用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用
阅读说明：本技术 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用 (Recombinant promoter and vector for protein expression in liver and application thereof ) 是由 潘杏 刘光猛 张胜 方文晶 何晓斌 于 2020-12-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因治疗领域,更具体地,涉及一种用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用。本发明公开的一组调控基因在肝脏系统高表达的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比,驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力明显增强,持续高水平表达能力增强,适用于重组腺病毒伴随病毒(rAAV)介导的基因治疗。(The invention belongs to the field of gene therapy, and particularly relates to a recombinant promoter and a vector for protein expression in liver and application thereof. The invention discloses a group of recombinant nucleic acid sequences for regulating and controlling high expression of genes in a liver system. Compared with other sequences with similar sizes reported at present, the recombinant regulatory sequence fragment obviously enhances the expression capability of a driving reporter gene and human coagulation factor FVIII in a liver system, enhances the continuous high-level expression capability, and is suitable for recombinant adenovirus associated virus (rAAV) mediated gene therapy.)
技术领域
本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，最终实现治疗目的。20世纪90年代以来，基因治疗技术已从实验室研究走向临床实际应用。从单纯的遗传病基因治疗，迅速扩展到肿瘤治疗领域，近年又研究作为抗病毒治疗正在深入研究中。肝脏的基因治疗是将治疗基因导入肝脏，以肝细胞作为生物反应细胞，进行治疗基因表达，产生治疗性蛋白质类进入血循环，达到治疗目的；同时又可以肝脏作为靶器官，治疗肝脏疾病。1992年Wilson等首次成功地进行了肝基因疗法的临床试验，将低密度脂蛋白(LDL)受体的基因导入患家族性高胆固醇血症病人的肝脏，揭开了肝脏基因疗法的序幕。肝脏既可作为基因的生物反应器，又可以作为治疗靶，肝脏的基因治疗对肝炎、肝硬化、肝癌等疾病提供了新的治疗前景。
腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点，近年来，用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点。重组AAV作为基因治疗载体也存在明显缺点，其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如A型血友病致病基因凝血因子Ⅷ，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FⅧ前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。
针对凝血因子Ⅷ基因较大和AAV载体装载基因受容量限制等特点，Lind P.,et al通过用14个氨基酸的衔接肽(SQ序列)替换凝血因子Ⅷ的B结构域(760-1667aa)，将该基因的大小降低40％至4.4kb(Lind P et al.,Eur.J.Biochem.232:19-27,1995)，该B domaindeleted FⅧ(BDD-FⅧ)是目前FⅧ蛋白表达较常采用的版本；Jenny McIntosh.,et al通过在SQ序列中间插入包含6个糖基化位点的17aa短肽V3(V3-FⅧ)来增强该蛋白在体内表达(Jenny McIntosh et al.,BLOOD.121(17)，2013)。但无论是BDD-FⅧ还是V3-FⅧ，其尺寸已经接近rAAV的装载上限，留给调控目的基因表达的调控元件(启动子、Poly A)只有大约300bp的空间。
FⅧ的主要合成场所是肝细胞和肝窦内皮细胞，目前使用rAAV基因治疗血友病A的策略是在缩小目的基因FⅧ的同时，采用小尺寸的肝脏特异性启动子，将启动子、BDD-FⅧ或V3-FⅧ、polyA组装到同一AAV载体有限的空间上，如BIOMARIN公司的BMN270的表达簇为HLP-BDD FⅧ-sPA(ClinicalTrials.gov number,NCT02576795)，SPARK公司的SPK-8011的表达簇为TTRm-BDD FⅧ-Rabbit beta globin poly A(ClinicalTrials.gov number,NCT03003533)，两者均采用的是小尺寸的肝脏特异性启动子驱动目的基因的表达，Ⅰ/Ⅰ期临床试验已经取得了一定的效果(Rangarajan S et al.,The New England journal ofmedicine.2017；Lindsey A.G et al.,Blood.130:604,2017)，其中BIOMARIN的血友病A基因治疗药物BMN270已向EMA提交上市申请。但由于启动子尺寸制约，其启动强度与一些较大尺寸启动子之间还是存在着不小的差距。
一个高效的启动子能够持续高强度的启动目的基因的表达，降低达到治疗效果所需剂量，降低给药次数，从而大大降低了治疗成本和机体的免疫反应。目前广泛为大家熟知的肝脏特异性启动子为TBG启动子(Human thyroxine binding globulin promoter，人甲状腺素结合球蛋白启动子，Bish et al.,2011；Carrillo-Carrasco et al.,2010；Cotugnoet al.,2011；Gao et al.,2002)。但是该启动子在肝脏中的启动强度并不理想，表达水平并不高(CN111218446A)。因此，以TTR启动子(Transthyretin promoter，甲状腺素转载蛋白启动子)以及hAAT启动子(Humanα1-antitrypsin promoter，人抗胰蛋白酶α1启动子)为基础的各种改造的新的启动子被运用在血友病A以及血友病B的基因治疗项目中，这些启动子包括TTRm启动子(SPARK公司spark-8011项目中突变后TTR启动子，ClinicalTrials.govnumber，NCT03003533)、ApoE-HCR-hAAT启动子(US7351813B2)、HLP启动子(BIOMARIN公司BMN270项目中启动子，ClinicalTrials.gov number，NCT02576795)、CRM8/TTRp/MVM(小鼠TTR启动子区域后添加MVM内含子，启动子区域前添加CRM8增强序列，sangoma公司SB525项目中启动子，ClinicalTrials.gov number,NCT03061201)、TTRe/TTRp/MVM(小鼠TTR增强子区域和启动子区域后添加MVM内含子，Wu Zhijian et al.,2009)、ATh1-5系列启动子(CN111218446A)。
由于rAAV装载容量限制，装载诸如凝血因子Ⅷ等较大基因时，势必要缩减启动子的长度，与之相对应的是，删除序列中所包含的关键表达调控元件也随之丢失，目的基因的表达强度和特异性也会随之下降。如何在最大程度缩减启动子尺寸的情况下，仍然维持启动子启动目的基因的强度和特异性，是采用rAAV作为载体递送较大基因时需要解决的重要问题。纵观以上改造后的肝脏启动子，基本上都是围绕以TTR和hAAT作为核心进行改造。因此，很难在维持较小尺寸的条件下改造出表达强度非常强的启动子。如何跳出现有改造的桎梏，筛选出更优表达强度更强的小尺寸启动子，从而解决采用rAAV作为载体递送较大基因时的痛点，是本发明需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供尺寸小且表达强度高的肝脏特异性启动子，并将其应用于驱动较大的外源基因表达(如FVIII凝血因子基因)，由此解决现有基因治疗所用rAAV载体存在装载容量有限、现有肝脏特异性启动子表达强度欠佳的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种重组核酸分子，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；
该重组核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
优选地，该重组核酸分子还包括：
(b)与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第二多核苷酸，或该第二多核苷酸的功能片段；
其中(b)和(a)5’-3’连接。
优选地，该重组核酸分子还包括：
(c)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第三多核苷酸，或该第三多核苷酸的功能片段；
其中(c)、(b)和(a)5’-3’依次连接。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的重组核酸分子的应用，用作肝脏中蛋白质表达的启动子。
优选地，所述重组核酸分子用作肝脏中蛋白质表达的启动子驱动FVIII凝血因子在肝脏中的表达。
按照本发明的另一个方面，提供了一种载体，包含所述的重组核酸分子。
优选地，所述载体为病毒载体或质粒。
优选地，所述载体为AAV载体。
按照本发明的另一个方面，提供了一种哺乳动物宿主细胞，其包括所述的表达载体。
按照本发明的另一个方面，提供了一种哺乳动物，其基因组包括所述的重组核酸分子或所述的表达载体。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供了一组调控基因在肝脏系统高表达的小尺寸的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比，驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力显著增强，适用于重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因治疗。
附图说明
图1是PFD-rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA载体结构示意图；
图2是不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果比较图；
图3是PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIIIopt(WJ)-spolyA载体结构示意图；
图4是C57小鼠上不同启动子表达FVIII效果比较图；
图5是AVS系列启动子在病毒注射后100天与HLP启动子FVIII表达量比值图；
图6是AVS系列启动子在病毒注射后160天与ATh3启动子FVIII表达量比值图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种重组核酸分子，其包括：
(a)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；该核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。
一些实施例中，该重组核酸分子还包括：
(b)与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第二多核苷酸，或该第二多核苷酸的功能片段；其中(b)和(a)5’-3’连接。
另一些实施例中，该重组核酸分子还包括：
(c)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第三多核苷酸，或该第三多核苷酸的功能片段；其中(c)、(b)和(a)5’-3’依次连接。
本发明还提供了所述的重组核酸分子的应用，用作肝脏特异性启动子。
一些实施例中，所述启动子可用于而不仅限于启动FVIII凝血因子基因在肝脏的表达。
本发明还提供了包括本发明的重组核酸分子的表达载体，其中核酸分子与异源多核苷酸可操作地连接。
优选实施例中，表达载体是质粒或病毒载体。哺乳动物表达载体的实例包括腺病毒载体、pSV和pCMV系列的质粒载体、牛痘载体和逆转录病毒载体、以及杆状病毒。在一些实施方式中，表达载体是腺相关病毒载体rAAV。
表达载体还可以包括以下一种或多种元件：复制起点、选择性标记和多克隆位点。
本发明还提供了包括本发明的表达载体的哺乳动物宿主细胞。可以通过任何合适的方法将表达载体转染到宿主细胞中。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如人细胞)。这些宿主细胞可以是分离细胞。
核酸分子能够促进哺乳动物细胞中可操作连接的异源多核苷酸的转录。优选的哺乳动物细胞包括小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、猴细胞和人细胞。此类细胞的实例包括HEK细胞和衍生物(例如HEK293、HEK293T、HEK293A)、PerC6细胞、911细胞、CHO细胞、HCT116细胞、HeLa细胞、COS细胞和VERO细胞；癌细胞例如HepG2、A549和MCF7；从人或动物活检分离的原代细胞；和干细胞(包括多能细胞，例如胚胎干细胞和诱导性多能干(iPS)细胞；以及多能干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞等)。
本发明还提供了一种哺乳动物，其基因组包括本发明的重组核酸分子或本发明的表达载体。优选地，本发明的核酸分子或本发明的表达载体插入哺乳动物的基因组中，使得与本发明的所述核酸分子可操作地连接或可操作地插入本发明的所述表达载体中的异源多核苷酸在哺乳动物的一个或多个细胞中表达。优选地，哺乳动物是小鼠或大鼠。在一些实施方式中，哺乳动物是非人哺乳动物。
为了便于评述本发明的各个实施方案，下文提供了具体术语的解释：
5’和/或3’：核酸分子(如DNA和RNA)具有5’端和3’端，因为单核苷酸以通过磷酸二酯键将一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接到其相邻的在一个方向上的3’氧上的方式发生反应以获得多核苷酸。因此，当其5’磷酸酯未与单核苷酸戊糖环的3’氧连接时，线性多核苷酸的一端被称为“5’”端。当其3’氧未与另一单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接时，多核苷酸的另一端被称为“3’”端。尽管一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接至其相邻环的3’氧上，但是内部核酸序列也可以具有5’和3’端。
在线性或环状核酸分子中，离散的内部元件被称为“下游”或3’元件的“上游”或5’。针对DNA，该术语反映出沿DNA链在5’至3’方向进行转录。指到相连基因转录的启动子和增强子一般位于编码区的5’或上游。然而，增强子元件甚至在位于启动子元件和编码区的3’时也能发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3’或下游。
如本文所用的，“至少90％相同性”的引用是指与特定的参考序列有“至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％甚或是100％相同性”。
实施例1
重组启动子片段
产生由表1认定的序列组成的重组启动子片段。
表1：重组启动子片段的序列
启动子名称
第三多核苷酸
第二多核苷酸
第一多核苷酸
AVS1 promoter
无
无
SEQ ID NO.1
AVS2 promoter
无
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.1
AVS3 promoter
无
SEQ ID NO.3
SEQ ID NO.1
AVS4 promoter
SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.1
AVS5 promoter
SEQ ID NO.5
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.1
AVS6 promoter
SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.3
SEQ ID NO.1
AVS7 promoter
SEQ ID NO.5
SEQ ID NO.3
SEQ ID NO.1
第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸(当存在时)在上述启动子片段中连续地连接。所产生的启动子依次命名为AVS1、AVS2、AVS2、AVS3、AVS4、AVS5、AVS6和AVS7。
实施例2
不同启动子启动mCHERRY荧光基因效果动物试验比较
1、构建包括不同启动子的rAAV表达载体
为比较不同启动子启动强度，本发明将上述嵌合启动子与已报道的广谱强启动子CMV以及肝脏特异性启动子TBG分别构建到AAV载体PFD-rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA上，如图1所示。
图1中ITR(inverted terminal repeat)，长度为145bp的反向末端重复序列；CMVenhancer/promoter，人巨细胞病毒早期启动子；mCHERRY，红色荧光素酶基因读码框；BGHpolyA,牛生长激素的多聚腺苷酸加微信号；Amp，氨苄青霉素抗性基因读码框；GmR，潮霉素抗性基因读码框；Tn7F/R,Tn7转座子；ori：复制起始位点；XhoI、AgeI、SacI，限制性内切酶位点。具体构建策略如下步骤。
1.1将PFD-rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA使用限制性内切酶XhoI和AgeI进行双酶切，进行线性化处理；
1.2设计引物扩增所需启动子片段，设计引物时预留限制性内切酶位点和18bp左右的同源重组臂用于和线性化后载体进行重组；
1.3根据所需重组片段数目选择ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，C112)和ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(诺唯赞，C113)将目的片段和载体骨架进行同源重组；
1.4将同源重组产物转化STBL3感受态，涂LB平板37℃过夜培养挑单克隆鉴定，将鉴定正确克隆摇菌提取质粒。
通过其启动mCHERRY荧光蛋白表达情况，比较不同启动子的启动水平。启动子序列信息如表2：
表2不同启动子的序列信息
2、293T细胞包装rAAV8病毒并纯化
将步骤1中构建的不同启动子、荧光蛋白mCHERRY和bGHpolyA AAV表达载体通过293三质粒系统将上述质粒包装为AAV2/8血清型病毒，将病毒用PEG8000沉淀后碘克沙醇密度梯度超速离心纯化AAV病毒(方法参考Aslanidi等,2009,Proc.NatlAcad.Sci.USA,206:5059-5064)。病毒滴度通过Q-PCR和银染进行定量(方法参考Lock et al.2010Hum GenTher.21:1273-1285)。
3、尾静脉注射C57小鼠
将不同AAV病毒以相同剂量3E+13vg/kg通过尾静脉注射方式注射到C57小鼠体内(n＝3)，注射病毒5周后，用生理盐水及4％多聚甲醛进行心脏灌流，取心、肝、脾、肺、肾、脑等4％多聚甲醛浸泡过夜，后浸泡在30％蔗糖溶液中72小时。取肝脏组织进行低温冷冻切片，荧光显微镜下观察荧光。比较不同启动子启动红色荧光的差异，结果见图2。
图2为不同启动子在小鼠肝脏组织中启动mCHERRY荧光效果比较。不同启动的AAV病毒以相同剂量3E+13vg/kg通过尾静脉注射方式注射到C57小鼠(n＝3)，注射病毒后5周后，肝脏组织mCHERRY荧光强度比较。曝光时间10ms左20右500。
从图2的实验结果可以看出，广谱强启动子CMV在AAV病毒注射5周后肝脏的表达水平非常低。常用的嗜肝启动子TBG在肝脏中的表达水平比CMV强一些，但是仍然没有改造后的其他启动子强。AAVS1改造后的AVS1的表达强度与TBG差不多，AVS2和AVS3的荧光强度远远高于TBG。说明经过改造后的AVS1、AVS2和AVS3启动子能够在肝脏中高表达荧光蛋白。
实施例3
不同启动子启动FVIII因子效果动物试验比较
1、不同启动子启动BDD-FVIII载体构建
为进一步论述AVS1、AVS2、AVS3启动子在肝脏的高启动水平是否受下游所连接基因的影响，以及在AVS2、AVS3前添加表达调控增强元件(AVS4，AVS5，AVS6，AVS7)是否能够进一步增加目的基因的表达。启动子信息如表3所示。
表3不同启动子的序列信息
将FVIII因子替换掉报告基因mCHERRY，按照实施例2中分子克隆方法构建不同启动子、BDD-FVIII(B domain deleted FVIII)和sPolyA表达框，构建到AAV载体PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIII-spolyA(图3)上，其中PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIII-spolyA载体使用限制性内切酶XhoI和AscI进行双酶切，进行线性化处理。
图3为PFD-rAAV-HLP-BDD-FVIIIopt(WJ)-spolyA载体结构示意图。其中ITR，inverted terminal repeat,长度为145bp的反向末端重复序列；HLP promoter,Biomarin公司治疗A型血友病项目BMN270采用的启动子，BDD-FVIIIopt(WJ)，密码子优化过的BDD-FVIII；polyA，多聚腺苷酸加尾信号；Amp，氨苄青霉素抗性基因读码框；GmR，潮霉素抗性基因读码框；Tn7F/R,Tn7转座子；ori：复制起始位点；XhoI、AscI，限制性内切酶位点。
2、不同启动子表达FVIII水平比较
通过sf9 One-bac系统将上述实施例1中构建的质粒包装为AAV2/8血清型病毒。将不同AAV病毒以相同剂量5E+12vg/kg尾静脉注射到C57小鼠(n＝6)体内，注射病毒后70天、100天、130天、160天后，眼眶静脉丛取血ELISA检测FVIII表达水平。所用ELISA抗体对为F8C-EIA(enzyme research laboratories)，使用绿十字的人凝血因子Ⅷ绘制标准曲线，凝血因子Ⅷ使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(产品编号:P0010S)进行浓度测定。检测结果使用Graphpad Prism5.0进行作图和分析，如图4所示。
图4为C57小鼠上不同启动子表达FVIII效果比较。不同启动子的AAV病毒以相同剂量5E+12vg/kg通过尾静脉注射方式注射到C57小鼠(n＝6)，注射病毒70天、100天、130天、160天，分别采集小鼠血浆，通过ELISA方式测定血浆中FVIII含量。
不同于专利CN111218446A中，第一个检测时间点14天，最后一个检测时间点70天，本发明的第一个检测时间点为病毒注射后70天，最后一个检测时间点为130天，可以更好的评估改造后的启动子的启动强度和持续性。其中ATh3为专利CN111218446A中的启动子，在该专利中70天的F8含量为923.03±425.98ng/ml，作为对照，在本发明中70天的F8含量为1118.06±125.45ng/ml。两者之间的波动较小，说明本发明中的检测结果是稳定可信的。
从检测结果整体趋势来看，由于AAV表达的时效性，从第70天到第160天，各启动子表达FVIII水平均有不同程度的下降。整体而言，各个时间点AVS1，AVS2，AVS3，AVS4，AVS5，AVS6，AVS7启动FVIII能力显著优于Spark公司的TTRm和Biomarin公司的HLP启动子。在Graphpad Prism5.0软件中进行2way ANOVA分析，得到各组间的P值和t值如表4至表7所示：
表4 HLP与本发明系列启动子的比较
表5 TTRm与本发明系列启动子的比较
表6 CRM8/TTRp/MVM与本发明系列启动子的比较
表7 ATh3与本发明系列启动子的比较
从以上表4-7可以看出，本发明的7个新改造的启动子AVS1-7均显著优于HLP和TTRm启动子，几乎所有时间点的P值均<0.05。在和长度为366bp的CRM8/TTRp/MVM启动子进行比较时，AVS2、AVS4、AVS5均有2个时间点的P值<0.05，AVS6、AVS7有3个时间点的P值<0.05，且以上5个启动子的长度均短于366bp，最长的为AVS7 327bp。在和ATh3启动子比较时，只有AVS6和AVS7有2个时间点的P值<0.05，新改造的AVS6和AVS7的启动强度也是显著优于ATh3启动子，且AVS6的长度为282bp，要比ATh3启动子286bp还要短上4bp。进一步比较本发明提供的重组启动子与HLP在启动表达FVIII表达量上的倍数关系，结果见图5和表8。可以看出，本发明的AVS系列启动子的启动水平明显高于HLP，在病毒注射后100天，所有启动子均比HLP的启动水平高4.68倍(AVS1)以上，最高达到9.19倍(AVS6)。图5为AVS系列启动子在病毒注射后100天与HLP启动子FVIII表达量比值。将HLP在100天的表达量平均值定义为1。
表8本发明提供的重组启动子与HLP在启动表达FVIII表达量上的倍数关系
病毒注射后天数
70d
100d
130d
160d
AVS1/HLP比值
4.34
4.68
5.77
3.56
AVS2/HLP比值
4.76
7.47
5.18
4.16
AVS3/HLP比值
3.84
5.11
5.30
1.98
AVS4/HLP比值
0.64
7.26
7.56
3.80
AVS5/HLP比值
5.14
6.16
5.47
3.96
AVS6/HLP比值
7.00
9.19
6.91
5.81
AVS7/HLP比值
7.10
7.24
5.77
7.42
同时与中国专利CN111218446A中公开的肝脏小启动子ATh3进行了FVIII表达量上的倍数比较，结果见图6和表9。可以看出，本发明的AVS系列启动子的启动水平整体上还是高于ATh3，在病毒注射后160天，除了AVS3是ATh3的0.68倍(另外3个时间点均高于ATh3)，其它的启动子均在1.23倍(AVS1)以上，最高达到2.56倍(AVS7)。由此，本发明提供的肝脏高表达启动子，长度和表达强度均要优于本领域的其他启动子。这对基因治疗领域中，需要用到AAV载体或者其他病毒载体，在肝脏中高表达外源基因，提供了更强大的小尺寸高启动效果的启动子选择，对本领域的发展有显著促进作用。图6为AVS系列启动子在病毒注射后160天与ATh3启动子FVIII表达量比值图。将ATh3在160天的表达量平均值定义为1。
表9本发明启动子与肝脏小启动子ATh3在FVIII表达量上的倍数比较
病毒注射后天数
70d
100d
130d
160d
AVS1/ATh3比值
1.63
0.96
1.15
1.23
AVS2/ATh3比值
1.78
1.53
1.03
1.44
AVS3/ATh3比值
1.44
1.05
1.06
0.68
AVS4/ATh3比值
0.24
7.26
7.56
1.31
AVS5/ATh3比值
1.93
1.26
1.09
1.37
AVS6/ATh3比值
2.62
1.88
1.38
2.00
AVS7/ATh3比值
2.66
1.48
1.15
2.56
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用
<141> 2020-12-22
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tctgctaatg gactccattt cccagcgctc cccgcgacct gcccagcaca ccctggggca 60
gcgccgtgac gtcagcacgc cgggcgggga ccgggagatc ctataaaatt ggggcggtgg 120
ggggccagcg gcagttcccg gcggccc 147
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aggcaaggtt catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc 60
aga 63
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60
gaccttggtt aatattcacc a 81
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatg 54
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<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tacctgctga tcgcccggcc cctgttcaaa catgtcctaa tactctgtct ctgcaagggt 60
catcagtagt tttccatctt actcaacatc ctcccagtg 99
<210> 6
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aggcaaggtt catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc 60
agatctgcta atggactcca tttcccagcg ctccccgcga cctgcccagc acaccctggg 120
gcagcgccgt gacgtcagca cgccgggcgg ggaccgggag atcctataaa attggggcgg 180
tggggggcca gcggcagttc ccggcggccc 210
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gggcgactca gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60
gaccttggtt aatattcacc atctgctaat ggactccatt tcccagcgct ccccgcgacc 120
tgcccagcac accctggggc agcgccgtga cgtcagcacg ccgggcgggg accgggagat 180
cctataaaat tggggcggtg gggggccagc ggcagttccc ggcggccc 228
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgaggcaa 60
ggttcatatt tgtgtaggtt acttattctc cttttgttga ctaagtcaat aatcagatct 120
gctaatggac tccatttccc agcgctcccc gcgacctgcc cagcacaccc tggggcagcg 180
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catcagtagt tttccatctt actcaacatc ctcccagtga ggcaaggttc atatttgtgt 120
aggttactta ttctcctttt gttgactaag tcaataatca gatctgctaa tggactccat 180
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ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt 120
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<212> DNA
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catcagtagt tttccatctt actcaacatc ctcccagtgg ggcgactcag atcccagcca 120
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ggggccagcg gcagttcccg gcggccc 327
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