一种骨发育异常疾病的致病基因col1a2突变及其检测试剂
阅读说明：本技术 一种骨发育异常疾病的致病基因col1a2突变及其检测试剂 (Pathogenic gene COL1A2 mutation of bone dysplasia disease and detection reagent thereof ) 是由 黄欢 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种成骨发育不全的致病突变及其检测试剂。一种新型突变型COL2A1基因,突变的COL2A1基因为单点突变c.3944G>A(chr12:48368588),杂合突变即致病,为显性遗传方式,氨基酸变化p.Cys1315Tyr,其位点突变导致关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白的结构发生改变,进而导致Ⅱ型胶原蛋白病。一种检测成骨发育不全的试剂盒包括：检测COL2A1基因CDS第3944bp位点的试剂；或检测COL2A1蛋白第1315位氨基酸位点的试剂。本发明获得成骨发育不全疾病的致病突变(COL2A1基因上c.3944G>A),通过检测该突变可以进行成骨发育不全疾病的诊断。(The invention discloses pathogenic mutation of osteogenesis imperfecta and a detection reagent thereof. A novel mutant COL2A1 gene features that the mutant COL2A1 gene is single-point mutation c.3944G > A (chr12:48368588), the heterozygosis mutation is pathogenic, and its site mutation can change the structure of collagen type II in articular cartilage and cause collagen type II disease. A kit for detecting osteogenesis imperfecta comprising: a reagent for detecting the 3944bp site of CDS of the COL2A1 gene; or a reagent for detecting the 1315 th amino acid site of the COL2A1 protein. The invention obtains the pathogenic mutation (c.3944G > A on COL2A1 gene) of the osteogenesis imperfecta disease, and the diagnosis of the osteogenesis imperfecta disease can be carried out by detecting the mutation.)
技术领域
本发明属于生物医学及遗传学领域，涉及一种骨发育异常疾病的致病基因COL1A2突变及其检测试剂。
背景技术
骨骼发育异常，又称侏儒症，是一群因骨骼或软骨异常而导致身材矮小的疾病总称，此类患者虽然大多数智力正常，但是这类疾病会影响骨骼与软骨组织的正常发育外，有时还会造成骨骼变形，甚至影响身体的其他系统。目前已报告200多种以上的骨骼发育异常疾病，很多先天性骨发育不良是由于遗传基因发生了突变所导致的，一般出现骨骼发育异常的情况是通过x光片以及核磁共振等检查来进行诊断和评估，一般出现在症状后，由于遗传病一旦发生就无法治疗，给社会和家庭带来了沉重的负担，唯一的措施是及早诊断，知情选择，因此寻找和验证遗传性疾病的致病位点，建立骨骼发育异常的基因诊断方法，进行产前基因诊断，避免该类患儿的出生，对减少社会和患者家庭的负担，实现优生优育，提高我国人口素质有着极其重要的意义。
十几年前，对于遗传病的诊断，一般先通过查体，进行生化、质谱检查，再进行核磁，CT等辅助检查，最后有针对性的进行基因检测，无法实现产前诊断，同时由于单基因病种类多，临床症状表现多样，因此遗传病的诊断效率不高，很多疾病没有得到明确诊断，甚至出现误诊，这些一直是困扰临床的问题。高通量测序技术(Next generationsequencing,NGS)的出现为上述问题提供了良好的解决方案。NGS速度快、通量高、操作自动化程度高，DNA样本从制备文库、上机测序，到数据分析，最快只需8-9小时，即可以一次检测疾病所有相关基因，大大提高了遗传病的诊断效率，尤其是全外显子测序的出现，大大增加了遗传病的致病突变检出率，该技术可一次性检测人类基因组中约2万多个基因外显子区，其中覆盖率达到95％以上的基因数为18105个，解读包括OMIM数据库中明确致病关系的4000多个基因，超过5000种疾病，并检测68种微缺失微重复综合征。尤其适合孕期超声提示骨骼系统存在问题，但既无家系(新发变异)，胎儿期临床表征的获得有局限性，进行胎儿父母及胎儿trio全外显子测序可以快速、准确、大范围(全部外显子)的寻找致病突变位点。
基于NGS的出现，临床上对于单基因遗传病的临床诊断策略发生了极大地变化，针对3种临床检测需求出现了不同的检测方案：(1)对于明确单一疾病，使用Sanger测序法、qPCR法或Panel单一疾病检测，检测平台为一代测序，MLPA或NGS，其优势和局限性在于扩增一个性状或一个疾病的基因，检测点突变和缺失重复，发现新突变，但不能发现新基因；(2)对于具有明确单一临床表型，存在家族史或其他明显遗传因素，对诊断周期、效率要求较高的对象，采用panel疾病组合或全panel检测，检测平台为NGS，其优势和局限性在于检测相关基因组合，检测结果临床意义明确，结果容易解释，周期比较短，性价比高，可以发现新突变，但不能发现新基因；(3)对于临床表征复杂或疾病方向不明的疑难案例，或者panel检测结果阴性，或基于多个疾病家系的临床科研，采用基于NGS的全外显子组测序检测，对整个外显子组捕获测序，发现点突变和缺失重复，可检测75-85％致病突变，发现新基因，但可能发现临床意义不明的突变，难以解释；也可以采用基于NGS的全基因组测序检测，可以检测人类全基因组，对整个基因组测序，发现点突变和缺失重复，结构变异，动态突变，可同时检测线粒体变异，发现新基因，但可能发现临床意义不明的突变，难以解释。
COL2A1基因位于12号染色体长臂12q13.11-q13.2位置，该基因长31.538kb,有54个外显子和53个内含子，编码1487个氨基酸。COL2A1基因编码了II型胶原蛋白的前-α1(II)链，II型胶原为支撑身体肌肉，关节，器官和皮肤的结缔组织增加了结构和强度，II型胶原主要存在于软骨中，大多数软骨随后被转化为骨，参与骨膜内成骨及软骨内成骨的调控过程。Ⅱ型胶原蛋白具有同源三聚体结构，由三个折叠成棒状的三股螺旋α多肽组成。胶原区域都由多个Gly-X-Y模式重复排列的氨基酸序列(Gly为甘氨酸,X通常代表脯氨酸，Y通常代表羟脯氨酸)组成。COL2A1基因外显子很多,迄今为止,已有百余个突变被报道，COL2A1基因相关的疾病有Torrance型椎骨体扁平性致死性骨骼发育不良、软骨生成不全2型、先天性脊椎骺发育不全、Kniest发育不良、Strudwick型脊椎干骺端发育不全等(https://mirror.omim.org/entry/120140)，OMIM所示COL2A1基因相关疾病均为常染色体显性遗传，然而COL2A1基因c.3944G>A(p.Cys1315Tyr)突变(基于以上策略，运用NGS技术检测而得)引起成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)从未被报道及得到证实。
发明内容
本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种骨发育异常疾病的致病基因COL1A2突变及其检测试剂。
本发明的另一目的是提供该致病突变的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种用于检测成骨发育不全疾病的突变的COL2A1基因，突变的COL2A1为杂合突变或纯合突变c.3944G>A，野生型COL2A1基因在NCBI数据库中的基因编号为：NM_001844.4，该基因CDS第3944bp处的碱基由G突变为A，其他部分与野生型相同。野生型的COL2A1基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
一种突变的COL2A1蛋白，野生型COL2A1蛋白在NCBI数据库中的基因转录本编号为：NP_001835.3，突变的COL2A1蛋白在该野生型蛋白的第1315位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸，其他部分与野生型相同。野生型的COL2A1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,
检测本发明所述的突变的COL2A1基因或者所述的突变的COL2A1蛋白的试剂在制备成骨发育不全疾病检测试剂或检测设备中的应用。
所述的检测试剂优选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片、高通量测序、Sanger测序中的一种或多种。
所述的引物对优选由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成。
所述的检测设备优选包括含有检测突变的COL2A1基因的基因芯片、高通量测序、Sanger测序的检测平台。
一种检测成骨发育不全疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(1)检测COL2A1基因CDS第3944bp处核苷酸的试剂；或检测COL1A1蛋白第1315位氨基酸位点的试剂；
(2)产品使用说明书,其中明确记载COL2A1基因CDS第3944bp处核苷酸由G突变为A,或者COL2A1蛋白第1315位氨基酸位点由C变为Y为成骨发育不全的致病突变。
其中，所述的试剂优选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片。
作为本发明的一种优选，所述的试剂为基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针。
所述的试剂进一步优选检测COL21A1基因CDS第3944bp处核苷酸的的引物对；更进一步优选由5'-TGGACTTAGCTCATGCAGAT-3'(SEQ ID NO.3)和5'-TGGATTGGGGTAGACGC-3'(SEQ ID NO.4)组成的引物对。
所述的试剂盒中检测COL2A1基因CDS第3944bp处核苷酸的基因芯片杂交探针序列优选如SEQ ID NO.5所示。
一种以深度测序为平台筛查OI患者中COL2A1基因新突变，斑马鱼突变模型结合SIFT和Polyphen蛋白功能预测来验证该基因突变为致病基因突变的方法：包含以下步骤：
(1)对于胎儿超声显示骨骼发育异常(+/-伴有其他异常)，或有OI遗传病史的家系，收集临床资料及血液、组织等含有DNA的标本，提取基因组DNA；
(2)检测与骨发育异常的一系列相关基因，包括基因ADAMTSL2，AGPS，ANKH，ARSE，CCDC8，CHST3，COL10A1，COL2A1，COL9A1，COL9A2，COL9A3，COMP，CTSK，CUL7，DLL3，EBP，EVC，EVC2，FBN1，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FLNB，GNAS,GNPAT，HES7，LFNG，LMNA，MATN3，MESP2，OBSL1，PEX7，PTH1R，ROR2，RUNX2，SLC26A2，SLC35D1，SMARCAL1，SOST，SOX9，TGFB1，TNFRS，F11A，TRAPPC2，TREM2，TYROBP，WNT5A，WNT7A，ZMPSTE24，COL1A1，COL1A2，CRTAP，P3H1，SERPINF1，IFITM5，FKBP10，PPIB，SP7，BMP1，SERPINH1，TMEM38 B，WNT1 B，WNT1B，WNT1；或直接进行全外显子检测，检测突变包括约2万个基因的点突变及20bp以内的小片段缺失插入突变。
(3)将DNA打断并制备文库，然后通过芯片对目标基因编码区或全外显子区域及临近剪切的DNA进行捕获和富集，最后使用高通量测序平台进行突变检测。
(4)对测序结果进行优化的生物信息学分析，筛选到一个新的OI致病突变为COL2A1.Cys1315Tyr。突变位于12号染色体，物理位置为48368588(NCBI数据库)的碱基由G突变为A；蛋白质水平：COL2A1基因编码蛋白第1315位氨基酸由半胱氨酸突变为酪氨酸。
(5)步骤(3)所述的高通量测序，基于全外显子测序的目标区长度为58682415bp，目标区覆盖度达到至少99.91％，目标区平均深度至少83.48X，目标区平均深度>30X位点所占比例至少为98.70％。
(6)对于新突变位点COL2A1.Cys1315Tyr，用SIFT和Polyphen对其进行蛋白功能预测。
(7)利用斑马鱼模型验证COL2A1基因上c.3944G>A点突变后影响骨骼发育，在ENSEMBL数据库中找到与人COL2A1基因高度相似的基因col2a1a(ENSDARG00000069093)，通过在野生型斑马鱼中表达col2a1a同样点突变基因来模拟在人体中的显性表达，观察斑马鱼胚胎的骨骼发育情况验证新突变位点COL2A1.c.3944G>A导致骨骼发育异常OI。
(8)基于Trio家系全外显子检测的检测结果，鉴定该突变的来源是新发突变，或是遗传性突变，如果为遗传性突变，还应根据父母一方的突变比例辨别是否为生殖腺嵌合突变。
(9)如为新发突变，下一次妊娠可选择自然受孕+产前诊断，再次患同一种突变的概率很低；如为遗传性突变，可选择试管婴儿+植入前遗传诊断+产前诊断，排除植入的胚胎遗传有相同的突变COL2A1.c.3944G>A。
有益效果
1.本发明首次报道了OI致病基因COL2A1.c.3944G>A中新的突变位点，为常染色体显性遗传病，无论杂合突变还是纯合突变，均致病，本发明为该疾病的诊断提供了新发致病位点。
2.提供寻找验证临床新突变的新思路，通过对临床表征复杂或疾病方向不明的疑难案例，进行Trio全外显子测序，家系的生物信息学分析新发突变的有害性，在斑马鱼等动物模型上进行验证,并在知情同意的情况下行试管婴儿结合植入前诊断，移植排除突变COL2A1.c.3944G>A的胚胎，从而获得无临床骨发育异常表征的正常孩子。
3.本发明的方法可扩展至除骨发育异常以外的其他领域临床表征复杂或疾病方向不明的疑难案例诊断和分析中，为临床提供一种寻找新突变位点，甚至是新突变基因的有效平台。
附图说明
图1胎儿超声结果图
图2家系Sanger测序结果
图3人COL2A1基因与斑马鱼中的同源基因突变位置的保守性，本发明所述突变位点(G3944A)及其在斑马鱼中的对应突变位点用方框表示
图4斑马鱼突变处序列的核苷酸和氨基酸对应图
图5构建斑马鱼转录及显微注射质粒
图6新位点在各数据库中SIFT预测结果。
图7新位点在各数据库中polyphen预测结果。
图8野生型斑马鱼及COL1A2基因c.3944G>A突变型斑马鱼
图9胎儿Sanger测序结果
图10PGT-M胎儿超声结果图
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种OI相关基因COL2A1的新突变位点，可用于诊断上述疾病，以及用于开发对于上述疾病有效的基因治疗药物。
在检测相关位点的变异时，检测可以针对基因组DNA，也可以针对cDNA或mRNA，或针对蛋白质。可用已有的技术如Western印迹法、Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变等。
可采用各种技术来检测野生型COL2A1基因(SEQ ID NO.1)第3944位是否存在G到A的突变，这些技术包含在本发明中。例如，基于相关位点制备基因芯片和高通量测序捕获探针。此外，可用相关位点特异的引物进行PCR来进行鉴定；或可根据相关位点设计可特异性结合的探针来进行鉴定；或可利用特异性的限制性内切酶来进行鉴定。
作为一种可选的方式，还可采用基于PCR技术的单碱基延伸技术来检测变异位点，其原理是设计一条引物，位于待测变异位点的上游，且该引物的3'端距离变异位点一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，或者通过焦磷酸测序加入dNTP及相关反应用酶，只有当加入的ddNTP或dNTP与变异位点碱基互补时，引物才得以延伸。可通过检测延伸碱基所发出的荧光或者焦磷酸测序中系列酶反应发出的可见光来判断变异的类型。
本发明还包括用于在分析物中检测是否含有所述变异位点(COL2A1基因CDS第3944位是否存在G到A的突变)的试剂。所述的试剂例如是：对相关突变位点特异的引物，扩增出的扩增产物含有对应于COL1A1基因第3944位的碱基；对相关突变位点特异的探针，可与发生突变区域发生特异性结合而不可与未发生突变区域特异性结合，且所述探针带有可检测信号；或对相关突变位点特异的限制性内切酶。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、RNA、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包含使用说明书和核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
对一个超声提示骨骼发育异常的胎儿进行遗传检测。
实验方法：
1.对于因丈夫染色体46,XY,inv(1)(p11q12)，行IVF-ET(PGT-A)妊娠单胚移植孕妇行系列超声结果的收集，及病例资料采集：收集引产胎儿的脐带组织及胎儿的父母采集外周血，进行遗传诊断。用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)对家系中各成员的血液和组织样中的基因组DNA进行提取。
2.采用高通量测序技术挖掘该家系的致病突变：行CNV-seq检测全基因组100kb以上缺失和重复综合征检测与全外显子范围内精确到1bp的突变检测。临床全外显子组检测-Trio检测区域人类基因组中约2万个基因的外显子区，检测策略为针对受检者临床症状主诉中涉及的OMIM数据库收录的所有明确致病关系的3583个基因进行逐个分析。
3.Trio全外显子信息分析包括对原始下机数据过滤掉接头、低质量碱基和未测出的碱基后比对到参考基因组上，进行SNP检测和InDel或者CNV分析，然后通过数据库注释，对变异检测的结果通过基于变异有害性、样本家系情况和基因功能表型三种分析策略，筛选出于疾病相关的有害性位点或基因。
4.经Sanger测序验证，鉴定致病基因：PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增，所用引物序列采用Primer 5引物设计软件设计，检测本发明所述致病突变的引物对序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。所用PCR的反应体系(50μl体系)为：10*buffer 5μl，25mM MgCl2 3μl，Taq DNA聚合酶5U，dNTP混合物2mM，正反向引物各1.2μM，灭菌蒸馏水加至50μl。放入PCR仪中，94℃，3min；(94℃，25s；55℃，25s；72℃20s)35个循环；72℃7min；4℃保存。2％琼脂糖电泳后凝胶成像仪检测，加入Marker判定片段大小，单一条带且片段大小符合的样本进行Sanger测序，判定位点是否发生突变或根据突变峰高判定是否存在嵌合情况。
实验结果：
1.超声科主任对孕妇腹中胎儿进行超声检测，发现胎儿先天发育异常，胎儿颈部淋巴水囊瘤，胎儿水肿，四肢发育短小(即四肢长骨均呈短条样回声)，胎儿头颅及躯干呈茧样包裹，胸廓狭小，腹部膨隆(图1)，初步判断致死性骨发育不良可能，而家族中未出现过类似症状的成员。
2.通过对胎儿引产组织样本DNA进行CNV-seq检测及全外显子检测后，发现胎儿在COL2A1基因上存在c.3944G>A突变，为VOUS突变，即临床意义不明的突变，未发现其他可疑的致病基因突变位点，全外显子二代测序的结果显示，其父亲在同样的突变位置存在低比例的嵌合，未在胎儿母亲的外周血DNA中发现同样的突变。经Sanger测序验证证实该基因位点的突变在胎儿样本中为杂合突变，在其父亲外周血中存在低比例嵌合突变，其母外周血中未发现突变，与二代测序结果一致(图2)。怀疑其父为生殖腺嵌合，可通过试管婴儿植入前诊断避免出生具有相同突变的患儿。
3.根据本发明的设计方案，成功证实所检测到的该COL2A1基因c.3944G>A突变为OI新致病位点。
实施例2：
针对实施例1中所检测出的致病基因进行功能学研究及基因敲除动物模型研究，此处以检测到的COL2A1基因新突变c.3944G>A为例。
实验方法：
1.保守型分析：对该位点在各数据库中发生的频率进行评估。
2.根据SIFT和polyphen值预测突变的致病能力。
3.基因敲除的动物模型证实突变位点为致病突变位点。
(1)分析COL2A1在斑马鱼中的同源基因及点突变位置，选择正确的斑马鱼中同源基因用于制备点突变；在ENSEMBL网站中找到与human COL2A1基因高度相似基因，为ENSDARG00000069093，分析突变位置的保守性，如图3。上述比对结果表明，该位点在斑马鱼的基因中保守，暗示其位点功能的重要性。为验证斑马鱼该位点突变导致类似的表型，选择斑马鱼中与human COL2A1相似度较高的基因col2a1a(ENSDARG00000069093)进行实验。
(2)验证COL2A1(G3944A)点突变功能的方法：在人类中，COL2A1(G3944A)在胚胎期呈现显性的骨骼发育异常表型，因此可以通过在野生型斑马鱼中表达col2a1a同样点突变基因来模拟在人体中的显性表达，进而通过观察斑马鱼胚胎的骨骼发育情况来验证。以col2a1a基因的转录本ENSDARG00000069093的序列为参照，设计引物克隆该基因全长以及构建col2a1a(G3944A)点突变，突变处序列的核苷酸和氨基酸对应图如图4所示。
(3)构建斑马鱼中表达col2a1a(G3944A)的质粒：突变点：G3944A，突变引物：已原始质粒为模板，扩增启动子区，选用引物col2a1a-F1(5'-CCT CTG ACA CCT GAT GCC AATTGC-3')和col2a1a-R1(5'-ATG CAG GTC CTA AGG GGT GAA AGT CG-3')，斑马鱼基因组DNA为模板，用三对引物扩增col2a1a突变片段，分别为col2a1a-M1F1(5'-ATG TTC AGA TTGCTG GAT TCA CG-3')和col2a1a-CDSR4(5'-GCC AAT TGG ACC AGT CAA ACC T-3')，col2a1a-F4(5'-AAG AGG TTT GAC TGG TCC AAT-3')和col2a1a-mutR(5'-CCA TGT TGTAGA AAA CTT TGA TGG CAT CAG CAG-3')，col2a1a-mut(5'-GCC ATC AAA GTT TTC TACAAC ATG GAG ACC GGA GAG ACC T-3')和col2a1a-CDSR5(5'-CAA GAA GCA GAC TGC GCCAAT GTC-3')。运用同源重组的方法合成质粒，质粒构建完成后，送至测序公司进行测序，经测序结果分析，质粒构建正确；菌种保存，质粒提取及纯化。质粒纯化后的浓度为400ng/μL。表达col2a1a(G3944A)的方法选用DNA显微注射(利用tol2转座酶介导高效转基因)，利用显微注射构建的过表达质粒(图5)和转座酶mRNA过表达，通过表型来确认是否有影响。
(4)表达col2a1a(G3944A)后的表型观察：显微注射后，持续观察其整体形态发育，尤其关注躯干骨骼发育情况(有无弯曲)。
实验结果：
1.COL2A1；NM_001844.4；c.3944G>A；p.Cys1315Tyr|p.C1315Y；EX52；CDS52：错义突变，暂无该位点致病性的相关文献报道。用SIFT和Polyphen对其进行蛋白功能预测，结果均为有害，该位点在正常人中发生的概率极低(图6-7)。COL2A1相关的Torrance型椎骨体扁平性致死性骨骼发育不良、软骨生成不全2型、先天性脊椎骺发育不全、Kniest发育不良、Strudwick型脊椎干骺端发育不全均为常染色体显性遗传，即等位基因上存在一个有害突变可能导致疾病发生。
2.通过脊柱弯曲表型分析发现，注射col2a1a质粒导致斑马鱼脊柱发生弯曲(图8)。
实施例3：
制定辅助生殖策略，夫妻双方知情同意选择辅助生殖行植入性诊断PGT-M和产前诊断实验方法：
对实施例1中移植后剩余的胚胎行PGT-M检测，选取不含该突变的胚胎(染色体CNV正常)进行移植，孕18周+，羊水穿刺核型分析，行COL2A1基因c.3944G>A(p.Cys1315Tyr)变异检测，以进一步确定该位点不存在突变，从受检者外周血、组织或羊水中直接提取基因组DNA，PCR扩增COL2A1基因52号外显子c.3944G>A(p.Cys1315Tyr)所在片段并Sanger测序，测序结果与COL2A1基因参比序列(NM_001844)比对。超声随访，及出生后随访。
实验结果：
1.从基因水平不提示胎儿(M3944，II-2)携带COL2A1基因c.3944G>A(p.Cys1315Tyr)变异(图9)。
2.超声提示无异常，目前出生后新生儿发育正常，无骨骼畸形等(图10)。
序列表
<110> 黄欢
<120> 一种骨发育异常疾病的致病基因COL1A2突变及其检测试剂
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5087
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
aacgggcgcc gcggcgggga gaagacgcag agcgctgctg ggctgccggg tctcccgctt 60
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ccctgggcct gctggtgcct ccggtaaccc tggaacagat ggaattcctg gagccaaagg 1440
atctgctggt gctcctggca ttgctggtgc tcctggcttc cctgggccac ggggccctcc 1500
tggccctcaa ggtgcaactg gtcctctggg cccgaaaggt cagacgggtg aacctggtat 1560
tgctggcttc aaaggtgaac aaggccccaa gggagaacct ggccctgctg gcccccaggg 1620
agcccctgga cccgctggtg aagaaggcaa gagaggtgcc cgtggagagc ctggtggcgt 1680
tgggcccatc ggtccccctg gagaaagagg tgctcccggc aaccgcggtt tcccaggtca 1740
agatggtctg gcaggtccca agggagcccc tggagagcga gggcccagtg gtcttgctgg 1800
ccccaaggga gccaacggtg accctggccg tcctggagaa cctggccttc ctggagcccg 1860
gggtctcact ggccgccctg gtgatgctgg tcctcaaggc aaagttggcc cttctggagc 1920
ccctggtgaa gatggtcgtc ctggacctcc aggtcctcag ggggctcgtg ggcagcctgg 1980
tgtcatgggt ttccctggcc ccaaaggtgc caacggtgag cctggcaaag ctggtgagaa 2040
gggactgcct ggtgctcctg gtctgagggg tcttcctggc aaagatggtg agacaggtgc 2100
tgcaggaccc cctggccctg ctggacctgc tggtgaacga ggcgagcagg gtgctcctgg 2160
gccatctggg ttccagggac ttcctggccc tcctggtccc ccaggtgaag gtggaaaacc 2220
aggtgaccag ggtgttcccg gtgaagctgg agcccctggc ctcgtgggtc ccaggggtga 2280
acgaggtttc ccaggtgaac gtggctctcc cggtgcccag ggcctccagg gtccccgtgg 2340
cctccccggc actcctggca ctgatggtcc caaaggtgca tctggcccag caggcccccc 2400
tggggctcag ggccctccag gtcttcaggg aatgcctggc gagaggggag cagctggtat 2460
cgctgggccc aaaggcgaca ggggtgacgt tggtgagaaa ggccctgagg gagcccctgg 2520
aaaggatggt ggacgaggcc tgacaggtcc cattggcccc cctggcccag ctggtgctaa 2580
tggcgagaag ggagaagttg gacctcctgg tcctgcagga agtgctggtg ctcgtggcgc 2640
tccgggtgaa cgtggagaga ctgggccccc cggaccagcg ggatttgctg ggcctcctgg 2700
tgctgatggc cagcctgggg ccaagggtga gcaaggagag gccggccaga aaggcgatgc 2760
tggtgcccct ggtcctcagg gcccctctgg agcacctggg cctcagggtc ctactggagt 2820
gactggtcct aaaggagccc gaggtgccca aggccccccg ggagccactg gattccctgg 2880
agctgctggc cgcgttggac ccccaggctc caatggcaac cctggacccc ctggtccccc 2940
tggtccttct ggaaaagatg gtcccaaagg tgctcgagga gacagcggcc cccctggccg 3000
agctggtgaa cccggcctcc aaggtcctgc tggaccccct ggcgagaagg gagagcctgg 3060
agatgacggt ccctctggtg ccgaaggtcc accaggtccc cagggtctgg ctggtcagag 3120
aggcatcgtc ggtctgcctg ggcaacgtgg tgagagagga ttccctggct tgcctggccc 3180
gtcgggtgag cccggcaagc agggtgctcc tggagcatct ggagacagag gtcctcctgg 3240
ccccgtgggt cctcctggcc tgacgggtcc tgcaggtgaa cctggacgag agggaagccc 3300
cggtgctgat ggcccccctg gcagagatgg cgctgctgga gtcaagggtg atcgtggtga 3360
gactggtgct gtgggagctc ctggagcccc tgggccccct ggctcccctg gccccgctgg 3420
tccaactggc aagcaaggag acagaggaga agctggtgca caaggcccca tgggaccctc 3480
aggaccagct ggagcccggg gaatccaggg tcctcaaggc cccagaggtg acaaaggaga 3540
ggctggagag cctggcgaga gaggcctgaa gggacaccgt ggcttcactg gtctgcaggg 3600
tctgcccggc cctcctggtc cttctggaga ccaaggtgct tctggtcctg ctggtccttc 3660
tggccctaga ggtcctcctg gccccgtcgg tccctctggc aaagatggtg ctaatggaat 3720
ccctggcccc attgggcctc ctggtccccg tggacgatca ggcgaaaccg gccctgctgg 3780
tcctcctgga aatcctggac cccctggtcc tccaggtccc cctggccctg gcatcgacat 3840
gtccgccttt gctggcttag gcccgagaga gaagggcccc gaccccctgc agtacatgcg 3900
ggccgaccag gcagccggtg gcctgagaca gcatgacgcc gaggtggatg ccacactcaa 3960
gtccctcaac aaccagattg agagcatccg cagccccgag ggctcccgca agaaccctgc 4020
tcgcacctgc agagacctga aactctgcca ccctgagtgg aagagtggag actactggat 4080
tgaccccaac caaggctgca ccttggacgc catgaaggtt ttctgcaaca tggagactgg 4140
cgagacttgc gtctacccca atccagcaaa cgttcccaag aagaactggt ggagcagcaa 4200
gagcaaggag aagaaacaca tctggtttgg agaaaccatc aatggtggct tccatttcag 4260
ctatggagat gacaatctgg ctcccaacac tgccaacgtc cagatgacct tcctacgcct 4320
gctgtccacg gaaggctccc agaacatcac ctaccactgc aagaacagca ttgcctatct 4380
ggacgaagca gctggcaacc tcaagaaggc cctgctcatc cagggctcca atgacgtgga 4440
gatccgggca gagggcaata gcaggttcac gtacactgcc ctgaaggatg gctgcacgaa 4500
acataccggt aagtggggca agactgttat cgagtaccgg tcacagaaga cctcacgcct 4560
ccccatcatt gacattgcac ccatggacat aggagggccc gagcaggaat tcggtgtgga 4620
catagggccg gtctgcttct tgtaaaaacc tgaacccaga aacaacacaa tccgttgcaa 4680
acccaaagga cccaagtact ttccaatctc agtcactcta ggactctgca ctgaatggct 4740
gacctgacct gatgtccatt catcccaccc tctcacagtt cggacttttc tcccctctct 4800
ttctaagaga cctgaactgg gcagactgca aaataaaatc tcggtgttct atttatttat 4860
tgtcttcctg taagaccttc gggtcaaggc agaggcagga aactaactgg tgtgagtcaa 4920
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caggaactgt gtgtgtccta cacaatggtg ctattctgtg tcaaacacct ctgtattttt 5040
taaaacatca attgatatta aaaatgaaaa gattattgga aagtaca 5087
<210> 2
<211> 1487
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ile Arg Leu Gly Ala Pro Gln Thr Leu Val Leu Leu Thr Leu Leu
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Val Ala Ala Val Leu Arg Cys Gln Gly Gln Asp Val Gln Glu Ala Gly
20 25 30
Ser Cys Val Gln Asp Gly Gln Arg Tyr Asn Asp Lys Asp Val Trp Lys
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Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Thr Gly Thr Val Leu Cys
50 55 60
Asp Asp Ile Ile Cys Glu Asp Val Lys Asp Cys Leu Ser Pro Glu Ile
65 70 75 80
Pro Phe Gly Glu Cys Cys Pro Ile Cys Pro Thr Asp Leu Ala Thr Ala
85 90 95
Ser Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ile
100 105 110
Lys Asp Ile Val Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala
115 120 125
Gly Glu Gln Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Asp Lys Gly Glu Lys Gly
130 135 140
Ala Pro Gly Pro Arg Gly Arg Asp Gly Glu Pro Gly Thr Pro Gly Asn
145 150 155 160
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly
165 170 175
Gly Asn Phe Ala Ala Gln Met Ala Gly Gly Phe Asp Glu Lys Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Gln Leu Gly Val Met Gln Gly Pro Met Gly Pro Met Gly Pro
195 200 205
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210 215 220
Gly Asn Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Val Ser Gly Pro Met Gly
225 230 235 240
Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Pro Gly Asp Asp Gly Glu
245 250 255
Ala Gly Lys Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln
260 265 270
Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly
275 280 285
His Arg Gly Tyr Pro Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Ala
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Pro Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ser Pro
305 310 315 320
Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Thr Gly
325 330 335
Pro Ala Gly Ala Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Gln Pro Gly Pro
340 345 350
Ala Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Gly Pro Gly Phe Pro
355 360 365
Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly
370 375 380
Pro Glu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Gly Glu Pro Gly Thr Pro Gly Ser
385 390 395 400
Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ser Gly Asn Pro Gly Thr Asp Gly Ile Pro
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Gly Ala Lys Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly
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Phe Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Thr Gly Pro
435 440 445
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Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly
465 470 475 480
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu
485 490 495
Pro Gly Gly Val Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro
500 505 510
Gly Asn Arg Gly Phe Pro Gly Gln Asp Gly Leu Ala Gly Pro Lys Gly
515 520 525
Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ser Gly Leu Ala Gly Pro Lys Gly Ala
530 535 540
Asn Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Arg
545 550 555 560
Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Asp Ala Gly Pro Gln Gly Lys Val Gly
565 570 575
Pro Ser Gly Ala Pro Gly Glu Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro
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Gln Gly Ala Arg Gly Gln Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys
595 600 605
Gly Ala Asn Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Lys Gly Leu Pro Gly
610 615 620
Ala Pro Gly Leu Arg Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Glu Thr Gly Ala
625 630 635 640
Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln
645 650 655
Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly
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Pro Pro Gly Glu Gly Gly Lys Pro Gly Asp Gln Gly Val Pro Gly Glu
675 680 685
Ala Gly Ala Pro Gly Leu Val Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro
690 695 700
Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Pro Arg Gly
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Leu Pro Gly Thr Pro Gly Thr Asp Gly Pro Lys Gly Ala Ser Gly Pro
725 730 735
Ala Gly Pro Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro
740 745 750
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Ala Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly
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Asp Val Gly Glu Lys Gly Pro Glu Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Gly
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Thr Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Thr
885 890 895
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900 905 910
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1010 1015 1020
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Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Lys Gln Gly Asp Arg
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Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly
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Ala Arg Gly Ile Gln Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu
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Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Gly Leu Lys Gly His Arg Gly Phe Thr
1125 1130 1135
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Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro
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Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Ser Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
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Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1205 1210 1215
Gly Ile Asp Met Ser Ala Phe Ala Gly Leu Gly Pro Arg Glu Lys Gly
1220 1225 1230
Pro Asp Pro Leu Gln Tyr Met Arg Ala Asp Gln Ala Ala Gly Gly Leu
1235 1240 1245
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Gln Ile Glu Ser Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala
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Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Leu Cys His Pro Glu Trp Lys Ser Gly
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggttttct gcaacatgga g 21