一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒及其制备方法和应用 (Magnetic nanoparticle wrapped by erythrocyte membrane and preparation method and application thereof ) 是由 彭逸舟 段金娣 杨艳婧 钟世安 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒及其制备方法和应用,具体为水热法制备的PEG-Fe-3O-4用经靶向修饰的红细胞膜碎片挤出包裹,制备出有免疫逃避性和灵敏磁响应性的纳米颗粒红细胞膜-PEG-Fe-3O-4,能靶向吸附对叶酸敏感的癌细胞,方便其被磁场控制或通过光热刺激杀灭癌细胞。红细胞膜-PEG-Fe-3O-4可有效靶向吸附到叶酸敏感的癌细胞膜上,赋予癌磁响应性,有利于磁场控制运动和用光热刺激杀灭。因此在靶向治疗和产业推广方面具有潜在的应用前景。(The invention relates to a magnetic nanoparticle wrapped by erythrocyte membrane, a preparation method and application thereof, in particular to PEG-Fe prepared by a hydrothermal method 3 O 4 Extruding and wrapping with target-modified erythrocyte membrane fragments to prepare nanoparticle erythrocyte membrane-PEG-Fe with immune evasion and sensitive magnetic response 3 O 4 The targeted adsorption of folic acid-sensitive cancer cells is facilitated, and the folic acid-sensitive cancer cells can be controlled by a magnetic field or can be killed by photo-thermal stimulation. Erythrocyte membrane-PEG-Fe 3 O 4 Can be effectively adsorbed on the membrane of folic acid sensitive cancer cell in a targeted way, endows the cancer with magnetic responsiveness, and is beneficial to controlling movement by a magnetic field and killing by photo-thermal stimulation. Therefore, the method has potential application prospect in the aspects of targeted therapy and industrial popularization.)
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒的制备方法及其产品和应用。
背景技术
癌症是威胁人类生命的一种重大疾病，常规化疗放疗和手术治疗效果有限，且副作用较高，应癌症市场要求急需新技术的开发。靶向磁纳米颗粒是当前一项研究重点，磁性Fe3O4具有独特的磁性质和导热能力，有良好的生物相容性，在癌症治疗中得到广泛关注，可以以少量红外光能量就激发出大量热量，是光热疗法的好材料，且其磁性能有利于赋予癌细胞磁响应性，便于磁场控制。Fe3O4的缺点在于磁效应令该粒子容易团聚沉淀，过大的粒子不利于人体代谢，容易累积在肝脏、肾脏、淋巴结处，造成人体不能容忍的副作用。虽然目前现在技术在磁纳米颗粒制备过程中，通过Fe3O4的表面修饰，可以增强其悬浮性，但是为了达到减小粒子粒径的目的常采用毒性较大的表面活性剂如十二烷基苯磺酸钠，有机溶剂四氢呋喃、DMSO等，且常常无法避开免疫细胞的识别吞噬，虽然制成的粒子生物效应优异，但也存在毒性隐患和被免疫细胞吞噬的风险。计较表面活性剂与有机溶剂使得选择范围减小，错选的风险增大，曾使用过的毒性较低的壳聚糖和海藻酸钠为表面活性剂皆以失败告终。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明首要目的在于：提供一款制备简易低毒性的且具有免疫逃避性的靶向纳米粒子制备方法。具体为水热法制备的PEG-Fe3O4用经靶向修饰的红细胞膜碎片挤出包裹，因红细胞膜的隔离作用，制备出有免疫逃避性和灵敏磁响应性的纳米颗粒，由于叶酸靶向分子易得，对叶酸敏感的癌细胞较多，将粒子制成能靶向吸附对叶酸敏感的癌细胞，方便其被磁场控制或通过光热刺激杀灭癌细胞，能有效减小粒子粒径除了水热法，还使用了PEG6000-10000混合油酸钠制成的分散剂，成功将粒子减低至80nm，红细胞膜起到去除分散剂后稳定粒径的作用，整个制备过程有效避开了毒性大的表面活性剂和有机溶剂。
一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)PEG-Fe3O4的制备；
(2)红细胞膜碎片的提取和靶向修饰；
(3)红细胞膜-PEG-Fe3O4的制备：将PEG-Fe3O4加入由PEG6000-10000与油酸钠加入超纯水配成的分散液，超声，静置，去沉淀取上层悬浮液，步骤(2)获得的靶向修饰的红细胞膜与上层悬浮液共混搅拌，再放入脂质体挤出器，经多次挤出获得。
进一步地，步骤(3)将PEG6000-10000(优选PEG6000)与油酸钠的质量比为1:2-2：1，优选1：1，加入超纯水配成6-8％分散液，优选6％分散液。PEG-Fe3O4在分散液中的浓度为100-300μg/mL；优选150-250μg/mL，进一步优选200μg/mL。
进一步地，步骤(3)超声细胞破碎仪的功率600-1000W，优选800W，频率15-25kHz，优选20kHz。超声30min-40min。
进一步地，步骤(3)超声后至少静置12h，去沉淀。
进一步地，步骤(3)中将步骤(2)获得的靶向修饰的红细胞膜与上层悬浮液共混搅拌，加热至38-45℃，优选40℃，再进行挤出。
进一步地，步骤(3)中每毫升PEG-Fe3O4与靶向修饰的红细胞膜的混合溶液中两者比例150-250μg:3mg，用脂质体挤出器从800nm、400nm相继挤出，40-45℃在200nm膜下挤出3-7次。优选：每毫升PEG-Fe3O4与靶向修饰的红细胞膜的混合溶液中两者比例180-230μg:3mg，再在40℃，用脂质体挤出器从800nm、400nm相继挤出，在200nm膜下挤出7次。
步骤(3)的膜优选Whatman聚碳酸酯膜。
步骤(1)PEG-Fe3O4的制备的具体过程：FeCl2与FeCl3以1：1.5-1：2摩尔比例加入蒸馏水，再加入FeCl2质量2-4倍的PEG6000-10000，超声5-10min(超声细胞破碎仪的功率600-1000W，频率15-25kHz)至溶解；置于惰性气氛下以1400-2600r/min搅拌，升温至45-60℃，反应30-40min；再追加FeCl2质量2-4倍的PEG6000-10000溶液，将反应液转移至聚四氟乙烯反应釜，设置温度为160-200℃，反应5-10小时；得到Fe3O4纳米颗粒沉淀，先用纯水和乙醇洗涤沉淀，重复多次，真空烘箱中45-60℃干燥10-24小时，最终获得PEG-Fe3O4纳米颗粒。
优选：步骤(1)PEG-Fe3O4的制备的具体过程：FeCl2与FeCl3以1：2摩尔比例加入蒸馏水，再加入FeCl2质量3倍的PEG6000，超声10min(超声细胞破碎仪的功率800W，频率20kHz)至溶解；置于氮气气氛下以2600r/min搅拌，升温至60℃，反应30min；再追加FeCl2质量3倍的PEG6000溶液，将反应液转移至聚四氟乙烯反应釜，设置温度为160℃，升温1小时，反应5小时；得到Fe3O4纳米颗粒沉淀，先用纯水和乙醇洗涤沉淀，重复多次，真空烘箱中60℃干燥10小时，最终获得PEG-Fe3O4纳米颗粒。
步骤(2)红细胞膜碎片的提取和靶向修饰过程：将抗凝哺乳动物血离心沉淀红细胞去上清，用冰PBS洗涤，再用低渗溶液浸泡破碎剩下的红细胞，离心,留沉淀去上清，冰PBS洗涤沉淀，反复多次，直到沉淀变成淡粉色或白色，红细胞膜和牛黄胆酸钠溶液按照牛黄胆酸钠：红细胞膜＝1：6-1:4质量比混合，溶入4-6倍体积乙醇，超声混匀后装入注射器，迅速注入40℃-50℃8-12倍乙醇溶液体积的PBS溶液,50-70℃旋蒸20-30min去除乙醇；
靶向修饰过程：DSPE-PEG与靶向分子和/或荧光分子，按照摩尔比＝1.5-1:1在PBS溶液中混合形成DSPE-PEG-靶向分子和/或荧光分子，荧光分子包括FITC和罗丹明异硫氰酸酯中的至少一种，靶向分子包括叶酸和甘露醇中的至少一种；用PBS溶液稀释过的极少量红细胞膜加入DSPE-PEG-靶向分子和/或荧光分子，摇床混合；红细胞膜：DSPE-PEG-靶向分子和/或荧光分子＝4:1-10：1质量比。
优选：步骤(2)红细胞膜碎片的提取和靶向修饰过程：将羊血5000r/min离心沉淀红细胞去上清，用0℃冰PBS洗涤，反复三到四次，再用冰1/4倍PBS低渗溶液浸泡破碎剩下的红细胞1小时，用13000r/min离心15min,留沉淀去上清，0℃冰PBS洗涤沉淀，反复多次，直到沉淀变成淡粉色或白色，采用卵磷脂在紫外上定出标准曲线得到红细胞膜浓度，调整为3mg/ml；牛黄胆酸钠配成1mg/ml浓度，红细胞膜和牛黄胆酸钠溶液按照牛黄胆酸钠：红细胞膜＝1：4质量比混合，溶入5倍体积乙醇，超声混匀后装入注射器，迅速注入45℃10倍乙醇溶液体积的PBS溶液,60℃旋蒸25min去除乙醇。
靶向修饰过程：DSPE-PEG与靶向分子和/或荧光分子，按照摩尔比＝1:1在PBS溶液中混合形成DSPE-PEG-靶向分子和/或荧光分子溶液(即DSPE-PEG-X),用PBS溶液稀释过的极少量红细胞膜加入DSPE-PEG-X，摇床混合；红细胞膜：DSPE-PEG-X＝4:1质量比。
DSPE-PEG-靶向分子(FA)用于靶向吸附对叶酸敏感的癌细胞，方便其被磁场控制或通过光热刺激精准杀灭癌细胞。
DSPE-PEG-荧光分子用于实验室检测需要或者临床过程中计算药代动力学检测需要。
本发明可以单独制备DSPE-PEG-靶向分子或DSPE-PEG-荧光分子，也可以制备DSPE-PEG同时连接靶向分子和荧光分子。
本发明还可以采用PEG与別的药物连接，再包上靶向红细胞膜，用于靶向治疗。
本发明DSPE-PEG-荧光分子和/或FA(叶酸)可以自制，也可以直接采用上海芃硕生物科技有限公司的产品。
DSPE-PEG为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，其中PEG分子量2000-6000，优选2000。
进一步地，红细胞膜与DSPE-PEG-X混合，36-37℃摇床1-2小时；再在40-45℃用脂质体挤出器从800nm、400nm相继挤出，在200nm膜下挤出3-7次。4℃12000r/min-13000r/min离心，冰PBS洗涤，超声细胞破碎仪重分散30秒-60秒，功率600-1000W，优选800W，频率15-25kHz，优选20kHz，4℃PBS保存。
进一步地，将挤出红细胞膜磁纳米粒子溶液用70nm透析袋透析48h，去除多余的DSPE-PEG-荧光分子和/或靶向分子、油酸钠和PEG6000，4℃静置48小时，去沉淀取上层液体。
本发明的第二个目的是提供一种所述制备方法得到的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒。
本发明的第三个目的是提供所述的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒做为靶向材料的应用，尤其是作为医用靶向材料的应用。
本发明红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒一方面可以体现其中心内核的磁响应性和光热性能，外载红细胞膜脂质体良好的生物相容性和免疫逃避性，另一方面PEG分子的使用有效降低磁核粒径，提高磁流体悬浮稳定性，PEG与油酸钠分散剂的使用令制备过程避开了有毒表面活性剂和有机溶剂。本发明提供的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒在靶向吸附到叶酸敏感癌细胞上以后，可有效赋予癌细胞磁响应性，仅用少量的红外线就可激发Fe3O4释放热量，做到有效杀灭癌细胞。红细胞膜赋予磁粒子免疫逃避性，大大延长血液循环时间，使其得到充分时间精准捕捉癌细胞。因此在生物医学领域，在癌症治疗方面有极好的应用前景。
本发明的优点在于：
(1)本发明制备的纳米材料具有磁响应性。
(2)本发明制备的纳米材料具有特异性靶向肿瘤的功能。
(3)本发明制备的纳米材料具有在红外线激发下杀灭癌细胞的功能。
(4)本发明制备的纳米材料具有良好的生物相容性和血液长循环的功能。
(5)本发明制备的纳米材料用红细胞膜包裹，红细胞膜用乙醇柔化法经过柔化处理，变形性加大，易于通过聚碳酸脂膜，亦使纳米粒子易于通过ESR效应更多被肿瘤组织吸附。
(6)本发明制备的纳米材料具有靶向吸附到癌细胞膜表面，赋予癌细胞磁响应性功能。
(7)本发明制备过程全程无任何毒性材料和有机溶剂，制备简单，成本低，安全可靠。
附图说明
图1为本发明所制备的靶向磁性纳米粒子的切面示意图；
图中(1)红细胞膜；(2)PEG；(3)Fe3O4磁核；(4)DSPE-PEG-FA；
图2为实施例1不同比例的PEG6000加油酸钠分散剂分散效果对比；
图中(a)油酸钠与PEG6000为1：1；(b)油酸钠与PEG6000为1：2；(c)油酸钠与PEG6000为2：1；(d)无油酸无PEG6000的Fe3O4，均静置24小时。
图3为本发明实施例1步骤(1)或步骤(3)中使用的不同分散剂分散效果对比；
图中：(a)PEG6000-Fe3O4加入十二烷基苯磺酸钠分散剂；(b)壳寡糖(OCS)-Fe3O4加入PEG-油酸钠分散剂；(c)海藻酸钠-Fe3O4加入PEG-油酸钠分散剂；(d)PEG6000-Fe3O4加入聚乙烯醇-十二烷磺酸钠分散剂；(e)PEG600包裹Fe3O4加入PEG-油酸钠分散剂；(f)左边为OCS-Fe3O4挤出200nm膜，右边为PEG6000-Fe3O4挤出200nm膜。
图4为实施例1所制备的PEG-Fe3O4五天DLS粒径监测图；
图中(a)超声后的PEG-Fe3O4纳米颗粒粒径分布；(b)静置1天后PEG-Fe3O4纳米颗粒粒径分布；(c)静置3天后PEG-Fe3O4纳米颗粒粒径分布；(d)静置5天后PEG-Fe3O4纳米颗粒粒径分布。
图5为实施例1所制备的PEG-Fe3O4磁性能表征图；
图中a为悬浮中的PEG-Fe3O4磁粒子，b为PEG-Fe3O4磁粒子随磁场运动，c为粉末状磁粒子的磁滞回线。
图6为实施例1所制备的红细胞膜经柔化挤出分散后的TEM图；
图7为实施例1用紫外研究不同比例的牛黄胆酸钠与不同温度对红细胞膜变形性的影响效果
图中a不同温度对纯红细胞膜柔度的影响；
b不同温度对挤出后纯红细胞膜紫外峰值影响；
c不同表面活性剂比例对红细胞膜柔度的影响；
d不同表面活性剂比例对挤出后柔化红细胞膜紫外峰值的影响；
e不同温度对柔化红细胞膜柔度的影响；
f不同温度对挤出后柔化红细胞膜紫外峰值的影响。
图8为实施例1中用DLS对经1：4(m/m)牛黄胆酸钠修饰的红细胞膜(RBC)与未修饰红细胞膜稳定性研究；
(a)纯RBC粒径分布；(b)1/6RBC质量的牛黄胆酸钠修饰的RBC粒径分布；(c)1/5RBC质量的牛黄胆酸钠修饰的RBC粒径分布；(d)1/4RBC质量的牛黄胆酸钠修饰的RBC粒径分布。
图9为实施例1中已修饰好的RBC同PEG-Fe3O4共同挤出过膜后3小时后和48小时后的粒径图，以及RBC-PEG-Fe3O4过200nm膜后5天的粒径分布。
图10为实施例1中不同体积比的DSPE-PEG-Rho(Rho是罗丹明异硫氰酸酯)与红细胞膜共混后的荧光图谱。
图11为实施例1所制备的靶向磁性纳米粒子-癌细胞吸附图与磁场运动图；
图12为本发明实施例1制备的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)的癌细胞精准靶向性和免疫细胞逃避性比较；
(a)A549癌细胞位置分布；(b)A549吸附本发明制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子的荧光分布；(c)PMBC细胞位置分布；(d)PMBC共孵育的本发明制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子荧光分布。
图13为用CCK8检测经本发明实施例1制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子处理和红外照射的A549的细胞活性；
(a)A549细胞经药物与红外线照射5min处理；(b)A549细胞经药物处理；(c)A549细胞无药物无红外线照射；(d)A549细胞加入CCK8后1小时；(e)A549细胞加入CCK8后3小时；(f)A549细胞加入CCK8后12小时。
图14为用CCK8检测经本发明实施例1制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子处理和红外照射的PMBC的细胞活性；
(a)不同体积纯药物加入培养基；(b)PMBC加入药物并照射红外线5min并加入CCK8一小时；(c)PMBC加入药物并加入CCK8一小时；(d)PMBC加入药物并照射红外线5min并加入CCK8十二小时；(e)PMBC加入药物并加入CCK8十二小时。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
(1)PEG-Fe3O4制备：
2.00g(0.01mol)FeCl2·4H2O，4.725g(0.02mol)FeCl3·6H2O加入20mL蒸馏水，再加入6gPEG6000，超声10min(超声细胞破碎仪的功率800W，频率20kHz)至溶解。置于氮气气氛下以1400r/min搅拌，升温至60℃，反应30min。再滴加含6gPEG6000溶液，该溶液体积约为反应液的1/5，将反应液转移至聚四氟乙烯反应釜，设置温度为160℃，升温1小时，反应5小时。得到Fe3O4纳米颗粒沉淀，先用纯水和乙醇洗涤沉淀，重复多次，真空烘箱中60℃干燥10小时，最终获得PEG-Fe3O4纳米颗粒。
(2)红细胞膜碎片的提取和靶向修饰：
将羊血分装入离心管，6000r/min离心15min,沉淀红细胞去上清，用冰PBS洗涤，反复三到四次，再用冰1/4倍PBS低渗溶液浸泡破碎剩下的红细胞1小时，用13000r/min离心15min,留沉淀去上清，冰PBS洗涤沉淀，反复多次，直到沉淀变成淡粉色或白色，4℃保存。采用卵磷脂在紫外上定出标准曲线得到红细胞膜浓度，调整为3mg/ml；牛黄胆酸钠配成1mg/ml浓度，牛黄胆酸钠：红细胞膜＝1:4(m/m),混合溶入五倍体积乙醇(10mL)，超声混匀后装入注射器，迅速注入45℃PBS溶液100mL,60℃旋蒸25min。
靶向修饰过程：DSPE-PEG(DSPE-PEG2000)与靶向分子和/或荧光分子，按照摩尔比＝1:1在PBS溶液中混合形成DSPE-PEG-靶向分子和/或荧光分子溶液(即DSPE-PEG-X),用PBS溶液稀释过的极少量红细胞膜加入DSPE-PEG-X，摇床混合37℃搅拌1小时；红细胞膜：DSPE-PEG-X＝4:1质量比。DSPE-PEG-X中的X为荧光分子(Rho)或者靶向分子(FA)，或者它们按照摩尔比1:1在PBS溶液中混合。
(3)红细胞膜-PEG-Fe3O4的制备：
将PEG6000与油酸钠以质量比为1:1，加入超纯水配成6％分散液，PEG-Fe3O4在分散液中的浓度为200μg/mL；将PEG-Fe3O4加入超声半小时，超声细胞破碎仪的功率800W，频率20kHz，静置24小时，去沉淀取上层悬浮液。靶向修饰的红细胞膜与上层悬浮液共混，每毫升PEG-Fe3O4与靶向修饰的红细胞膜的混合溶液中两者比例200μg:3mg，搅拌加热至40℃，挤出器保持在40℃水浴中，再将Whatman膜放入脂质体挤出器，先后通过800nm，400nm过滤掉可能堵塞微孔膜的混杂大颗粒，再经200nm孔径7次挤出。用70nm透析袋常温透析48小时，袋内液体4℃下静置48小时，去沉淀，取上层液体。
以下是以实施例1为基础，各项条件的探索结果(单因素改变，其他条件相同)：
图2为实施例1不同比例的PEG6000加油酸钠分散剂分散效果对比；
表1油酸钠与PEG不同比例的分散剂效果
图2与表1表示不同油酸钠与PEG6000比例以1：1，1：2，2：1与超纯水配成3％，4％，6％，8％质量比的分散液，将等量PEG-Fe3O4滴入其中，经超声30min后，静置24小时，待液体稳定后观察悬浮性。由于PEG-Fe3O4浓度达到数百微克/毫升时，所有液体都有不同程度的分层，但经24小时后，液体基本达到稳定，沉淀速度就可忽略不计，6％质量比分散液在稳定后上层悬浮液色最浓，悬浮性最好。而未经分散剂处理的PEG-Fe3O4经过24小时静置，几乎保持其悬浮性。
图3为本发明实施例1步骤(1)或步骤(3)中使用的不同分散剂分散效果对比；
图中：(a)PEG6000-Fe3O4加入十二烷基苯磺酸钠分散剂；(b)壳寡糖OCS-Fe3O4加入PEG-油酸钠分散剂；(c)海藻酸钠-Fe3O4加入PEG-油酸钠分散剂；(d)PEG6000-Fe3O4加入聚乙烯醇-十二烷磺酸钠分散剂；(e)PEG600包裹Fe3O4加入PEG-油酸钠分散剂；(f)左边为OCS-Fe3O4挤出200nm膜，右边为PEG-Fe3O4挤出200nm膜。图(a)-(e)为以不同分散剂分散PEG-Fe3O4静置24小时后失败的案例，图(f)可见OCS-Fe3O4在聚碳酸酯膜上的残留远大于PEG-Fe3O4。
图4为实施例1所制备的PEG-Fe3O4五天DLS粒径监测图；
图中(a)超声后的Fe3O4纳米颗粒粒径分布；(b)静置1天后Fe3O4纳米颗粒粒径分布；(c)静置3天后Fe3O4纳米颗粒粒径分布；(d)静置5天后Fe3O4纳米颗粒粒径分布。
如图所示经过连续五天对PEG-Fe3O4磁悬浮液的粒径监测，粒径保持稳定在80nm左右，说明该磁流体方便用于制备RBC-PEG-Fe3O4的后续包裹工作。
图5为实施例1所制备的PEG-Fe3O4磁性能表征图。
图(a)和(b)显示了纳米粒子磁场响应性，但是粒子颗粒太小要等1个小时以上才出现响应性，图(c)的磁滞回线说明粒子材料磁性高于平均值，磁响应时间长与粒子粒径小有关，与磁粒子材料磁性能无关。
图6为实施例1所制备的红细胞膜经柔化挤出分散后的TEM图；
经牛黄胆酸钠处理过的红细胞膜的柔性得以增强，在45℃微热环境下进入挤出器，成功通过200nm膜。将经200nm膜挤出后的红细胞膜溶液滴在铜网上，经72小时阴干后拍成TEM照片，可以看到挤出后的细胞膜形成的囊泡粒径相对均匀，周围存在些许细胞碎片，分散度尚令人满意，膜团块大小稳定，仅存在极少量的细胞膜直径扩大团聚现象。
图7为实施例1用紫外研究不同比例的牛黄胆酸钠与不同温度对红细胞膜变形性的影响效果
图中a不同温度对纯红细胞膜柔度的影响；
b不同温度对挤出后纯红细胞膜紫外峰值影响；
c不同表面活性剂比例对红细胞膜柔度的影响；
d不同表面活性剂比例对挤出后柔化红细胞膜紫外峰值的影响；
e不同温度对柔化红细胞膜柔度的影响；
f不同温度对挤出后柔化红细胞膜紫外峰值的影响；
用100nm聚碳酸酯膜来挤出不同温度下未柔化的纯红细胞膜、用不同比例牛黄胆酸钠为表面活性剂处理过的红细胞膜和不同温度下的用固定1：4的牛黄胆酸钠柔化过的红细胞膜得到的液体测紫外峰，得到不同浓度红细胞膜液体，可以反映出以上不同条件下红细胞膜的变形性，高压下经过100nm微孔的红细胞膜越多，说明膜的变形性越好。如图a和图b表现出温度对纯红细胞膜变形性的影响，得到40℃的纯红细胞膜有最好的变形性。如图c和图d表现出不同质量比的牛黄胆酸钠处理红细胞膜对其柔性的影响，得到牛黄胆酸钠为红细胞膜质量的1/4时，红细胞膜柔化效果最佳。如图e和图f表现出固定1/4红细胞膜质量的牛黄胆酸钠在不同温度下的柔性，得到40℃为柔化红细胞膜变形性最佳温度，因此用1/4红细胞膜质量的牛黄胆酸钠处理红细胞膜并在40℃下挤出，可取得最大量变形性好的红细胞膜。
图8为实施例1中用DLS对经1：4(m/m)牛黄胆酸钠修饰的红细胞膜与未修饰红细胞膜稳定性研究；
(a)纯RBC粒径分布；(b)1/6RBC质量的牛黄胆酸钠修饰的RBC粒径分布；(c)1/5RBC质量的牛黄胆酸钠修饰的RBC粒径分布；(d)1/4RBC质量的牛黄胆酸钠修饰的RBC粒径分布；
由图8表示纯红细胞膜和不同比例牛黄胆酸钠修饰过的红细胞膜经100nm孔膜挤出后48小时测量的DLS粒径分布，刚制备好的红细胞膜从100nm开始随时间推移逐渐失稳融合，粒径变大，纯红细胞膜失稳最大，48小时内从最初挤出时100nm增大到约800nm，图8中可看出牛黄胆酸钠有一定程度稳定细胞膜的作用，用量越多，稳定效果越大，用1/4红细胞膜质量的牛黄胆酸钠修饰过的红细胞膜在48小时的粒径仅增大到300nm左右。
图9为实施例1中已修饰好的RBC(同时连接有Rho和FA分子)同PEG-Fe3O4共同挤出过膜后3小时后和48小时后的粒径图，以及RBC-PEG-Fe3O4过200nm膜后5天的粒径分布；
图9显示已同时被靶向分子(FA)和荧光分子(Rho)修饰好的RBC与制备好的PEG-Fe3O4通过200nm聚碳酸酯膜后，制成后数小时粒径集中分布在200nm左右，无明显粒径扩大情况，可推测小于200nm的Fe3O4粒子已被包裹进去，大于200nm的Fe3O4粒子已在800nm、400nm再200nm的梯度挤出中被过滤掉。OCS-Fe3O4仅能通过400nm膜。其虽有145nm粒径，但是高压过程中无法做到每一个粒子对应通过每一个200nm膜孔隙，由于存在大量粒子重叠，在挤压压紧过程中无法得到充分分散，还有一些粒子吸附到聚碳酸酯膜上，导致通过200nm膜失败。海藻酸钠-Fe3O4因全部沉淀，无法进行过膜实验。高分散度小粒径的磁性纳米粒子更易于充分利用癌细胞膜上叶酸受体的吸附空间，有利于吸附更大量的磁粒子，因此选择通过200nm膜的RBC-PEG-Fe3O4进入下一步细胞实验。从图9中可看出，RBC-PEG-Fe3O4从最初挤出200nm膜，在48小时粒径分布几乎无变化，可见在PEG和牛黄胆酸钠的共同作用下，能起到防止粒子失稳融合的作用，而红细胞膜在一定程度上取代PEG6000加油酸钠分散剂起到稳定粒子粒径的效果。
图10为实施例1中不同体积比的DSPE-PEG-Rho与红细胞膜共混后的荧光图谱；
该图显示200微升3mg/ml浓度的红细胞膜，加入不同体积的1mg/mlDSPE-PEG-Rho，经过摇床混合，高速离心沉淀一次再分散，得到的荧光光谱，其中120微升～140微升的荧光稳定，应为最适体积，即1:5(m/m)～1:4(m/m)。DSPE-PEG-Rho浓度再继续增加意义不大。
图11为实施例1所制备的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)-癌细胞吸附图与磁场运动图；
红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)中红细胞膜已经被靶向分子(FA)和荧光分子(Rho)修饰。
图(a)和(b)表示癌细胞和荧光靶向磁性纳米粒子分子的分布相对位置，可明显见荧光靶向磁性纳米粒子分布的癌细胞膜上，图(a)中的癌细胞位置与图(b)中的荧光位置可一一对应；图(c)(d)(e)(f)表示经过荧光靶向磁性纳米粒子处理过的癌细胞置于磁场中被磁场有向性控制运动,说明癌细胞被靶向磁性纳米粒子赋予了磁响应性。
图12为本发明实施例1制备的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)的癌细胞精准靶向性和免疫细胞逃避性比较；
(a)A549癌细胞位置分布；(b)A549吸附本发明制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子的荧光分布；(c)PMBC细胞位置分布；(d)PMBC共孵育的本发明制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子荧光分布；
红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)中红细胞膜已经被靶向分子(FA)和荧光分子(Rho)修饰。
将A549细胞与羊血PMBC(外周血单核细胞peripheralbloodmononuclearcell)，外周血单个核细胞分别培养种板，37℃孵育24小时后加入不同浓度的RBC-PEG-Fe3O4，加药数小时后用高内涵拍照显示荧光的分布情况，图(a)和(b)中得到癌细胞的边缘由Rhodamine6G清晰显示出现，两图中大部分癌细胞位置与荧光位置几乎可以一一对应，图(c)和(d)显示较密集的PMBC分布，荧光粒子的分布并不严格遵循原细胞的位置分布，显得随机性更强，可推测RBC-PEG-Fe3O4不易于PMBC吸附，被吞噬的情况也并不显著。
图13为用CCK8检测经本发明实施例1制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子(即药物)处理和红外照射的A549的细胞活性；
(a)A549细胞经药物与红外线照射5min处理；(b)A549细胞经药物处理；(c)A549细胞无药物无红外线照射；(d)A549细胞加入CCK8后1小时；(e)A549细胞加入CCK8后3小时；(f)A549细胞加入CCK8后12小时；
红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)中红细胞膜已经被靶向分子(FA)和荧光分子(Rho)修饰。
图13根据酶标仪得到的450nm吸光度数据得出RBC-PEG-Fe3O4粒子与红外线照射对A549癌细胞在12个小时内增殖速度和活性的影响。如图(a)所示，A549细胞经RBC-PEG-Fe3O4粒子与5min红外照射处理后，随时间推移，加入20μl的板孔增殖速度最大，比起无药物仅照射的孔有少量增加，可能源于少量纳米粒子被红外激发的低剂量热量促进了癌细胞的增殖，随粒子剂量的加大，细胞增殖速度明显下降，与图(b)比对，图(a)从20μl板孔吸光度开始下降，而图(b)自40μl板孔吸光度开始下降，可见光照增强了RBC-PEG-Fe3O4粒子的抗癌细胞性。如图(c)所示，无纳米粒子和红外线处理的空白组，癌细胞增殖速度为最大。如图(d)所示，细胞加入CCK8一小时时间段内，不同处理的细胞吸光度都集中在0.3-0.5一个相对狭窄的区间内，不易看出差距，待3个小时过后，如图(e)所示，加了药物和红外的细胞组开始增殖慢于仅加药物组，更慢于无处理组，经过12小时的增殖，如图(f)所示，增殖速度差距离进一步拉大。
图14为用CCK8检测经本发明实施例1制备的RBC-PEG-Fe3O4粒子(即药物)处理和红外照射的PMBC的细胞活性；
(a)不同体积纯药物加入培养基；(b)PMBC加入药物并照射红外线5min并加入CCK8一小时；(c)PMBC加入药物并加入CCK8一小时；(d)PMBC加入药物并照射红外线5min并加入CCK8十二小时；(e)PMBC加入药物并加入CCK8十二小时。
红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒(RBC-PEG-Fe3O4)中红细胞膜已经被靶向分子(FA)和荧光分子(Rho)修饰。
如图14所示PMBC在加入CCK8后1小时和12小时的吸光度数据，由于RBC-PEG-Fe3O4粒子对吸光度有一定程度的影响，且PMBC贴壁性不强，无法直接倒掉纳米粒子以去除其影响。从图14各图可看出，PMBC在经药物和红外线照射处理1小时和12小时增殖过程中，与药物浓度程上升的线性关系，不论是否照射红外线，曲线斜率相近，几乎都与纯药物浓度的吸光度曲线平行，在无药物无红外线情况下的PMBC增殖1小时在平均值0.35附近波动，12小时在平均值0.66附近波动。从随时间平行增长的吸光度曲线可从中推测PMBC在1-12小时的增殖速度稳定，过程中并未因RBC-PEG-Fe3O4粒子和红外线照射影响而出现明显速度减弱或增强。
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