一种治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂、组合物及应用
阅读说明：本技术 一种治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂、组合物及应用 (Nanometer medicinal preparation for treating multidrug resistant tumor, and its preparation method and application ) 是由 陈聪慧 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂、组合物及应用。肿瘤耐药是目前临床化疗失败的主要原因,为了实现耐药肿瘤逆转效果,本发明提供了一种用于耐药肿瘤的纳米制剂及所述纳米制剂的制备方法。其中,所述纳米制剂为紫杉醇、白藜芦醇的药物组合,通过pH敏感脂质材料、靶向材料构建一种仿生结构纳米制剂。经验证,所述纳米制剂具有良好的包载效果及理化性质,体外释放表现出良好的pH响应性。经动物实验验证,所述纳米制剂能够有效抑制肿瘤发展过程,应用于动物体安全性更高,有望应用于临床治疗,克服化药治疗的不足。(The invention relates to a nano preparation for treating multidrug resistant tumor, a composition and application. Tumor resistance is the main reason of failure of current clinical chemotherapy, and in order to realize the effect of reversing drug-resistant tumors, the invention provides a nano preparation for drug-resistant tumors and a preparation method of the nano preparation. The nanometer preparation is a medicine combination of paclitaxel and resveratrol, and the nanometer preparation with the bionic structure is constructed by a pH sensitive lipid material and a targeting material. The nano preparation has good entrapment effect and physicochemical property, and the in vitro release shows good pH responsiveness. Animal experiments prove that the nano preparation can effectively inhibit the tumor development process, is higher in safety when being applied to animals, is expected to be applied to clinical treatment, and overcomes the defects of chemical drug therapy.)
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物
技术领域
，具体涉及一种治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂及制备方法、包含所述纳米制剂的组合物，以及所述纳米制剂、组合物在制备抗肿瘤产品中的应用。背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。癌症已经成为严重威胁人类健康的主要病症之一，我国肿瘤引起的死亡率较高，且发病率呈上升趋势。肿瘤多药耐药(Multidrug resistance,MDR)是临床上肿瘤化学治疗的主要障碍，也是化疗失败的主要原因之一。因此，寻找安全有效的MDR逆转策略已成为目前亟待解决的问题。
紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是从红豆杉属植物紫杉的树皮中提取开发得到的天然抗癌药物，分子式为C47H51NO14，分子量853.92。抗癌机制独特，能够促进微管蛋白聚合，进而抑制微管蛋白解聚，致使快速分裂的肿瘤细胞终止于有丝分裂阶段而死亡，具有良好的抗肿瘤活性。紫杉醇作为广谱抗肿瘤药物，目前临床上主要被应用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌及前列腺癌等的治疗。但在临床应用中极易导致肿瘤产生耐药性(MDR)，进而导致紫杉醇的临床应用价值大大降低。
白藜芦醇(Resveratrol,Rev)化学名称为3,4’,5-三羟基苯二烯，是一种广泛存在于葡萄和多种传统中药(如决明、虎杖等)中的多酚类活性单体。研究结果表明来自于天然植物的白藜芦醇具有显著的逆转多药耐药的作用：(1)抑制膜转运蛋白介导的药物外排作用；(2)诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、上皮癌、黑色素瘤、胶质细胞瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌细胞等；(3)抑制转录因子调控蛋白NF-κB(nuclearfactor kappaB)的活性。白藜芦醇作为一种天然植物药物成分，其对肿瘤多药耐药细胞的抑制作用已得到肯定，并且最近体外研究结果发现白藜芦醇能有效抑制肿瘤，在癌症发生的起始、增进、扩展三个主要阶段，都能够起到抑制作用，因此通过联合应用中药成分紫杉醇及白藜芦醇提高化疗药物的疗效同时达到逆转肿瘤多药耐药效果。
发明内容
紫杉醇作为一种治疗效果理想的抗肿瘤药物，美中不足在于该药物的副反应较为严重。为了提高紫杉醇水溶性、降低毒副作用，改善已经造成的耐药情形，本发明目的在于构建一种药物递送系统，有效传递逆转耐药活性成分紫杉醇和白藜芦醇至肿瘤部位。
为了实现上述技术目的，本发明提供以下技术方案：
本发明主要技术贡献在于提供了一种治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂，所述纳米制剂由药物、脂质材料及靶向材料构成；其中，药物与脂质材料构成载药脂质核心，所述载药脂质核心和靶向材料构成仿生糖-脂或仿生脂-蛋白结构；
所述药物为紫杉醇及白藜芦醇；
所述脂质材料为pH敏感材料，其原料至少包括二油酰磷脂酰乙醇胺；
所述靶向材料选自蛋白、蛋白偶联物、多肽或糖。
本发明设计得到一种能够实现耐药肿瘤逆转效果的治疗药物，抗肿瘤中药活性成分紫杉醇具有良好的抗肿瘤活性，但在临床应用中极易产生多药耐药性，并且紫杉醇的副作用明显，包括胃肠不适、关节疼痛及骨髓抑制等，化疗后患者的身体状况消耗较为严重，通常会出现明显的消瘦。白藜芦醇是来自于天然药物的一种多酚类活性单体，经证实具有显著的逆转多药耐药的作用，因此通过联合应用中药成分紫杉醇及白藜芦醇可以提高化疗药物的疗效同时达到逆转效果。
经研究证实，肿瘤组织微环境的pH大约在6.5，与正常机体组织存在差异，并且肿瘤细胞表面的糖蛋白分布更加密集。基于上述结论，本发明设计通过纳米制剂外壳实现核心药物的靶向递送，载药脂质核心和靶向材料构成仿生糖-脂或仿生脂-蛋白结构，所述药物活性成分为紫杉醇和白藜芦醇。具体通过构建pH敏感型的载药脂质核心以及构建一种仿生结构提高所述药物递送系统靶向肿瘤细胞的效果。其中，所述的pH敏感脂质外壳材料在酸性内涵体或溶酶体环境下，随着pH不断下降而发生结构变化，最终导致处于不稳定结构的磷脂膜驱使载体脂质膜与相邻脂质膜的互动从而形成新的稳定结构，这种结构的变化最终表现为脂质膜的破裂或与其他脂质膜的融合，从而将包封的药物有效递送至胞浆，发挥药效，杀死耐药肿瘤细胞。
本发明上述纳米制剂用于紫杉醇和白藜芦醇的多药耐药肿瘤靶向及肿瘤细胞内的有效递送，杀死多药耐药肿瘤细胞，发挥抗多药耐药肿瘤作用。其次，本发明还提供一种仿生结构制备方法，目前脂蛋白结构及糖脂结构纳米载体的制备往往加入阳离子材料，而阳离子材料的加入会对细胞具有毒性，使纳米载体安全性降低，同时会使制剂药物包封率下降，本发明通过仿生糖-脂结构、脂-蛋白结构仿生制备方法制备，去掉传统阳离子材料的加入，提高制剂安全性及包封率。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明设计的药物递送系统采用pH敏感及仿生结构双重靶向作用，提供药物递送效率，所述递送系统的制备简便易行，可方便的在工业进行扩大化生产。
2、本发明经研究发现，采用二油酰磷脂酰乙醇胺及胆固醇半琥珀酸酯作为脂质原料进行制备的纳米脂质结构对紫杉醇及白藜芦醇具有非常好的包封效果，显著超过其他脂质材料对上述药物组合的包封效率。本发明中纳米制剂的包封率可以达到93％以上，这对于节约工业生产成本具有重要的意义。
3、针对紫杉醇副反应较为严重的技术问题，本发明研究发现，上述脂质材料包封后能够显著改善纳米制剂的生物相容性，在动物模型实验中，本发明中所述纳米制剂包封紫杉醇及白藜芦醇相比其他紫杉醇及白藜芦醇的脂质体制剂具有更好的生物相容性，小鼠服药后精神状态更好，生活质量更高。
4、经验证，本发明提供的纳米制剂具有良好的血浆稳定性，表明所述纳米制剂进入机体后的有望实现长期稳定的释放效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中所述纳米制剂的紫杉醇累积释放曲线；
图2为本发明实施例1中所述纳米制剂的白藜芦醇累积释放曲线；
图3为本发明实施例1中所述纳米制剂给药后荷瘤裸鼠的体重变化曲线图；
图4为本发明实施例1中所述纳米制剂给药后荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，肿瘤耐药性是目前化疗失败的主要原因，本发明提供了一种逆转肿瘤耐药的纳米制剂用于递送紫杉醇及白藜芦醇的药物组合，为了实现对耐药肿瘤的抑制作用，通过靶向材料的修饰提高药物靶向肿瘤细胞的效果，另外，通过脂质材料的选择实现了药物的pH响应。
本发明第一方面，提供一种治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂，所述纳米制剂由药物、脂质材料及靶向材料构成；其中，药物与脂质材料构成载药脂质核心；所述载药脂质核心和靶向材料构成仿生糖-脂或仿生脂-蛋白结构；
所述药物为紫杉醇及白藜芦醇；
所述脂质材料为pH敏感材料，其原料至少包括二油酰磷脂酰乙醇胺；
所述靶向材料选自蛋白、蛋白偶联物、多肽或糖。
为了获得一种具有pH灵敏响应效果的纳米制剂，所述脂质材料的原料包括二油酰磷脂酰乙醇胺，还包括油酸、胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或几种。
进一步的，所述胆固醇衍生物为胆固醇半琥珀酸酯。
在上述载药脂质核心制备的一种具体的实施方式中，所述脂质材料由二油酰磷脂酰乙醇胺和油酸组成。
又一种效果较好的实施方式中，所述脂质材料心由二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的衍生物胆固醇半琥珀酸酯组成。
优选的，所述靶向材料中，所述蛋白为包括但不限于细胞因子、转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或白蛋白偶联物。
优选的，所述靶向材料中，所述蛋白偶联包括叶酸偶联白蛋白或甘草次酸偶联白蛋白。
优选的，所述靶向材料中，所述多糖为甘露糖或透明质酸。
上述靶向材料效果较好的一种实施方式中，所述靶向材料为细胞因子，具体的，为表皮生长因子(EGF)。
优选的，所述紫杉醇和白藜芦醇的质量比为0.5-10:1。
优选的，所述靶向材料与载药脂质核心的重量比为0.02-0.1：1。
优选的，所述药物与载药脂质核心的重量比为0.02-0.2:1。
本发明第二方面，提供第一方面治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂的制备方法，所述制备方法包括：将药物分散于脂质材料中得到载药脂质核心溶液，向载药脂质核心溶液中加入靶向材料进行孵育得到所述仿生糖-脂或仿生脂-蛋白结构纳米制剂。
优选的，所述制备方法的具体步骤如下：将紫杉醇、白藜芦醇与脂质材料加入有机溶剂溶解，蒸除有机溶剂后形成含药薄膜，向含药薄膜中加入缓冲溶液进行超声水化得到载药脂质核心溶液；加入靶向材料并搅拌孵育12-48h得到仿生糖-脂或仿生脂-蛋白结构纳米制剂。
进一步的，所述有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、氯仿中的一种。
进一步的，所述缓冲液为磷酸缓冲液(PBS)，所述缓冲溶液的pH为7～8，具体的，为7.4。
进一步的，所述靶向材料采用缓冲液溶解，溶解后，靶向材料的浓度为1-20mg/ml。
进一步的方案中，所述超声水化过程需要在低温条件下进行，具体的实施方式中包括采用冰浴超声，所述超声的功率为100-180W。
进一步的，所述孵育温度为35-40℃，孵育采用低速磁力搅拌，搅拌速度为10-60r/min。
本发明第三方面，提供一种组合物，所述组合物中包括第一方面所述治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂。
优选的，所述组合物中，还包括其他具有抗肿瘤活性的成分，所述抗肿瘤活性成分包括但不限于细胞毒类药物(具体实例如氮芥、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、司莫司汀、顺铂、卡铂等)、核酸抑制类药物(具体实例如甲氨蝶呤、培美曲塞、阿糖胞苷、吉西他滨等)、激素类药物(具体实例如三苯氧胺、托瑞米芬、甲孕酮、甲地孕酮等)、免疫调节剂(具体实例如干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽类)、单克隆抗体(具体实例如利妥昔单抗注射液、注射用曲妥珠单抗、贝伐珠单抗等)或其他辅助治疗成分。
优选的，所述药物组合物中还包括药学上所必需的载体，为包括但不限于片剂，胶囊剂，颗粒剂，粉剂、口服悬剂，注射剂中的一种。
效果较好的实施方式中，所述药物组合物为一种注射剂，具体的，所述注射剂包括采用医疗器械经皮肤、肌肉或血管进行注射的制剂，也包括在介入治疗中施用的注射剂。
本发明第四方面，提供第一方面所述治疗多药耐药肿瘤的纳米制剂、第三方面所述组合物在制备抗肿瘤产品中的应用。
优选的，所述抗肿瘤产品为包括但不限于抗肿瘤药物、保健品或特殊医用功能食品中的一种。
优选的，所述肿瘤为包括但不限于皮肤癌，头颈癌，肺癌，食道癌，宫颈癌，子宫癌，胰腺癌，乳腺癌，肾癌，输尿管癌，膀胱、乳腺癌、胃癌、肠癌、舌癌，咽喉癌或淋巴瘤；进一步的，所述肿瘤为紫杉醇耐药性肿瘤。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1共载紫杉醇及白藜芦醇纳米制剂制备
(1)称取二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的量为60mg，胆固醇半琥珀酸酯15mg，胆固醇为12mg，总药量10mg，其中，紫杉醇：白藜芦醇为5:1(w/w)。将上述各原料置于150mL茄形瓶中加入10mL无水乙醇溶解，37℃减压旋转蒸干成膜；再加入15mLPBS，37℃水化20min；150w探头冰浴超声5min。
(2)将表皮生长因子用PBS(pH 7.4)溶解成浓度为1mg/mL的溶液，在搅拌条件下将上述表皮生长因子溶液缓慢加入到上述(1)溶液中继续搅拌孵育，搅拌速率为30r/min(磁力搅拌)，37℃孵育24h，得到所述纳米制剂。
实施例2共载紫杉醇及白藜芦醇纳米制剂制备
(1)称取二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的量为62mg，胆固醇半琥珀酸酯16mg，胆固醇为13mg，总药量12mg，其中，紫杉醇：白藜芦醇为4:1(w/w)。将上述各原料置于150mL茄形瓶中加入15mL无水乙醇溶解，37℃减压旋转蒸干成膜；再加入15mLPBS，37℃水化15min；150w探头冰浴超声8min。
(2)将表皮生长因子用PBS(pH 7.4)溶解成浓度为1.2mg/mL的溶液，在搅拌条件下将上述表皮生长因子溶液缓慢加入到上述(1)溶液中继续搅拌孵育，搅拌速率为30r/min(磁力搅拌)，37℃孵育24h，得到所述纳米制剂。
实施例3共载紫杉醇及白藜芦醇纳米制剂制备
(1)称取二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的量为58mg，胆固醇半琥珀酸酯12mg，胆固醇为10mg，总药量8mg，其中，紫杉醇：白藜芦醇为2:1(w/w)。将上述各原料置于150mL茄形瓶中加入8mL无水乙醇溶解，37℃减压旋转蒸干成膜；再加入15mLPBS，37℃水化20min；150w探头冰浴超声5min。
(2)将表皮生长因子用PBS(pH 7.4)溶解成浓度为1mg/mL的溶液，在搅拌条件下将上述表皮生长因子溶液缓慢加入到上述(1)溶液中继续搅拌孵育，搅拌速率为30r/min(磁力搅拌)，37℃孵育24h，得到所述纳米制剂。
性能表征
本发明针对上述实施例1中制备得到的纳米制剂性能进行了表征：
1、纳米制剂粒径、Zeta电位、包封率与载药量的测定
(1)取适量新鲜制备的实施例1制备的纳米制剂，经适当稀释后采用Zetasizer-Nano ZS90粒度和Zeta电位分析仪对其粒径及其分布进行考察，并对其Zeta电位进行测定，结果如表1所示。
将分离纯化的纳米制剂，加甲醇定容，超声破坏，过0.22μm微孔滤膜，用HPLC法进行检测，确定制剂中紫杉醇及白藜芦醇的量，并计算包封率(EE)，结果如表1所示。
表1纳米制剂粒径、Zeta电位及包封率测定结果(平均值±标准偏差,n＝3)
从上述表1的数据中可以看出，实施例1制备的纳米制剂对紫杉醇和白藜芦醇具有非常好的包封效果，包封率都达到了93％以上。
2、体外pH敏感释放药物行为考察
精密吸取实施例1中纳米制剂溶液0.1mL于透析袋中，透析袋外为200mL 0.1％(v/v)Tween80的PBS释放介质，所述释放介质的pH为5.0，6.0或7.4，于37℃，100r/min的摇床中振摇，定时取出释放介质200μL，同时补充相同体积和温度的新鲜释放介质。HPLC法测定释放介质中的药物含量，计算累积释放度并绘制累积释放曲线，考察不同pH条件下，纳米制剂的体外释药行为，体外累积释放曲线见图1、2。
根据图1、2所示，纳米制剂中药物紫杉醇及白藜芦醇的释放表现出pH响应的释放行为，由二油酰磷脂酰乙醇胺组成的pH敏感系统，在pH低于6.5时，可释放其包载物质。在中性条件下，二油酰磷脂酰乙醇胺形成稳定的脂质体双层膜。当pH<6.5时，双分子层稳定性受到破坏，可与生物膜的发生膜融合作用，释放包封物质。因此，在pH为6.0时，纳米制剂中的双分子层稳定性受到破坏，导致药物的快速释放。因此制备的纳米制剂具备肿瘤细胞内的药物传递功能，通过在多药耐药肿瘤细胞内与酸性内涵体或溶酶体膜融合，有效地将包封物质传递至胞质中，达到良好的肿瘤多药耐药治疗效果。
3、纳米制剂体内治疗多药耐药肿瘤活性研究
(1)荷瘤BALB/c裸鼠模型的建立
取对数生长期的MDA-MB-231/taxol耐药细胞，使用无菌无血清的细胞培养液调细胞悬液浓度为4×106cells/mL。将上述耐药肿瘤细胞接种于BALB/c裸鼠的右侧腋窝处皮下。接种后BALB/c裸鼠饲养于SPF级实验室，观察测定记录肿瘤大小，达到需要要求时，用于后续实验。
(2)体内抗肿瘤活性研究
待荷瘤裸鼠肿瘤的体积达到约50mm3时，开始分组给药。荷瘤裸鼠随机分为四组(每组六只)：分别为生理盐水对照组，组，含紫杉醇纳米制剂组，共载紫杉醇及白藜芦醇纳米制剂组。各组制剂每三天通过裸鼠尾静脉注射给药，共四次，每次给药剂量为10mg紫杉醇/kg为依据(共载紫杉醇及白藜芦醇纳米制剂组给药剂量为10mg紫杉醇/kg，2mg白藜芦醇/kg)。每两天对裸鼠的体重进行称量，并用游标卡尺对裸鼠肿瘤的长短进行测量，记录(如附图3)。肿瘤体积通过公式：V＝0.5×length×wide2进行计算。通过分析各组裸鼠体重及肿瘤体积变化，考察各组制剂的体内抗肿瘤活性(如附图4所示)。
4、血浆稳定性考察
纳米制剂选用靶向材料均为蛋白质、多肽或糖类，可直接缓和搅拌孵育，通过仿生糖-脂结构、脂-蛋白结构，制备得到药物组合纳米制剂，可以增加载体在血液循环中的稳定性，因此考察纳米载体在血浆中的稳定性具有重要意义。
实施例1中纳米制剂分别在同体积的PBS，及含50％血浆的PBS中，37℃下孵育。分别在3，12，24h取样，测定载体粒径，考察纳米制剂在血浆中的稳定性。仿纳米制剂在血浆中的稳定性结果见表3。
表2纳米制剂的稳定性研究(平均值±标准偏差,n＝3).
由结果可知，纳米制剂在与同体积PBS，及含50％血浆PBS，37℃下孵育后的的粒径分布没有明显变化，表明纳米制剂的亲水性及生物相容性靶向材料使其在血浆中具有稳定性。并且在共同孵育24h后，粒径均没有发生明显变化，仍具有较好的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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