一种固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法
阅读说明：本技术 一种固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法 (Method for producing trehalose by catalyzing maltose through immobilized trehalose synthase ) 是由 于令君 郝云飞 李莉 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法,本发明将海藻糖合酶通过双重吸附-交联法固定于介孔分子筛SBA-15上,用于催化麦芽糖产海藻糖,固定化方法简单、时间短、无污染、条件温和,固定化后的海藻糖合酶pH稳定性和热稳定性明显改善,且具有良好的酶学特性和可重复操作性,有利于酶的使用和储存,同时海藻糖合酶固定化时使用粗酶液,无需纯化,使用10批次后,仍能保持初始酶活的70％以上,节省用酶成本,具有十分可观的工业化应用前景。(The invention discloses a method for producing trehalose by catalyzing maltose through immobilized trehalose synthase, which is characterized in that the trehalose synthase is immobilized on mesoporous molecular sieve SBA-15 by a double adsorption-crosslinking method and is used for catalyzing the maltose to produce trehalose, the immobilization method is simple, the time is short, no pollution is caused, the condition is mild, the pH stability and the thermal stability of the immobilized trehalose synthase are obviously improved, the trehalose synthase has good enzymology characteristic and repeatable operability, the use and the storage of enzyme are facilitated, meanwhile, crude enzyme liquid is used during the immobilization of the trehalose synthase, the purification is not required, more than 70 percent of the initial enzyme activity can be still kept after 10 batches of the trehalose synthase are used, the enzyme cost is saved, and the trehalose synthase has very great industrial application prospect.)
技术领域
本发明属于酶固定化技术领域，具体涉及以介孔分子筛SBA-15作为载体固定化海藻糖合酶，用于催化麦芽糖产海藻糖的方法。
背景技术
海藻糖是由两个吡喃型葡萄糖单体通过α，α-1，-1糖苷键连结而成的二糖，是生物体在环境胁迫的条件下产生的一种应激代谢物。其在逆境下对生物膜、蛋白质及核酸具有保护作用。海藻糖合酶能够以廉价的麦芽糖为底物一步生成海藻糖，反应流程短，易调节，也无需与磷酸盐共存，且作用底物麦芽糖价格低廉。游离状态的海藻糖合酶稳定性差，易失活，不能重复利用，且反应后也不易与产品分离，但通过结合固定化技术可以有效解决以上不足。
介孔分子筛是一种孔径介于微孔与大孔之间的具有巨大表面积和三维孔道结构的新型材料。它具有其它多孔材料所不具有的优异特性：高度有序的孔道结构，孔径单一分布且孔径尺寸可在较宽范围变化，介孔形状多样且孔壁组成和性质可调控，通过优化合成条件可得到高热稳定性和水热稳定性。壳聚糖本身也是一种多孔的网状结构，因此可将吸附了蛋白质的SBA-15再与壳聚糖结合，使固定化颗粒再次吸附在壳聚糖的网状结构中，达到双重吸附固定化酶。但是仅靠吸附作用固定化酶蛋白，酶分子容易脱落，因此可以加入双功能基团试剂进一步交联，由于壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂很容易与酶发生间接共价结合。
本发明将海藻糖合酶通过双重吸附-交联法固定于介孔分子筛SBA-15上用于催化麦芽糖产海藻糖，固定化方法简单、时间短、无污染、条件温和，SBA-15分子筛的孔道高度有序、表面性质均一且具有可控制性，能增强酶的稳定性和活性，这使得酶的固定化过程可预测，固定化后的海藻糖合酶pH稳定性和热稳定性明显改善，且具有良好的酶学特性和可重复操作性，有利于酶的使用和储存，同时海藻糖合酶固定化时使用粗酶液，无需纯化，具有十分可观的工业化应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
(1)游离酶液制备
将产酶菌种接种到30mL的TB培养基中，37℃、200r/min摇瓶至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，发酵20h，所得发酵液离心收集菌体，用磷酸缓冲液清洗后重悬，超声破碎离心取上清，即得海藻糖合酶酶液；
(2)吸附
将0.1g介孔分子筛载体悬浮于5ml磷酸缓冲液制备的海藻糖合酶酶液中，于4℃下振荡一定时间。
(3)交联
取1.0％-2.0％质量分数的壳聚糖的1％冰醋酸溶液，加入到步骤(2)所得固定化酶体系中，再加入同体积0.5％-2.0％质量分数的戊二醛水溶液，震荡一定时间后取出，离心5-10min除去附着的游离酶，转移上清液，用磷酸缓冲液洗涤沉淀，再次离心，用上述磷酸缓冲液重复洗涤，即得固定化海藻糖合酶，低温干燥后于4℃下保存。
(4)固定化酶反应
取步骤(3)所得的固定化海藻糖合酶1g，与9ml 0.03mol/L磷酸缓冲液混合，加入20ml 10％的麦芽糖溶液，置于25℃水浴中进行反应，在5～48h内定时取样，沸水煮沸10min终止反应，用HPLC法测定海藻糖的含量。
进一步优选的，所述步骤(1)产酶菌种选自玫瑰链霉菌或节杆菌属，于25℃、200r/min条件下发酵，发酵液800r/min离心5min收集菌体。
进一步优选的，步骤(2)所述的介孔分子筛为SBA-15，其孔径大小为6-11nm。
进一步优选的，所述步骤(2)采用回旋振荡器或恒温振荡器进行振荡。
进一步优选的，所述步骤(3)中磷酸缓冲液的pH为7.2。
进一步优选的，所述步骤(3)高效液相色谱仪选用NH2柱(5μm×250mm×4.6mm)，流动相为乙腈：水＝75：25，流速1.0ml/min，进样量5μl，柱温为室温，反应后的载体用缓冲液清洗后可再次循环使用。
进一步优选的，海藻糖合酶的最佳固定化条件为：pH6.0、给酶量62.5mg/g、固定化12h。
进一步优选的，采用最佳固定化条件得到的固定化海藻糖合酶使用10批次后可保持在初始酶活的70％以上。
采用本发明固定化海藻糖合酶的方法，具有的有益效果如下：
(1)在进行海藻糖合酶固定化时可直接使用发酵制得的粗酶液，无需纯化，节省成本同时提高了固定化效率，简化了生产流程。
(2)将游离酶固定于介孔分子筛SBA-15上，因SBA-15分子筛的孔道高度有序、表面性质均一且具有可控制性，能增强酶的稳定性和活性，这使得酶的固定化过程可预测。
(3)将吸附了蛋白质的SBA-15再与壳聚糖结合，使固定化颗粒再次吸附在壳聚糖的网状结构中，达到双重吸附固定化酶，并加入双功能基团试剂进一步交联。
本发明将海藻糖合酶通过双重吸附-交联法固定于介孔分子筛SBA-15上用于催化麦芽糖产海藻糖，固定化方法简单、时间短、无污染、条件温和，固定化后的海藻糖合酶pH稳定性和热稳定性明显改善，且具有良好的酶学特性和可重复操作性，有利于酶的使用和储存，同时海藻糖合酶固定化时使用粗酶液，无需纯化，使用10批次后，仍能保持初始酶活的70％以上，节省用酶成本，具有十分可观的工业化应用前景。
附图说明
图1为固定化时间对固定化酶酶活的影响
图2为pH对固定化效果的影响
图3为给酶量对固定化酶酶活的影响
图4为固定化酶与游离酶最适反应pH值
图5为固定化酶与游离酶pH值稳定性
图6为固定化酶与游离酶最适反应温度
图7为固定化酶与游离酶的热稳定性对比
图8为固定化酶的操作稳定性
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例，本发明还可通过不同的实施方式加以实现或运用，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
(1)游离酶液制备
将产酶菌种接种到30mL的TB培养基中，37℃、200r/min摇瓶至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，发酵20h，所得发酵液离心收集菌体，用磷酸缓冲液清洗后重悬，超声破碎离心取上清，即得海藻糖合酶酶液；
(2)吸附
将0.1g介孔分子筛载体悬浮于5ml磷酸缓冲液制备的海藻糖合酶酶液中，于4℃下振荡一定时间。
(3)交联
取1.0％-2.0％质量分数的壳聚糖的1％冰醋酸溶液，加入到步骤(2)所得固定化酶体系中，再加入同体积0.5％-2.0％质量分数的戊二醛水溶液，震荡一定时间后取出，离心5-10min除去附着的游离酶，转移上清液，用磷酸缓冲液洗涤沉淀，再次离心，用上述磷酸缓冲液重复洗涤，即得固定化海藻糖合酶，低温干燥后于4℃下保存。
(4)固定化酶反应
取步骤(3)所得的固定化海藻糖合酶1g，与9ml 0.03mol/L磷酸缓冲液混合，加入20ml 10％的麦芽糖溶液，置于25℃水浴中进行反应，在5～48h内定时取样，沸水煮沸10min终止反应，用HPLC法测定海藻糖的含量。
酶活力单位定义：反应体系中每小时产生1μg海藻糖所需要的酶量为1个酶活力单位。
实施例1
固定化条件优化
依次考察不同的固定化时间、不同pH的PBS缓冲溶液、以及不同给酶量条件下固定化酶的酶活，根据其对固定化效果的影响，选择最佳固定化pH、吸附时间、给酶量。
(1)固定化时间对固定化酶酶活的影响
在固定化时间分别为2、4、8、12、16、20h时检测固定化海藻糖合酶的相对酶活，考察固定化时间对固定化酶活性的影响，结果见图1。
如图1所示，随着海藻糖合酶在SBA-15载体上固定化时间的增加，相对酶活基本呈线性上升趋势，当固定化时间达到12h时，相对酶活达到最大，继续延长固定化时间相对酶活不再升高，由于吸附量已达到饱和及酶本身随时间延长活力有所损失导致略有下降，因此选择最佳固定化时间为12h。
(2)pH对固定化酶酶活的影响
在不同pH的PBS缓冲溶液(pH分别为2、3、4、5、6、7)中制备固定化海藻糖合酶，考察pH对固定化酶酶活的影响，结果见图2。
如图2所示，pH在2～6之间时相对酶活较高，pH超过6，相对酶活则急剧下降。使用非离子表面活性剂合成的介材料SBA-15，pH对其固定化作用影响并不显著，对于海藻糖合酶在SBA-15上的固定化，pH＝6时所得固定化酶相对活力最大，因此选择最佳pH为6.0。
(3)给酶量对固定化酶酶活的影响
纯海藻糖合酶液用pH为6.0的PBS缓冲溶液稀释不同倍数后，分别在SBA-15上固定12h，测得不同给酶量下的固定化酶活，给酶量为纯酶与载体的质量比，考察给酶量对固定化酶酶活的影响，结果见图3。
如图3所示，当给酶量为62.5mg/g时，固定化酶相对酶活最大，当给酶量过多时反而使固定化酶活力下降，这是因为过多的酶分子负载于分子筛孔道中，从而限制了物质在孔道内的扩散传输，因此选择最佳给酶量为62.5mg/g。
得到最佳固定化条件为；pH6.0、给酶量为62.5mg/g的条件下固定化12h。
实施例2
固定化酶的理化性质
在最佳固定化条件下制备固定化酶，与相同偶联蛋白含量的游离酶作比较，考察其理化性质。
(1)固定化酶的最适反应pH值及pH值稳定性。
如图4所示，游离酶的最适pH为7.0，固定化海藻糖合酶的最适pH为7.5，与游离酶相比向右侧偏移，同时，从图中可看出固定化酶最适pH的稳定性范围比游离酶更宽。
如图5所示，游离酶的pH稳定范围较窄，在6.6～7.4之间pH值过高或过低，对游离酶活力的影响都很大，但将固定化酶在pH为2～7的缓冲液中放置1h后，测定剩余酶的活性达到最高活性的45％～90％之间，仍然较高，这说明固定化海藻糖合酶的放置受pH值影响并不显著，且pH值范围较宽，说明固定化海藻糖合酶具有较好的pH值稳定性。
(3)固定化酶的最适反应温度及热稳定性。
由图6和7可知，游离酶最适作用温度为25～55℃，最适反应温度45℃。其在25～45℃时可以稳定保存，高于45℃时，酶活力损失较多，当温度高于55℃后，酶活几乎全部丧失；固定化酶的最适温度是35℃，高于35℃时，固定化酶活力损失不多，能达最高酶活的60％以上，酶的变性通常是三级结构改变，高温下某些不稳定性集团氧化活蛋白质的其他物理变化的结果，在一定条件下，固定化作用可通过增加分子的刚性来增加酶的热稳定性。
(4)固定化酶的操作稳定性
如图8所示，固定化酶在最适反应温度35℃条件下随着使用次数的增多，酶活逐渐下降，使用4次后，酶活损失相对较大，剩余酶活约为原来的75％，使用10次后，剩余酶活差异不大，仍保持初始酶活的70％以上，因此固定化海藻糖合酶具有良好的操作稳定性，可重复使用。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明所举的较佳实施例，不能以此来限定本发明的权利范围，本领域的技术人员在此基础上所作的修改和等同变化，仍在本发明的保护范围之内。
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