统定量方法查看样本，并且每个样本用经由传统方法中的一种或多种传统方法确定的量值标记。然后将来自标记样本的数据馈送到机器学习系统中，以针对该特定环境训练机器学习系统。然后，受过训练的机器学习系统可用于更好地估计样本(诸如食品样本、饲料样本、水或来自特定环境的环境样本)中存在的靶生物体和/或核酸的未知初始量。

应当指出的是，虽然在一些示例中，与靶生物体相关联的核酸在本文中可被描述为DNA，但在其他示例中，与靶生物体相关联的核酸可为RNA。在此类其他示例中，在样本的总RNA或mRNA上的扩增技术(诸如定量逆转录PCR(RT-qPCR)和逆转录LAMP(RT-LAMP))可用于训练机器学习系统以估计样本中靶生物体的初始量的方法和/或用于应用此类受过训练的机器学习系统。

每个机器学习系统基于至少一个模型。该模型可以是基于诸如支持向量回归、随机森林回归、线性回归、岭回归、逻辑回归、拉索回归或最近邻回归的技术的回归模型。或者该模型可以是基于诸如支持向量机、决策树和随机森林、线性判别分析、神经网络、最近邻分类器、随机梯度下降分类器、高斯过程分类或原始贝叶斯的技术的分类模型。这两种类型的模型依赖于使用标记的数据集来训练模型。

图1是示出根据本公开的一个方面的包括核酸扩增设备和用户设备的示例性系统的框图，该核酸扩增设备被配置为扩增和检测与靶生物体相关联的核酸，该用户设备被配置为估计靶生物体的量。根据本公开的一个方面，核酸扩增设备8被配置为扩增和检测靶核酸。核酸扩增设备8包括被配置为扩增靶核酸的反应室10。在一个示例性方法中，如图1所示，反应室10包括可经由热源(诸如Peltier系统)加热和/或冷却的块体12。如图1所示，块体12限定多个凹陷部14，该多个凹陷部中的每个凹陷部的尺寸可被设计为接收反应容器，该反应容器可以是被配置用于核酸扩增测定的任何合适的塑料管。核酸扩增设备8还包括检测器16和控制单元18。检测器16可被配置为在控制单元18的控制下捕获反应室10内的光。例如，检测器16可被配置为捕获数据集，该数据集包括在一个或多个核酸扩增循环期间由接收在凹陷部14中的一个凹陷部内的反应容器内包含的样本内的发光物质发射的光的时间序列测量样本。在一些示例中，样本可包含靶核酸和发光物质，后者可发射与靶核酸呈化学计量关系的光，使得由发光物质发射的光随着样本中复制的靶核酸的量的增加而增加。

在一些示例中，核酸扩增设备8可以是被配置用于LAMP(例如，传统LAMP测定或cLAMP、浊度LAMP或传统LAMP测定的其他变型)的任何合适的核酸扩增设备。在光由检测器16捕获的发光物质发射的示例中，光可以是生物发光、荧光或任何可见颜色的光。在使用浊度LAMP技术的示例中，检测器可测量吸光度、透射率或反射率中的至少一者。除此之外或另选地，核酸扩增设备8可以是被配置用于qPCR或任何其他核酸扩增技术(例如，NEAR、HDA、NASBA、TMA或其他)的任何合适的核酸扩增设备。在一些此类其他示例中，由发光物质发射并由检测器16捕获的光可为荧光。

在本文所述的用于训练机器学习系统以对生物测定物中存在的靶核酸进行定量的一些示例性方法中(例如，使用核酸扩增设备8在反应容器中进行)，核酸扩增设备8可以是指定类型的核酸扩增设备。例如，核酸扩增设备8可以包括一个或多个特定特征和/或可以是来自特定制造商的核酸扩增设备的特定模型。在一些此类示例中，由此类方法产生的受过训练的机器学习系统可针对指定类型的核酸扩增设备进行定制，这可增强受过训练的机器学习系统的准确性。可使用具有任何合适配置的核酸扩增设备。例如，核酸扩增设备可包括被配置为接收反应容器而不是块体的支架(例如，旋转支架)。在一些此类示例中，反应容器可以是毛细管或更常规配置的管。在一些示例中，核酸扩增设备的检测器16可以定位在反应容器上方或任何合适的位置。因此，本文所述的核酸扩增设备的配置并非旨在进行限制，而是示出示例。

图1的示例性系统还包括用户设备20，该用户设备可包括处理器23和用于存储表示一个或多个受过训练的机器学习系统25的参数的存储器22。在一个示例性方法中，用户设备20从控制单元18接收所测试的每个样本的数据集。在一些此类示例性方法中，每个数据集包括表示在给定样本的扩增循环期间的特定时间由检测器16接收的光量的数据。如下面相对于图3进一步讨论的，用户设备20可以是诸如计算机工作站、平板电脑或在用户的实验室中与核酸扩增设备8协同定位的其他此类用户设备的设备。核酸扩增设备8可被配置为将数据集从控制单元18传输到用户设备20，诸如经由任何合适的有线连接(例如，金属迹线、光纤、以太网等)、无线连接(例如，个人局域网、局域网、城域网、广域网、基于云的系统等)或两者的组合。例如，用户设备20可包括通信单元，该通信单元包括网络接口卡诸如以太网卡、光收发器、射频收发器、接口卡、WiFi^TM无线电部件、USB或者可向/从核酸扩增设备8发送和接收信息的任何其他类型的设备。

在一些示例性方法中，处理器23可被配置为将在存储器22中存储的受过训练的机器学习系统25应用于数据集，并且根据数据集估计生物测定物中存在的靶生物体的量。在一些示例中，处理器23可诸如与有关生物测定物的其他数据相关联地存储靶生物体的估计量。可将靶生物体的估计量与极限测试中的对应阈值进行比较，以确定样本是通过极限测试还是未通过极限测试。在一些此类示例性方法中，阈值可以是与一个或多个监管标准、行业惯例或相关联的干预过程相关联的值。例如，样本中靶生物体的估计量可有助于使得能够评估设计用于提高过程效率和/或降低食品产品、饲料产品、水和/或相应制备环境中病原体水平的干预程序的有效性。

这样，包括将受过训练的机器学习系统应用于与靶核酸的扩增样本相关联的数据集以估计样本中靶生物体的量的系统和方法可有助于解决与病原体相关联的公共卫生问题。例如，由于本文所述的用于核酸定量的系统和方法比用于病原体定量的传统方法提供更快的量值，因此此类系统和方法可使病原体定量更易于被食品工业获取。这种增加的可及性可被食品工业用于例如获得与简单地通过检测病原体的存在与否而获得相比对病原体存在的更细微的理解。增加的可及性还可用于支持病原体分析中的极限测试，因为极限测试的一个目标是检测满足或超过阈值浓度的食源性病原体浓度并限制可能不利地影响公共卫生的产品的释放。

图2是示出根据本公开的一个方面的示例性系统6的框图，该系统包括图1的核酸扩增设备8、诸如服务器的外部设备、网络和经由网络将核酸扩增设备耦接到外部设备的接入点。在一个示例中，如图2所示，系统6可包括接入点24、网络26和一个或多个外部设备，诸如外部设备28(例如，服务器)，该外部设备可包括处理电路30和/或存储器32。在图2所示的示例中，核酸扩增设备8可使用用于经由无线连接与接入点24通信的通信电路(未示出)。接入点24然后将从核酸扩增设备8接收的信息经由有线连接通过网络26传送到外部设备28，并且将从外部设备28接收的信息经由无线连接通过网络26传送到核酸扩增设备8。

接入点24可包括经由多种连接(诸如电话拨号、数字用户线路(DSL)或电缆调制解调器或其他合适的连接)中的任一种连接到网络26的处理器。在其他示例中，接入点24可通过不同形式的连接(包括有线或无线连接)耦接到网络26。在一些示例中，接入点24可以是用户设备，诸如可与核酸扩增设备8和用户协同定位的计算机工作站或平板电脑。核酸扩增设备8可被配置为将数据传输到接入点24，诸如上文相对于图1所述的数据集。此外，接入点24可询问核酸扩增设备8，诸如周期性地或响应于来自用户或来自网络26的命令，以便检索与一个或多个生物测定物有关的数据集或检索在核酸扩增设备8的存储器(未示出)中存储的其他信息。接入点24然后可经由网络26将所检索的数据传送至外部设备28。

在一些示例中，外部设备28的存储器32可被配置为为从接入点24和/或核酸扩增设备8收集的数据提供安全存储位点。在一些示例中，存储器32存储表示一个或多个受过训练的机器学习系统35的参数。在一些示例中，外部设备28可将数据聚集在网页或其他文档中，以供用户经由接入点24或图2的系统的一个或多个其他计算设备查看。这样，图2的系统可实现与用户对食品或饲料产品和/或对应生产环境的测试相关联的数据的远程(例如，基于云的)存储和访问。此类系统可被定制为满足特定用户的数据存储和/或访问需要。

图3是示出根据本公开的一个方面的图1的用户设备20的特征的示意性概念图。尽管相对于图1的用户设备20描述了图3，但本文所述的用户设备20的一个或多个部件可在功能和/或结构上类似于图2中所示的接入点24和/或外部设备28的一个或多个部件。在一个示例性方法中，用户设备20包括用户界面40和计算设备42。用户界面40可包括显示器38、图形用户界面(GUI)、键盘、触摸屏、扬声器、麦克风等。

计算设备42包括一个或多个处理器23、一个或多个输入设备46、一个或多个通信单元48、一个或多个输出设备50和存储器22。在一些示例中，计算设备42和用户界面40是同一设备(诸如计算机工作站、平板电脑等)的部件。在一些此类示例中，用户界面40可包括输入设备46中的一个或多个输入设备。在其他示例中，计算设备42和用户界面40是单独的设备，使得用户界面40不一定包括输入设备46中的一个或多个输入设备。

计算设备42的一个或多个处理器23被配置为实现用于在计算设备42内执行的功能、处理指令或两者。例如，处理器23能够处理在存储器22内存储的指令，诸如用于将受过训练的机器学习系统应用于数据集以估计样本中存在的靶核酸或靶生物体的初始量的指令。一个或多个处理器23的示例可包括微处理器、控制器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或等效的分立或集成逻辑电路中的任何一者或多者。

在一些示例中，计算设备42可以利用一个或多个通信单元48经由一个或多个网络(诸如一个或多个有线或无线网络)与一个或多个外部设备(例如，图2的外部设备28和/或核酸扩增设备8)通信。通信单元48可包括网络接口卡，诸如以太网卡、光收发器、射频收发器或者被配置为发送和接收信息的任何其他类型的设备。通信单元48还可包括WiFi^TM无线电部件或通用串行总线(USB)接口。

在一些示例中，计算设备42的一个或多个输出设备50可被配置为使用例如音频、视频或触觉介质向用户提供输出。例如，输出设备50可包括用户界面40的显示器38、声卡、视频图形适配器卡或者用于将信号(诸如与关于由受过训练的机器学习系统分析的核酸扩增设备8执行的扩增循环产生的一个或多个数据集的状态、结果或其他方面的信息相关联的信号)转换成人类或机器可理解的适当形式的任何其他类型的设备。在一些示例性方法中，用户界面40包括由计算设备42采用的输出设备50中的一个或多个输出设备。

计算设备42的存储器22可被配置为在操作期间将信息存储在计算设备42内。在一些示例中，存储器22可包括计算机可读存储介质或计算机可读存储设备。存储器22可包括临时存储器，这意味着存储器22的一个或多个部件的主要目的可能不一定是长期存储。存储器22可包括易失性存储器，这意味着存储器22在未向其提供电力时不保持存储的内容。易失性存储器的示例包括随机存取存储器(RAM)、动态随机存取存储器(DRAM)、静态随机存取存储器(SRAM)以及本领域已知的其他形式的易失性存储器。在一些示例中，存储器22可用于存储供处理器23执行的程序指令，诸如用于将受过训练的机器学习系统应用于经由一个或多个通信单元48从核酸扩增设备8接收的数据集的指令。在一些示例中，存储器22可由在计算设备42上运行的软件或应用使用以在程序执行期间暂时地存储信息。

在一些示例中，存储器22还可包括信号处理模块52、训练模块54和检测模块56。在一些此类示例中，检测模块56包括机器学习系统(诸如机器学习系统25和35)，当受过训练时，该机器学习系统估计样本中的靶生物体的浓度。在一个此类示例性方法中，训练模块54接收由核酸扩增设备8在一个或多个扩增循环内收集的具有已知细胞浓度的测定物的数据集，并使用该数据集来训练检测模块56以估计样本中的靶生物体的浓度。

在一些示例中，存储器22可包括非易失性存储元件。此类非易失性存储元件的示例包括磁性硬盘、光盘、软盘、闪存或电可编程存储器(EPROM)或电可擦可编程(EEPROM)存储器的形式。在一个此类示例性方法中，信号处理模块52可以被配置为分析从核酸扩增设备8接收的数据，诸如由检测器16捕获并且包括由放大循环期间样本内的发光物质发射的光的时间序列测量样本的数据集，并且处理该数据以改善传感器数据的质量。

计算设备42还可包括为清楚起见在图3中未示出的附加部件。例如，计算设备42可包括用于向计算设备42的部件提供电力的电源。类似地，在计算设备42的每个示例中，图3所示的计算设备42的部件可以不是必需的。

图4是示出根据本公开的一个方面的在食品或饲料生产之前、期间和/或之后用于病原体测试的示例性点的流程图。如图4所示，食品生产环境60可包括原材料62。加工原材料62并生产最终产品66的食品生产过程64可在食品生产环境60内发生。在一些示例中，生产过程64可完全在食品生产环境60内发生，而原材料62可在图4所示的过程开始时从食品生产环境60的外部进入食品生产环境60。在一些示例中，食品生产环境60可以是收获食品或饲料材料的环境，诸如生长此类材料的温室或田地。在一些示例中，来自食品生产环境60的样本可以是来自食品生产环境60内的水源(诸如用于洗涤和/或烹饪的水源)的水样本。

原材料62可从食品生产环境60外部获取病原体，并且在原材料62被引入食品生产环境60时或之后将此类病原体引入食品生产环境60中。因此，为了帮助减少由病原体引起的食源性疾病，在原材料(例如原材料62)和食品生产环境(例如食品生产环境60)的病原体测试中存在增加的趋势。此外，原材料62的病原体测试可有助于通过在原材料进入食品生产环境60之前识别污染来防止最终产品66(或其他最终产品)的病原体污染，使得可避免污染的原材料进入食品生产环境60。

最终产品66可在装运出环境60之前，诸如在封装之前、期间和之后，在环境60内定位一段时间。最终产品66可从食品生产环境60或食品生产环境60内的其他来源获取病原体，诸如由原材料62引入的病原体。然而，如上所述，传统的病原体量化方法可能是显著耗时的，需要一天或多天来产生结果，并且病原体量化的分子方法尚未获得广泛的应用。在一些情况下，传统病原体量化方法所需的时间可限制食品加工速率。此外，由于时间要求，此类传统方法仅提供与获取样本的时间一样的当前病原体评估，这可能不提供对材料、环境或产品的当前状态的准确评估。因此，至少由于本文所述的病原体量化的分子方法、原材料62的病原体检测、食品生产环境60和/或最终产品66(例如，作为释放测试的一部分)的时间优势，诸如在测试点68处，根据此类方法，可提供最新评估，这最终可有助于防止污染的最终产品释放给公众。

图5是示出根据本公开的一个方面的用于估计样本中的靶生物体的量的示例性技术的流程图。图5的示例性方法可使用核酸扩增设备(诸如图1和图2的系统的核酸扩增设备8)来执行。如上文结合图1所述，核酸扩增设备8可以是任何合适类型的核酸扩增设备，并且可被配置为执行任何合适的核酸扩增技术，诸如LAMP或PCR。虽然在图1的系统的上下文中进行了描述，但图5的示例性技术可使用任何合适的核酸扩增设备和计算设备来执行。图5中一般性示出的技术的更具体的方面和示例将在下文中相对于图9A至图9C和图11进行描述。

在图5的示例性方法中，核酸扩增设备8扩增反应室10内的富集样本内的靶核酸(80)。在一些示例中，样本可来源于食品生产环境60、原材料62或最终产品66，如上文相对于图4所述。可将从样本中提取的核酸置于反应容器(例如，PCR管)和发射与靶核酸呈化学计量关系的光的发光物质内，该靶核酸可为与靶生物体(例如，细菌属或细菌种)相关联的DNA序列。在一些示例中，样本可以是来源于食品或饲料原材料、最终产品、水或生产环境的样本的富集样本。例如，置于反应容器中的样本可以是来自源于初始样本的培养物的富集样本。在一些此类示例中，生物体的估计量可为生物体的估计初始量。在一些示例中，包含样本和发光物质的此类反应容器在本文中可统称为“生物测定物”。核酸扩增设备的检测器16捕获包括在一个或多个扩增循环内由发光物质发射的光的时间序列测量样本的数据集，并且将数据集传输到用户设备20的计算设备42、接入点24的计算设备或任何其他合适的计算设备(82)。

在用户设备20的示例中，处理器23、信号处理模块52和/或计算设备42的其他部件中的一者或多者可将受过训练的机器学习系统应用于数据集，以估计样本中的靶生物体的量(84)。在一些示例中，数据集可以包括与扩增循环的一个或多个不同部分或阶段(诸如在扩增循环上发射的光的峰值振幅之前、期间和/或之后的一个或多个部分或阶段)相关联的一个或多个数据子集。包括来自扩增循环的此类不同部分或阶段的数据子集可有助于受过训练的机器学习系统可估计样本中靶生物体的量的准确性，如下文相对于图11和图12进一步所述。

图6和图7是示出可以与本文所述的系统和方法一起使用的示例性核酸扩增技术的代表性特征的概念图。下文相对于图6描述示例性LAMP技术的技术方面，诸如到此类技术方面可能与到达图6的示例相关的程度。图7示出可用于本文所述的系统和方法的示例性qPCR技术的方面。下文相对于图7讨论示例性qPCR技术的技术方面，诸如到此类技术方面可能与到达图7的示例相关的程度。然而，应当理解，本文所述的系统和方法可与任何合适的核酸扩增技术和设备一起使用，并且不限于相对于图6和图7所述的具体示例。

LAMP使用链置换Bst DNA聚合酶和四至六个引物以在恒定温度下(即，在等温条件下)产生连续的DNA扩增。在LAMP技术中，可通过在恒定温度(约60℃至65℃)下温育样本、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶和底物的混合物，在单个步骤中完成靶核酸的扩增和检测。在一些示例中，LAMP可提供高扩增效率，其中DNA在15分钟-60分钟内扩增10⁹次–10¹⁰次。由于其高特异性，扩增产物的存在可指示靶基因的存在。

在LAMP中，四种不同的引物识别模板(即，靶)DNA序列中的六个不同区域，并且两种环引物在LAMP期间识别相应单链环区域中的两个附加位点。识别靶DNA的六个不同区域的四种不同引物可包括正向内部引物(FIP)、正向外部引物(F3；aka FOP)、反向内部引物(BIP)和反向外部引物(B3；aka BOP)。两种环引物包括正向环引物(FLP)和反向环引物(BLP)。相比之下，PCR和qPCR各自使用非链置换Taq DNA聚合酶和两个相应的引物(正向引物和反向引物)来识别两个不同的区域。此外，qPCR使用对第三不同区域具有特异性的探针(例如，荧光发射分子信标探针、荧光发射水解探针、携带荧光发射探针元件的引物或包含荧光部分的另一种合适探针)。

两种环引物FL和BL可在LAMP期间结合至附加位点并加速反应。例如，含有与LAMP期间形成的哑铃状结构的5'端上的单链环区域(B1与B2区域之间或F1与F2区域之间)互补的序列的引物可在LAMP技术期间为DNA合成提供增加数量的起点。例如，包含六个环(未示出)的扩增产物可在LAMP期间形成。在不使用环引物FL和BL的示例性技术中，将不使用此类环中的六个中的四个。通过使用环引物，所有单链环均可用作DNA合成的起点，从而减少扩增时间。例如，用环引物扩增所需的时间可以是不使用环引物的示例中扩增所需的时间的约三分之一至约二分之一。在一些示例中，在使用环引物的情况下，扩增可在30分钟内实现。

图6示出了根据本公开的一个方面的基于生物发光强度随时间的测量结果的LAMP扩增循环期间核酸扩增的实时检测。在示例性LAMP技术中，等温DNA扩增释放焦磷酸盐(PPi)作为副产物。然后在存在腺苷5'-磷酸硫酸盐的情况下通过酶ATP-硫酸化酶将副产物PPi转化为腺苷三磷酸(ATP)。在一个此类示例性方法中，具有被分析靶核酸的样本的生物测定物可适于包含荧光素酶及其底物荧光素，后者可用作本文所述的示例性系统和方法中的发光物质。由于ATP是荧光素酶与产生生物发光的荧光素反应的辅因子，所以在LAMP技术的扩增循环期间PPi向ATP的转化驱动生物发光的发射。生物发光的这种发射可通过被配置用于LAMP的核酸扩增设备的检测器(诸如图1和图2的核酸扩增设备8的检测器16)来检测，并且将表示生物发光的时间序列测量结果的数据存储为数据集。在一些示例中，用于在图6所示的LAMP技术期间生成光的机制可提供一个或多个其他益处，诸如使得能够实时检测在相对短的时间段(诸如约15分钟)内在LAMP扩增循环期间发生的核酸扩增。

在包含靶核酸的生物测定物中由发光物质(例如，荧光素)发射的相对光单位(RLU)的时间序列测量结果在曲线90中示出。由不含靶核酸的对照中的发光物质(例如，荧光素)发射的相对光单位(RLU)的时间序列测量结果在基线曲线92中示出。如曲线90所示，在LAMP扩增循环期间靶核酸的指数扩增产生具有RLU快速增加和RLU快速降低两者的生物发光信号。在此类示例中，达到峰值RLU发射的时间对应于靶生物体的量。例如，相对较大量的靶生物体可产生较短的达到峰值RLU发射的时间。因此，曲线90的一个或多个方面(诸如达到峰值的时间或振幅)可用于训练机器学习系统以估计样本中的靶生物体的量。

在一些示例中，用于训练机器学习系统(诸如神经网络)的数据集包括捕获作为在整个扩增循环中捕获的生物发光的一组时间序列测量样本的数据。在一个此类示例中，大约每5秒获取发光测量结果，其可作为跨扩增循环的10秒、15秒、20秒和/或25秒间隔处的测量结果累积以用于报告目的。

在一些示例性方法中，用于训练机器学习系统(诸如神经网络)的数据集包括在整个核酸扩增循环内取得的生物发光的时间序列测量样本。在其他示例性方法中，训练数据集包括在扩增循环的第一阶段94、扩增循环的第二阶段96和扩增循环的第三阶段98中的一者或多者期间取得的测量结果。在一些此类示例中，可训练机器学习系统以基于第一数据子集、第二数据子集和第三数据子集中的每个中的样本，基于在整个扩增循环内采集的样本的数据集或仅基于第二子集中的样本，来估计样本中存在的靶生物体的量。在一个此类示例性方法中，来自第二子集的样本包括在T_max处获取的样本，其中T_max是在核酸扩增循环期间检测到靶核酸的最大振幅的时间。同样，可大约每5秒采集一次样本，其可累积至跨扩增循环的约10秒、15秒、20秒和/或25秒的测量结果以用于报告目的。部分地基于不与峰值扩增相关联的数据子集训练机器学习系统可提供比仅基于与峰值扩增相关联的一个或多个数据子集的训练更稳健的训练，这继而可增强经训练的机器学习系统准确估计未知量的靶生物体的能力。

检测器(诸如核酸扩增设备8的检测器16)可捕获包括在扩增循环期间由发光物质发射的光的时间序列测量样本的数据集，如曲线90所示，并且将数据集传输到计算设备(例如，计算设备42)，该计算设备可应用受过训练的机器学习系统。这样，在相对于图6所述的LAMP技术期间产生光的机制可使得用户能够比使用传统病原体定量方法可能实践的更快地在样本中获得估计量的靶生物体。

在PCR中，DNA延伸限于每个热循环的特定时段(即，扩增循环)。在PCR中，抑制剂的存在可防止聚合酶在允许的时间内延伸DNA，这可导致不完全的扩增产物并且可防止靶生物体的检测。PCR的温度循环以及变性步骤期间聚合酶与DNA模板的缔合和解离为抑制剂提供了许多干扰的机会。与基于PCR和免疫测定的系统相比，在LAMP技术中抑制可能不太可能发生。另外，PCR可能更有可能受到一些食品样本和富集培养基的天然荧光的干扰。因此，在本文所述的系统和方法中使用LAMP技术可提供优于使用PCR技术的一种或多种有益效果。然而，如上所述，在其他示例中，结合本文所述的系统和方法使用PCR技术可提供优于传统病原体定量方法的一种或多种有益效果。

图7示出了根据本公开的一个方面的基于荧光强度随时间的测量结果的跨多个PCR循环的示例性qPCR技术期间核酸扩增的检测。在一些此类示例中，发光物质可为荧光发射水解探针，诸如TaqMan水解探针(购自赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))。在PCR期间，Taq聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性在与互补靶DNA序列杂交期间将探针裂解成两部分100A和100B。水解探针的裂解产生荧光信号，在图7中由曲线102表示。

如曲线102所示，在包括多个扩增循环的PCR运行期间靶核酸的扩增产生荧光信号。曲线102可包括反映靶核酸扩增的对应部分或阶段的若干部分或阶段。例如，曲线102可以包括对应于扩增的起始阶段的第一部分104，在此期间荧光信号可以保持低于阈值。曲线102还可以包括对应于指数扩增阶段的第二部分106，在此期间荧光超过阈值并以指数方式增加。最后，曲线102可以包括对应于扩增的平稳阶段的第三部分108，在此期间荧光保持高于阈值并且在附加的扩增循环中缓慢增加。

与图6的示例性LAMP技术一样，可训练机器学习系统以基于对应于如上所述的荧光信号的第一阶段、第二阶段和第三阶段中的相应阶段的第一数据子集、第二数据子集和第三数据子集中的每一者来估计样本中存在的靶生物体的量。还可训练机器学习系统以基于在整个扩增循环内收集的荧光信号测量结果的数据集来估计样本中存在的靶生物体的量。部分地基于不与PCR运行的指数扩增阶段相关联的数据子集(例如，在扩增循环开始时产生的背景荧光)训练机器学习系统可以提供比仅基于与峰值扩增相关联的一个或多个数据子集(例如，至少包含指数阶段的子集)更稳健的训练，这继而可增强受过训练的机器学习系统准确估计未知量的靶生物体的能力。

图8示出了根据本公开的一个方面的在五个沙门氏菌属菌株的LAMP分子测定中达到峰值振幅的时间与细胞计数的关系。在一些示例性方法中，使用高质量DNA和来自DNA扩增报告基因的单个响应值执行基于DNA的测定物的量化。该响应值(通常为荧光或生物发光)可基于超过预设阈值的信号或基于峰值振幅值。图8示出了具有来自五个沙门氏菌属菌株的响应的线性模型，其中n＝480。在一些示例中，可能期望的是估计样本中靶生物体的不止一种菌株或菌种(例如属内)的初始量，因为此类菌株或菌种中的不止一种菌株或菌种可能是病原性的。使用靶生物体的多个菌株的方法将在图8的上下文中讨论。

在图8所示的示例中，通过用来自对应于每个菌株的琼脂平板的单一菌落接种10mL缓冲蛋白胨水(BPW，3M公司，圣保罗(BPW,3MCompany,St.Paul))执行培养物制备(表1)。将接种的液体培养基在37℃下温育18小时。

表1.

¹美国模式培养物保藏中心和Tecra^TM保藏中心。

为了计数，将培养物在Butterfields缓冲液中连续稀释，并按照生产商的说明铺板于3M^TM品牌Petrifilm^TM Aerobic Count(AC)平板(3M公司)(下文称为“Petrifilm AC平板”)上。将培养物保持在4℃-8℃下，直到获得平板计数结果。使用3M^TM品牌分子检测测定2–沙门氏菌属(3M公司)(以下“MDA2–Sal”)，获得的计数用于估计用于检测的细胞数。在进行检测测定时，使用Petrifilm AC平板进行最终平板计数。这些最终平板计数用于报告细胞浓度。

在一个示例方法中，将每个菌株在Butterfield缓冲液中连续稀释至大约10²个、10³个、10⁴个、10⁵个和10⁶个菌落形成单位(CFU)/毫升。使用MDA2-Sal按照制造商的说明分析来自每种稀释液的等分试样。然后使用3M公司提供的MDS软件来确定达峰时间-对靶序列扩增的响应。图8示出了每个等分试样在从每个菌株的最终平板计数确定的等分试样的细胞浓度下的达峰时间响应。然后使用已知浓度的细胞的达峰时间的数据集来训练决策森林回归模型和增强型决策树模型。这两种方法产生大约0.75的确定系数。用于围绕线110训练线性回归模型的相同数据集产生大约0.2912的确定系数R²。诸如支持向量回归、随机森林回归、岭回归、逻辑回归、拉索和最近邻回归的其他回归技术也可用于基于已知浓度的细胞的达峰时间的数据集来训练模型。

达峰时间响应并不总是细胞计数的最佳量度。不同的基质(即，除样本中的纯培养物之外的物质或食品样本中的分子组分)可妨碍达峰时间响应与实际细胞计数之间的良好一致性。沙门氏菌属菌株的细胞的特定计数可例如根据细胞所在的基质产生不同的达峰时间测量结果。例如，不同的达峰时间测量结果可由鲑鱼基质对贝类基质中或其他不同基质中沙门氏菌属菌株的细胞的特定计数引起。在一些示例性方法中，跨越核酸扩增循环随时间推移的参数(诸如光强度)的测量结果提供对初始细胞计数的更好表示。即便如此，可能有利的是训练具有不同基质的机器学习系统以更准确地估计特定基质内靶生物体的量。

图9A至图9C和图10示出了用于在生物测定物中训练和使用机器学习系统对生物体进行定量的示例性系统和技术，该生物测定物诸如为包括相对于图8所述的沙门氏菌属菌种的生物测定物。图9A至图9C是示出根据本公开的方面的用于训练机器学习系统以及用于采用受过训练的机器学习系统来定量样本中所关注的靶生物体的示例性方法的流程图。图10是示出可在用于训练图9A和图9B的机器学习系统的示例性技术中使用的系统的框图。下文相对于图9A至图9C的示例性技术所述的用于训练和使用机器学习系统的系统和方法与诸如图8所示的模型中所示的基于达峰时间测量结果的模型相比，改善了所构建模型的预测能力。此外，与传统方法相比，当存在所涉及的特定基质(例如，家禽冲洗液基质)而不仅仅是纯培养物时，用于训练和使用机器学习系统的此类系统和方法表现良好。

在图9A的示例性方法中，系统6中的核酸扩增设备8用于测试具有已知细胞浓度的靶生物体的测定物以获得每个测定物的数据集(112)。测定物可来自培养物、来自基质或两者。然后用反映由核酸扩增设备在每个相应阵列中检测到的靶生物体的量的量标记每个数据集(114)。然后系统6使用标记的数据集训练机器学习系统(116)。在一些示例性方法中，该方法还包括使用受过训练的机器学习系统来估计测定物中的靶生物体的量(118)。在一些示例性方法中，使用诸如例如MPN的替代定量方法，用从相应测定物获得的量标记每个数据集。

在一些示例性方法中，每个数据集包括由检测器16在扩增循环期间检测到的光强度的时间序列测量样本。每个数据集标记有其相应测定物的已知细胞浓度，然后标记的数据集用于训练机器学习系统25或35，如下文所详述。然后使用机器学习系统25或35来估计每个测定物中的靶生物体的量。在一些示例性方法中，针对每个基质或基质类型使用不同的数据集。表示干酪中的靶生物体的基质可用于例如训练机器学习系统25或35以用于在干酪工厂中定量靶生物体。

图9B是示出用于从具有已知细胞浓度的基质获得数据集以及用于使用该数据集训练机器学习系统来定量基质中所关注的靶生物体的示例性方法的另一流程图。在图9B的示例性方法中，该方法包括从待测试的基质获得样本(122)，将富集培养基添加(124)到样本，稀释样本(126)，并且然后温育样本(128)，之后用核酸扩增设备分析样本以产生数据集(130)。该方法还包括使用替代方法(诸如MPN)测试样本以产生具有产生数据集的样本的已知细胞浓度的每个数据集的标签(120)。然后使用数据集及其相关联的标签来训练机器学习系统(132)。

在一些示例性方法中，每个数据集包括在一个或多个扩增循环期间随时间推移进行的光强度测量结果。在一些此类示例性方法中，每个数据集包括跨整个扩增循环捕获的光强度的时间序列测量结果。在一些示例性方法中，此类数据集还包括在扩增循环开始时的时段期间进行的测量结果，其中数据通常不被核酸扩增设备8捕获、丢弃或以其他方式抑制。在一些示例性方法中，每个数据集包括在T_max之前的第一时段中进行的光强度测量结果、在包括T_max的第二时间段中进行的光强度测量结果以及在T_max之后的第三时段中进行的光强度测量结果。

在图9B和图9C的示例性方法中，步骤120-132可在用于训练机器学习系统的示例性技术中执行，而步骤122-130和136可在用于使用受过训练的机器学习系统的示例性技术中执行。尽管本文可相对于一个或多个特定核酸扩增和检测部件来描述两种工作流程技术的一个或多个方面，但在其他示例中，图9B和图9C的技术可使用一个或多个其他核酸扩增和检测部件来执行。

在使用机器学习系统来估计靶生物体的量的一个此类示例性方法中，图9C的技术包括诸如由实验室工作人员或自动化设备接收基质的样本(122)。基质可为例如其中可存在靶生物体的基质，诸如关于图8所述的家禽冲洗液基质或食品产品的原材料的一部分或食品产品的最终产品。在接收到基质时，实验室工作人员或设备添加适当的富集培养基，该富集培养基被配置为使含有靶生物体和基质的样本内的靶生物体生长至可检测限度(124)。在一些示例中，诸如其中PCR技术用于扩增靶核酸的示例，适当的富集培养基可具有比一种或多种其他适当的富集培养基(诸如通过相对于其他适当的培养基发射较少的背景荧光)更不可能干扰在PCR期间发射的荧光的特性。接下来，在一些示例性方法中，工作人员或设备制备所得富集溶液的1:10稀释液(126)。如下文相对于图11和图12所述，使用1:10稀释液可增加受过训练的机器学习系统对靶生物体的特异性。可使用任何其他合适的稀释液，诸如1:100或1:1000。在一些示例性方法中，稀释液的量将取决于系统特性，诸如靶向生物体的类型和特定扩增技术。

接下来，温育富集溶液内的样本以允许富集靶生物体(128)。在一些示例中，可将样本在约35℃-42℃下温育约4小时-24小时或者在可使靶生物体能够适当生长的任何其他合适的温度和时间段下温育。在其他示例中，可以不使用富集步骤，而是可以在不富集的情况下从样本中提取核酸。在温育后，如果使用的话，在一些示例性方法中，经由扩增和检测与靶生物体相关联的靶核酸来分析样本(130)。例如，可使用具有光检测器16(诸如MDS)的核酸扩增设备8来扩增和检测靶核酸。例如，MDS可被配置为通过执行LAMP技术来扩增靶核酸，然后可使用检测器16检测由样本内的发光物质(例如，荧光素)发射的生物发光。通过将LAMP与生物发光检测相结合，核酸扩增设备(诸如MDS)可使食源性病原体的分子检测更简单和更快，从而为用户提供同时鉴定食品和/或环境样本中一种或多种靶生物体(例如，沙门氏菌属、李斯特氏菌属(Listeria)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌O157(包括H7)、弯曲杆菌、克罗诺杆菌(Cronobacter)和/或其他靶生物体的中的一种或多种菌种或菌株)的速度和便利性。在其他示例性方法中，使用不同的LAMP平台或使用PCR平台或不同的核酸扩增平台执行图9A至图9C的技术。

在一些示例性方法中，可抑制(例如，不记录)扩增循环早期(例如，在阶段94或阶段104之前)生成的光的振幅，以便不使用户混淆背景活性。然而，已经发现，此类信息可有助于训练机器学习系统。因此，在一个示例性方法中，数据集包括在图6中的阶段94之前进行的时间序列测量结果。在类似的示例性方法中，数据集包括在图7中的阶段104之前进行的时间序列测量结果。

在一些示例性方法中，标记的数据集通过专家检查已经对其进行核酸扩增的各个样本而产生。在一个此类示例性方法中，专家接收与样本相关联的数据集，确定样本中生物体和/或靶核酸的量(经由例如上述传统量化技术中的一种量化技术，诸如MPN)，并且用确定的数值标记每个数据集。然后使用标记的数据集来训练机器学习系统，如图9A和图9B所示。

在一些示例性方法中，数据集包括在整个扩增循环上以预定间隔(例如25秒)取得的时间序列测量结果。在其他示例性方法中，数据集包括选自扩增循环的某些阶段的数据。例如，数据集可包括来自图6中的阶段94、96和98中的一者或多者或来自图7中的阶段104、106和108中的一者或多者的数据。例如，在(130)包括LAMP技术的情况下，数据集可包括一个或多个数据子集，如相对于图6所述。例如，数据集可包括：第一数据子集，表示在扩增循环中直至第一时间点发射的光的时间序列测量样本，第一时间点发生在扩增循环中发射的光的峰值振幅之前；第二数据子集，表示在扩增循环中的第一时间点之后但在第二时间点之前发射的光的时间序列测量样本，第二时间点发生在峰值振幅之后；以及第三数据子集，表示在扩增循环中的第二时间点之后发射的光的时间序列测量样本。然后计算设备(例如，图2的外部设备28的处理电路30或任何其他合适的计算设备)训练机器学习系统以预测所关注的靶生物体的初始浓度(即，量)(132)。例如，计算设备可用与相应数据集或数据子集相关联的生物测定物内靶生物体的量的估计值来标记数据集和/或数据集的一个或多个子集。然后，计算设备用标记的数据集(或数据子集)和/或基质标识训练机器学习系统，以估计样本内的靶生物体的量，从而得到受过训练的模型。然后，计算设备可将受过训练的机器学习系统的参数存储到系统的一个或多个存储部件，诸如计算设备的存储器、用户设备20、接入点24的计算设备的存储器和/或任何其他合适的位置。

在与使用受过训练的机器学习系统来计算所关注的生物体的量相关联的工作流技术中，图9C的技术包括执行基本上如上文相对于用于训练机器学习系统的示例性技术所述的步骤122-130，尽管(122)处的基质可为食品原材料的样本、最终食品产品或可包含所关注的靶生物体而非已知量的靶生物体的环境样本。在此类示例中，核酸扩增和检测系统(诸如MDS)或被配置为在一个或多个扩增循环期间进行LAMP或PCR并检测由发光物质发射的光的另一系统可捕获数据集，该数据集包括在扩增循环期间由发光物质发射的光的时间序列测量样本，并分析数据集(130)。然后基于受过训练的机器学习模型来分析数据集，以得到基质中靶生物体的量的估计值(136)。

在一些此类示例中，数据集可包括对应于扩增循环的一个或多个部分的一个或多个数据子集，诸如以类似于机器学习系统用其训练的数据子集的方式。例如，对应于含有未知量的靶生物体的样本的数据集可包括：第一数据子集，表示在扩增循环中直至第一时间点发射的光的时间序列测量样本，第一时间点发生在扩增循环内发发射的光的峰值振幅之前；第二数据子集，表示在扩增循环中的第一时间点之后但在第二时间点之前发射的光的时间序列测量样本，第二时间点发生在峰值振幅之后；以及第三数据子集，表示在扩增循环中的第二时间点之后发射的光的时间序列测量样本。被配置为接收第一数据子集、第二数据子集和第三数据子集的计算设备(例如，用户设备20的计算设备42、接入点24的计算设备或任何其他合适的计算设备)将受过训练的机器学习系统应用于数据子集(136)并计算样本中所关注的靶生物体的浓度(例如，量)。在一些示例中，计算设备然后可将一个或多个此类估计量存储到系统的一个或多个存储部件，诸如MDS的存储器、计算设备用户设备20的存储器、接入点24的计算设备的存储器和/或任何其他合适的位置。

在一些示例性方法中，根据所测试的基质类型来训练单独的机器学习系统。例如，可训练单独的系统用于测试干酪或用于测试饲料，其中每个机器语言机器学习系统的参数基于被测试基质类型来在存储器中存储。

图10是示出根据本公开的一个方面的设备训练系统的框图。在图10所示的示例中，设备训练系统140包括经由链路148连接到标记的数据集模块146的训练模块144。训练模块144还经由链路152连接到机器学习系统存储器150。在一些示例性方法中，设备训练系统140经由链路154连接到用户设备156。在一个示例性方法中，训练模块144包括计算设备、一个或多个存储部件和用户界面。例如，设备训练系统140可包括图2的外部设备28的计算设备和存储器32。在一个示例性方法中，训练模块144从标记的数据集模块146接收标记的数据集。在一些此类示例性方法中，每个标记的数据集包括与样本相关联的靶生物体量以及在样本的扩增循环期间由核酸扩增设备8检测到的光的测量结果。训练模块144训练具有标记数据集的机器学习系统，并且将与机器学习系统相关联的参数存储在算法150中。

获得标记数据可能耗时，因为标记数据的产生需要专家检查各个样本或生成可用于与被测量样本进行比较的参考样本。替代地，在没有标记数据的情况下，可通过仔细控制在其中采集样本的环境来近似标记数据。下面将讨论用于从参考样本生成标记数据的示例性方法。

为了计数，将培养物在Butterfields缓冲液中连续稀释，并按照生产商的说明铺板于3M^TM品牌Petrifilm^TMAerobic Count(AC)平板(3M公司)(下文称为“Petrifilm AC平板”)上。将培养物保持在4℃-8℃下，直到获得平板计数结果。使用3M^TM品牌分子检测测定2–沙门氏菌属(3M公司)(以下“MDA2–Sal”)，获得的计数用于估计用于检测的细胞数。在进行检测测定时，使用Petrifilm AC平板进行最终平板计数。这些最终平板计数用于报告细胞浓度。在一个示例方法中，将每个菌株在Butterfield缓冲液中连续稀释至大约10²CFU/毫升、10³CFU/毫升、10⁴CFU/毫升、10⁵CFU/毫升和10⁶CFU/毫升。使用MDA2-Sal按照制造商的说明分析来自每种稀释液的等分试样。然后使用3M公司提供的MDS软件来确定达峰时间-对靶序列扩增的响应。

图11至图14示出了用于使用受过训练的机器学习系统来预测样本家禽冲洗液中五种沙门氏菌属菌种的量的技术。图11示出了根据本公开的一个方面的用于训练机器学习模型以估计接种到基质中的靶细胞的细胞计数的技术，以及用于使用受过训练的机器学习模型以基于受过训练的模型来估计基质中的细胞计数的技术。在图11的技术的一个示例性方法中，通过将400mL BPW添加到整个家禽胴体中并用手混合来制备家禽冲洗液(200)。在移除胴体后，用上表1中的每种菌株的大约10¹个、10²个、10³个和10⁴个细胞/样本接种冲洗液的10mL等分试样(202)。如上面图8的讨论中所用的示例所述制备菌株。在一个示例性方法中，将富集培养基添加到每个等分试样(204)。在图12所示的方法中，基质在206处不稀释，而在图13所示的示例中，富集基质在1:10稀释液中稀释(206)。然后将接种的冲洗液在41.5℃下温育7小时(208)。温育后，使用MDA2-Sal按照制造商的说明分析来自冲洗液的等分试样。捕获每个等分试样的信号响应(相对光单位)作为在大约60分钟内(即，在MDS的DNA扩增循环内)取得的一系列测量结果，并且将表示测量结果的数据存储在与每个等分试样相关联的数据集中(210)。

在一些示例性方法中，每个数据集包括第一数据子集、第二数据子集和第三数据子集。第一数据子集包括在扩增循环中的第一时间点之前捕获的测量结果，第一时间点发生在时间Tmax之前，其中时间Tmax对应于核酸扩增循环中测量的参数达到峰值振幅的时间。第二数据子集包括在核酸扩增循环中的第一时间点之后但在第二时间点之前捕获的测量结果，第二时间点发生在Tmax之后。第三数据子集包括在核酸扩增循环中的第二时间点之后捕获的测量结果。

在训练模式中，基于与数据集相关联的等分试样中初始细胞浓度的估计值，用细胞浓度标记每个数据集。在其他示例性方法中，每个数据集标记有经由另一方法(诸如MPN)获得的值。然后使用标记的数据集训练诸如神经网络的机器学习模型以估计基质中的细胞浓度(212)。

在生产模式中，机器学习系统接收由核酸检测器分析的每个基质的数据集，并且通过将数据集应用于受过训练的机器学习模型来确定基质中靶生物体的初始浓度(214)。图12中示出了显示来自基于神经网络的机器学习模型的预测细胞浓度与从对应的平板计数确定的细胞浓度之间的差值的示例。在图12所示的该示例中，该模型能够解释数据集中的84％的总体可变性。

在一个示例性方法中，图11的技术在所关注的生物体的每次已知水平接种时进行。在一个此类示例性方法中，以多个CFU接种水平中的每个CFU接种水平重复该过程足够的次数以建立数据集的代表性样本。在一些此类示例性方法中，对于每种类型的基质，这可能需要在每种接种水平下运行100个或更多个扩增循环。在一个此类示例性方法中，水平包括低于10CFU的水平，诸如1CFU-10CFU、10CFU-100CFU之间的水平、10CFU-1000CFU之间的水平、高于1000CFU的水平和/或任何其他合适的已知接种水平。对于每个已知水平的接种，核酸扩增和检测设备可捕获包括在每个扩增循环期间由发光物质发射的光的时间序列测量样本的数据集。

图13示出了根据本公开的一个方面的由受过训练的机器学习系统进行的细胞计数预测与接种到家禽冲洗液基质中以及家禽冲洗液基质的1:10稀释液中的沙门氏菌属细胞的不同细胞计数之间的对数差值。可使用与图12的示例中使用的方法类似的方法。然而，在图13的示例中，冲洗液的1:10稀释液(图11的206)也被温育并并入分析中。

在一个此类示例性方法中，通过将400mL BPW添加到整个家禽胴体中并用手混合来制备家禽冲洗液。在移除胴体后，用上表1中的每种菌株的大约10¹个、10²个和10³个细胞/样本接种冲洗液的10mL等分试样。如上面图8的讨论中所用的示例所述制备菌株。对于每次冲洗，还在BPW中制备1:10稀释液。将接种的冲洗液和稀释液在41.5℃下温育7小时。温育后，使用MDA2-Sal按照制造商的说明分析来自所有样本的等分试样。如以上在针对图11和图12所讨论的示例中那样，在DNA扩增期间，随时间(60分钟)的整个信号响应(相对光单位)被提取、标记并用于训练神经网络算法。在一个此类示例性方法中，将来自10⁰稀释液和10¹稀释液的响应数据作为单个数据点进行处理并用接种到冲洗液中的细胞浓度进行标记。对于该示例性方法，图13中示出了来自神经网络模型的预测细胞浓度与来自对应平板计数的细胞浓度之间的差值。

在这种情况下，该模型能够解释数据集中99％的总体可变性、优于图8所示的线性模型的显著改善以及优于图12的示例性方法的改善。图13所示的结果表明，在一些示例中，可能期望在执行用于训练机器学习系统的技术时包括这种稀释液。

图14示出了根据本公开的方面的用于使用各种机器学习技术测量用于细胞计数预测的回归的性能的各种度量。在图14所示的示例中，使用上文在图13的示例方法中所述的方法制备并测试家禽冲洗液。如在图13所示的示例中，将来自10⁰稀释液和10¹稀释液两者的响应数据视为单个数据点并且用接种到冲洗液中的细胞浓度进行标记。然后使用标记的数据集训练神经网络模型、线性回归模型、贝叶斯线性回归模型、决策森林回归模型和增强型决策树回归模型。使用每个模型来预测细胞浓度。图14提供了将来自每个机器学习模型的结果与传统平板计数进行比较的度量。

因此，如本文所述，可能有利的是将受过训练的机器学习系统应用于来源于与一种或多种靶生物体相关联的核酸的核酸扩增生物测定物的数据集。与基于标准曲线的线性模型(诸如图8所示的模型)相比，训练和使用机器学习系统(诸如下文相对于图9A至图9C和图11所示所述)改善了所构建模型的预测能力。例如，通过将受过训练的机器学习系统应用于图8的数据集，此类方法使用决策森林回归或增强型决策树得到0.75的R²。因此，图12和图13示出除了减少或消除分离用于病原体量化的纯DNA的需求之外，本文所述的系统和方法还可对所关注的生物体的多种菌株或菌种(诸如多种沙门氏菌属菌种)表现良好。

如上所述，基于诸如核酸扩增(例如，LAMP或PCR)的分子方法的测定可受到基质衍生物质的存在的影响，该基质衍生物质可干扰或阻止反应正确地进行。在食品生产中，基质衍生物质(诸如香料和环境样本)可充当可干扰核苷酸扩增测定(诸如PCR和LAMP)的抑制剂，从而导致假阴性结果或具有不正确量化的阳性检测。

可能难以消除抑制或限制其效果。小心的样本处理可用于例如移除抑制物质。然而，不能依赖样本处理来完全移除抑制物质。抑制可经由扩增对照来检测；此类对照可用于例如验证测定是否已正确执行。扩增控制增加了分子方法的费用和复杂性。

图15是示出根据本公开的一个方面的在LAMP扩增循环期间标准样本和受抑制样本中的核酸扩增的概念图。如上所述，在LAMP中，生物发光的发射可通过被配置用于LAMP的核酸扩增设备的检测器(诸如图1和图2的核酸扩增设备8的检测器16)来检测。将表示生物发光强度的时间序列测量结果的数据存储为数据集。在一些示例中，用于在图15所示的LAMP技术期间生成光的机制可提供一个或多个其他益处，诸如使得能够实时检测在相对短的时间段(诸如约15分钟)内在LAMP扩增循环期间发生的核酸扩增。

可以若干方式表现出抑制。达峰时间是当评估反应中的抑制或其他问题(由于引物设计的差的反应性能)时观察到的一个特性。在图15中，样本示出了“正常”运行(300,302)和运行的后峰(304,306)，其中基质已知引起抑制。受抑制的样本可趋于表现出较长的达到峰值RLU发射的时间和较低的最大振幅。类似地，在PCR中，抑制剂的存在可防止聚合酶在允许的时间内延长DNA，这可导致不完全的扩增产物并且可防止靶生物体的检测。

然而，达峰时间的差值也可以是对不同DNA浓度的响应。因此，可能难以确定峰的移位是DNA浓度的产物还是由于某种抑制。下文在图16的上下文中描述的方法通过用来自具有不同抑制水平的测定物的数据集训练机器学习系统来识别并校正由于抑制引起的量化。

图16是示出根据本公开的一个方面的用于训练机器学习系统对受抑制样本中的靶生物体进行定量的示例性技术的流程图。该方法能够被用于例如在生物测定物(诸如包括关于图8所述的沙门氏菌属菌种的生物测定物)中定量生物体。与诸如图8所示的模型中所示的基于达峰时间测量结果的模型相比，基于该方法的系统和方法改善了所构建的模型的预测能力。此外，与传统方法相比，用于训练和使用机器学习系统的此类系统和方法在存在所涉及的特定基质(例如，家禽冲洗液基质)而不仅仅是纯培养物时表现良好，即使在面对抑制性物质的情况下也是如此。

在图16所示的示例中，训练机器学习系统(诸如分别图1和图2的机器学习系统25和35)以定量生物测定物中存在的靶生物体。在一个示例性方法中，诸如图10所示的设备训练系统140接收大量的数据集，每个数据集与针对靶生物体进行测试的生物测定物相关联(310)。大量的生物测定物包括抑制性物质。

在一个示例性方法中，每个数据集包括由检测器跨一个或多个核酸扩增循环收集的数据。数据包括在一个或多个核酸扩增循环期间的不同时间取得的活性测量结果，并且表示在生物测定物内与靶生物体相关联的靶核酸的核酸扩增。在一些示例性方法中，活性测量结果包括在包含靶核酸的生物测定物中由发光物质(例如，荧光素)发射的相对光单位(RLU)的时间序列测量结果。如上所述，在LAMP扩增循环期间靶核酸的指数级扩增产生RLU快速升高和RLU快速降低两者的生物发光信号。在此类示例中，通过RLU发射的测量结果所追踪的曲线对应于测定物中存在的靶生物体的量，甚至在面对抑制时也是如此。因此，设备训练系统140可使用表示在一个或多个扩增循环期间追踪的曲线的参数来训练机器学习系统以估计样本中的靶生物体的量。相关参数可包括达峰时间，但如上所述，达峰时间响应并不总是细胞计数的最佳量度。跨核酸扩增循环随时间推移的参数(诸如光强度)的测量结果提供了对初始细胞计数的更好表示。在一些示例性方法中，随时间推移的光强度的测量结果包括在扩增循环期间但在检测到靶核酸的扩增之前进行的强度测量结果。即便如此，可能有利的是训练具有不同基质和不同抑制水平的机器学习系统，以更准确地估计特定基质内靶生物体的量。

在一些示例中，用于训练机器学习系统(诸如神经网络)的数据集包括捕获作为在整个扩增循环捕获的生物发光的一组时间序列测量样本的数据，用于标准和受抑制的生物测定物两者。在一个此类LAMP示例中，大约每5秒获取发光测量结果，该发光测量结果可作为测量结果跨扩增循环以10秒、15秒、20秒和/或25秒的间隔累积，以用于报告目的。

回到图16的讨论，用相关联的生物测定物内存在的靶生物体的量的估计值标记由设备训练系统140接收的每个数据集(312)。然后使用标记的数据集训练机器学习系统，以估计所选生物测定物内的靶生物体的量(314)。在一个示例性方法中，机器学习系统基于在多个数据集中的每个数据集中存储的活性测量结果以及与每个相应的数据集相关联的生物测定物中存在的靶生物体的量的估计值来进行训练。在一个示例性方法中，标记的数据集用于训练模型，诸如神经网络模型、线性回归模型、贝叶斯线性回归模型、决策森林回归模型和增强型决策树回归模型，如上文在图14的上下文中所讨论的。

在图16的示例性方法中，系统6中的核酸扩增设备8用于测试具有已知细胞浓度的靶生物体的测定物，包括抑制测定物，以获得每个测定物的数据集。测定物可来自培养物、来自基质或两者。然后用反映由核酸扩增设备在每个相应阵列中检测到的靶生物体的量的量标记每个数据集(312)。然后系统140使用标记的数据集训练机器学习系统(314)。在一些示例性方法中，该方法还包括使用受过训练的机器学习系统来估计测定物中的靶生物体的量(316)。在一些示例性方法中，使用诸如例如MPN的替代定量方法，用从相应测定物获得的量标记每个数据集。在一些示例性方法中，针对每个基质或基质类型使用不同的数据集。表示干酪中的靶生物体的基质可用于例如训练机器学习系统25或35以用于在干酪工厂中定量靶生物体。

在一个示例性方法中，用于定量样本中存在的靶生物体的系统包括：检测设备(例如，图1和图2中的核酸扩增设备8)，被配置为扩增和检测与靶生物体相关联的靶核酸，以及机器学习系统(诸如图1中的机器学习系统25或图2中的机器学习系统35)，被配置为接收活性测量结果并基于活性测量结果来估计样本中的靶生物体的量。检测设备包括检测器和反应室，该反应室被配置为接收样本的测定物并且在核酸扩增循环内在测定物中扩增靶核酸。检测器被配置为在核酸扩增循环内的不同时间捕获表示测定物中存在的靶核酸的量的活性测量结果。

在一个此类示例性方法中，用多个训练数据集训练机器学习系统，每个训练数据集与训练测定物相关联，并且包括表示训练测定物中存在的靶核酸的量的活性测量结果，其中训练基于在每个训练数据集中存储的活性测量结果和与每个相应训练数据集中相关联的训练测定物中存在的靶生物体的量的估计值。训练测定物包括具有不同抑制水平的测定物。

作为食品、饲料和水生产安全的一部分，定量病原体变得日益重要。例如，对于某些病原体，诸如蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和弧菌(Vibrio)菌种，可能需要生产者不仅仅检测病原体的存在与否，而是可能需要生产者提供关于病原体的定量信息。此外，某些国家的法规可能需要用于风险评估的定量信息；仅仅存在/不存在标准可能不足以提供所需信息。例如，在欧洲，单核细胞增多性李斯特氏菌在某些产品中的最大允许水平根据产品的预期用途而变化。

即使在法规不要求的情况下，用于获得关于病原体的定量病原体信息的方法也可用于开发比使用存在/不存在标准可实现的更有效的干预过程和/或更有效的监测病原体水平的过程。食品、饲料和水生产者可能例如能够使用此类方法来评估当前干预程序在降低其产品中病原体水平方面的有效性。因此，确定不仅生物测定物中存在的微生物的存在而且微生物的量的能力不仅在定量病原体方面变得越来越重要，而且在评估控制食品、饲料、水和相应加工环境中病原体所采取的步骤的功效方面变得越来越重要。在存在抑制剂的情况下测定靶生物体的量的能力是特别重要的。上述技术提供了样本中病原体的快速、准确的定量，并且可消除对扩增对照的需要。此外，由于每种类型的微生物与一种或多种核酸相关联，因此上述技术可用于测定含有任何类型的微生物的样本中的细胞浓度。

已描述了各种示例。这些示例以及其他示例均在以下权利要求书的范围内。