一种利用超声波提高细菌胞外多糖产量的方法
阅读说明：本技术 一种利用超声波提高细菌胞外多糖产量的方法 (Method for improving yield of extracellular polysaccharide of bacteria by using ultrasonic waves ) 是由 周文文 竺莹莹 钱超 于 2020-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用超声波处理提高细菌胞外多糖产量的方法,以多粘类芽孢杆菌PYQ1为对象,将超声波技术引入微生物发酵过程中。本发明通过研究不同生长阶段超声处理、不同超声时间和不同超声功率对产糖菌生物量和多糖产量的影响,证明使用低频超声波辅助多粘类芽孢杆菌PYQ1多糖发酵具有可行性,同时验证得到最适合多粘类芽孢杆菌PYQ1发酵的超声参数,可以有效提高其胞外多糖产量。本发明公开的超声波方法可应用于相关多糖工业生产中,具有节约生产成本,缩短生产周期,提高经济效益等优势,有良好的市场应用前景。(The invention discloses a method for improving the yield of extracellular polysaccharide of bacteria by utilizing ultrasonic treatment, which takes Paenibacillus polymyxa PYQ1 as an object and introduces an ultrasonic technology into a microbial fermentation process. According to the invention, the influence of ultrasonic treatment at different growth stages, different ultrasonic time and different ultrasonic power on the biomass of the sugar-producing bacteria and the polysaccharide yield is researched, so that the low-frequency ultrasonic wave assisted fermentation of the polysaccharide of the paenibacillus polymyxa PYQ1 is proved to have feasibility, and meanwhile, the ultrasonic parameters most suitable for fermentation of the paenibacillus polymyxa PYQ1 are verified, so that the extracellular polysaccharide yield can be effectively improved. The ultrasonic method disclosed by the invention can be applied to the industrial production of related polysaccharides, has the advantages of saving the production cost, shortening the production period, improving the economic benefit and the like, and has good market application prospect.)
技术领域
本发明属于微生物技术及多糖的生产技术领域，特别涉及一种以利用超声波技术提高细菌胞外多糖的方法。
背景技术
超声波是一种频率超过20000赫兹，高于人类听觉阈的声波，当超声波在介质中传播时，通过与介质的相互作用产生一系列物理和化学的效应，其中最主要的是机械效应与空化作用。超声波最早出现在生物领域主要是用于细胞的破碎，但随着学者们在生命科学方面的研究不断深入，近年来，超声波这种新型技术在国内外已广泛用于食品和生物加工领域。
在微生物发酵过程中，借助超声波刺激可以提高微生物细胞膜表面的流体压力，从而增加细胞膜的通透性，加快代谢产物的分泌速率，从而有效缩短发酵时间和提高有益代谢物的产量。在传统微生物发酵中，高功率超声已用于破坏微生物细胞以释放细胞内物质，并被认为是杀微生物的一种手段，而现有研究表明，低频率超声波对某些微生物细胞无毁灭性的刺激，有效提高细菌细胞膜的通透性以及细胞新陈代谢的速度，当应用于微生物液态发酵中，更有助于发酵效率及发酵产物产率的提高。Yadav等研究发现，使用低强度(25kHz)超声辅助枯草芽孢杆菌ABDR01发酵，使果胶酶、纤维素酶和木聚糖酶的酶活性较未超声组分别提高了约38.15％、53.77％和24.59％，同时文章中指出，相比于低频率超声波，较高频率(40kHz)超声不利于产生空化气泡，反而会导致细菌细胞破裂，不利于提高酶活力[1]；罗登林等也得到了相似的结论，实验发现40kHz和59kHz的超声处理抑制了黑曲霉产菊粉酶的活力，频率越高，抑制效果越明显[2]。Sulaiman等在Kluyveromyces marxianus酵母发酵过程中施加频率为20kHz，间歇比为20％的超声波，最终发酵得到的乙醇是对照组的3.5倍，且酵母的生物量和细胞活力均得到了一定提升[3]。
低成本、易处理、效果显著的超声波辅助微生物发酵，已有提高酒精、生物酶、乳糖等产量的研究，但研究对象主要集中在酵母、霉菌、藻类等，且在对超声条件和培养基进行大量优化的前提下，仍有大量属于以上三类的微生物的发酵过程表现出对超声波不敏感，或超声波表现为对发酵过程存在抑制作用，或超声在低频下，仍表现出对微生物细胞具有明显的杀伤破坏作用。因此，不同种微生物的超声波处理方式、处理强度、处理效果和机制等均存在差异。尚未有利用低频超声波处理提高多粘类芽孢杆菌胞外多糖产量的研究，亟待研究者们的深入研究，将超声波技术更好的应用于产糖菌的发酵生产之中。
参考文献：
[1]Yadav A,Ali AAM,Ingawale M,et al.Enhanced co-production ofpectinase,cellulase and xylanase enzymes from Bacillus subtilis ABDR01 uponultrasonic irradiation[J].Process Biochemistry,2020,92:197-201.
[2]罗登林,袁海丽,王斐,等.超声对黑曲霉产菊粉酶的影响[J].声学技术,2012,31:502-505.
[3]Sulaiman AZ,Ajit A,Yunus RM,et al.Ultrasound-assisted fermentationenhances bioethanol productivity[J].Biochemical Engineering Journal,2011,54:141-150.
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用超声波提高多粘类芽孢杆菌胞外多糖产量的方法，高效率生产获得应用前景广泛的胞外多糖，为今后多粘类芽孢杆菌多糖实际的生产应用起到参考借鉴作用。
本发明是通过以下技术方案实现的。
多粘类芽孢杆菌菌株，其保藏名称为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)PYQ1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16444，保藏日期为2018年9月10日。所述的多粘类芽孢杆菌菌株PYQ1在发明专利ZL201811216217.0中已经公布。
一种利用超声波提高细菌胞外多糖产量的方法，步骤如下：
(1)多粘类芽孢杆菌菌株在平板培养基上活化，然后将活化后的菌种接种在种子培养基中，30℃-35℃下摇瓶培养12h-24h，得到多粘类芽孢杆菌种子液；
(2)以体积百分比3％-10％接种量接种步骤(1)得到的种子液至发酵培养基中，在30℃-37℃、转速180rpm-250rpm的摇床中振荡培养2h-14h，接着对菌液进行超声波辐射处理(例如可采用超声波细胞粉碎机)。采用强度30W-150W和频率25kHz-50kHz的条件处理发酵培养基，超声周期为1.0-3.0s-ON和1.0-2.0s-OFF。超声探头放置在液面以下1厘米至2厘米距离的地方，以获得稳定的超声辐射强度，超声处理时间为15s-120s。处理后摇床中继续振荡培养至36h-48h。
作为本发明的优选，所述种子培养基各成分别为蔗糖20g-35g，酵母浸粉5g-10g，胰蛋白胨5g-10g，K2HP04 3g-5g，蒸馏水1000mL，115℃-121℃灭菌15min-20min。
作为本发明的优选，所述的发酵培养基各成分别为蔗糖40g-60g，酵母浸粉5g-8g，胰蛋白胨5g-8g，K2HP04 2g-5g，蒸馏水1000mL，115℃-121℃灭菌15min-20min。
发酵液可以采用如下方式进行多糖的提取：将发酵液离心以除去菌体得到上清液，上清液脱蛋白4-6次后，加入无水乙醇使多糖析出；析出的多糖复溶后透析除去小分子物质，之后冷冻干燥，即可得到多糖。上述过程中的透析步骤可以采用3500D透析袋，先流水透析24h，再用蒸馏水透析48h，并每隔8h换一次蒸馏水。需要说明的是，本发明在通过合适的超声手段提高胞外多糖产量的同时，并没有因此增加多糖提取难度和提取成本；通过采用上述提取方法仍能获得高纯度的获得胞外多糖。
本发明具备的有益效果是：
本发明创造性地以低频超声波辅助来提高多粘类芽孢杆菌胞外多糖产量，通过逐一优化单因素实验最终得到最适合多粘类芽孢杆菌胞外多糖生产的超声参数(超声处理生长阶段、处理时长和处理功率)，对超声波在微生物发酵过程中的作用有了更好的了解。证明使用低频超声波辅助芽孢杆菌多糖发酵具有可行性，适当强度的超声波处理一定时间，能很好的增强细胞膜的通透性和对于养分的吸收，从而有效的提高菌体的生物量和发酵产物得率，调节碳代谢流，抑制了杂质产生。本发明应用于相关细菌多糖工业生产中，具有节约生产成本，缩短生产周期，提高经济效益等优势。
附图说明
图1本发明利用超声对不同生长阶段P.polymyxa PYQ1生物量和多糖产量影响结果；
图2本发明采用的不同超声时间对P.polymyxa PYQ1生物量和多糖产量影响结果；
图3本发明采用的不同超声功率对P.polymyxa PYQ1生物量和多糖产量影响结果；
图4本发明最佳超声波参数下P.polymyxa PYQ1生长和发酵产糖效果验证；
图5超声波处理对不同芽孢杆菌菌株的胞外多糖产量的影响。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。
在多糖发酵之前，首先配置培养基，制备种子液。使用的培养基包括LB固体培养基、种子培养基和发酵培养基。
LB固体培养基：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min后倒平板。
种子培养基：蔗糖30g，酵母浸粉10g，胰蛋白胨5g，K2HP04 3g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。
发酵培养基：蔗糖50g，酵母浸粉5g，胰蛋白胨5g，K2HP04 3g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。
多粘类芽孢杆菌菌株在平板培养基上活化，然后将活化后的菌种接种在种子培养基中，30℃条件下摇瓶培养24h，得到多粘类芽孢杆菌种子液。
实施例1：超声波辅助发酵实验
在25mL发酵培养基(初始蔗糖添加量50g/L)中加入6％种子菌液，使用超声波细胞粉碎机对菌液进行超声波辐射处理。采用间歇(周期性超声辐照)的强度和频率25kHz的条件照射发酵培养基，超声周期为1.0s-ON和1.0s-OFF。超声探头放置在距离介质表面的1厘米距离的地方，以获得稳定的超声辐射强度，并且在所有实验中均保持28℃的温度。采用单因素法评价不同生长阶段超声、超声时间和超声功率三种处理对多粘类芽孢杆菌PYQ1发酵的影响。
菌体生物量的测定：按照已有文献方法，利用酶标仪测定菌悬液OD值。
胞外多糖含量的测定：利用苯酚-硫酸比色法对发酵液的含糖量进行测定。
1)不同生长阶段超声波处理
根据多粘类芽孢杆菌PYQ1的生长曲线，分别对生长至迟滞期前期(1h)、迟滞期后期(9h)、对数期前期(14h)、对数期中期(24h)和对数期后期(32h)的菌液进行功率为75W的超声波处理60s，设置两组平行。之后在28℃，180rpm的摇床里培养至36h，测定多糖含量和菌悬液OD值，得到图1所示结果。从图中可以看出不同生长阶段的菌体在超声处理后，其胞外多糖产量都有一定的提升，其中迟滞期后期的优化效果最佳，最终菌体生物量为2.56g/L，胞外多糖产量为5.23g/L，较未超声组提高23.98％。因此选取生长至迟滞期后期的发酵液进行后续实验。
2)不同时长超声波处理
选取生长至最佳的超声处理生长阶段的菌液，进行时间分别为15s、30s、45s、60s、75s、90s和120s的超声波处理，超声功率为75W，设置两组平行。处理后在28℃，180rpm的摇床里培养至36h，测定多糖含量和菌悬液OD值，所得结果如图2。由图2可以看出，当超声处理时间在15-60s的范围内，对于多粘类芽孢杆菌PYQ1的生长和发酵都有一定促进作用，促进作用呈现先上升后下降的趋势，45s的超声处理时间对多粘类芽孢杆菌PYQ1发酵效果最优，处理后胞外多糖最终产量为4.92g/L，相比于对照组提高19.31％。
3)不同强度超声波处理
选取生长至最佳的超声处理生长阶段的菌液，进行功率分别为30W、60W、90W、120W和150W的超声波处理60s，设置两组平行。处理后在28℃，180rpm的摇床里培养至36h，测定多糖含量和菌悬液OD值，所得结果如图3。从结果看，30W至150W的超声波对多粘类芽孢杆菌PYQ1的生长和胞外多糖合成均有不同程度的促进作用。当超声波功率增加时，多粘类芽孢杆菌的生物量和胞外多糖产量趋势基本为先升后降，其中超声功率为90W时胞外多糖产量最高，为5.34g/L，相较于未超声组提高26.79％。
4)超声波处理后培养基中总糖变化情况
本发明使用的发酵培养基的初始总糖浓度为61.1±1.4g/L，发酵结束培养基残糖浓度对照组为6.7±0.4g/L，使用超声(25kHz、90W、45s)处理组为6.5±0.9g/L，残糖量没有显著性差异。发酵过程体系总能量守恒，发酵结束后培养基残糖(剩余碳源)没有太多变化，但发酵合成胞外多糖的量增加了，细胞量也提高了(图3)，说明超声波处理后细胞内用于其他支路上的碳源代谢减少，合成杂质的量也随之变少。
实施例2：最佳超声参数下超声波处理效果的验证
根据实施例1的结果，选取蔗糖添加量170g/L(其他发酵培养基条件不变)的发酵培养基进行发酵生产，并采用最佳的超声波条件辅助发酵，对照组不进行超声处理。之后在28℃，180rpm的摇床里培养至36h，测定多糖含量和菌悬液OD值，实验结果如图4。经过频率25kHz，功率90W的超声处理45s后，多粘类芽孢杆菌PYQ1的胞外多糖产量由11.20g/L提升至14.99g/L，提高率33.79％，同时菌体的生物量也有了显著的增加，为提高菌株PYQ1发酵生产能力开辟了一条新途径。
实施例3：最佳超声参数下超声波处理不同芽孢杆菌菌株的产糖效果
根据实施例1的结果，选取蔗糖添加量170g/L(其他发酵培养基条件不变)进行发酵生产，并采用最佳的超声波条件辅助发酵，之后在28℃，180rpm的摇床里培养至36h。选取芽孢杆菌菌株Paenibacillus PYQ1、Paenibacillus HT16、Bacillus PYQ12、Bacillus 50-3作为出发菌株，测试超声处理与正常发酵情况的产糖量。测定的多糖含量实验结果如图5。经过频率25kHz，功率90W的超声处理45s后，菌株PYQ1的胞外多糖产量升至14.99g/L，相对于未处理组提高33.79％；超声后，菌株HT16和PYQ12的胞外多糖产量相对于未处理组，没有显著变化；菌株50-3的胞外多糖产量相对于未处理组降低了80.63％。由此可见，不同芽孢杆菌菌株对超声波处理的耐受性存在差异。相同的超声波处理条件下，菌株可能会产生不同的应激反应，对胞外多糖产量会产生不同影响和效果。
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