具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

一、具有促戊糖片球菌生长的党参果聚糖复合物的制备方法，如下：

（1）、党参多糖提取

党参药材按料液比1:10~1:20浸泡30分钟，加热回流提取3次，每次1.5小时，合并三次提取液。

（2）党参多糖的制备

党参多糖提取液经减压浓缩至1/4~1/3体积、60%~80%乙醇沉淀、1000转/分钟离心15分钟，去上清，沉淀用乙醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇依次洗涤3次，冷冻干燥，得到党参多糖样品。

（3）、党参多糖的分离

将党参多糖用水溶解后过50000分子量超滤膜，滤过液采用Sephadex G-100柱色谱制备，采用HPGPC分析洗脱液色谱特征，收集目标洗脱液得到党参果聚糖复合物。

二、党参多糖HPGPC分析

色谱条件为安捷伦1260 HPLC系统-RID检测器，分析柱为TSKgel G4000PWXL色谱柱（7.8mm×30cm，10μm），流动相为超纯水，流速0.3mL/min，示差检测器温度30℃，柱温30℃，进样量20μL，获得HPGPC图谱。谱图呈现如下特点：在 33.55min处有一个明显色谱峰（呋喃型果聚糖）和35.614min处有一色谱峰（吡喃型果聚糖），其所对应多糖分子量大小分别为2000~2500Da和1000~1500Da。

图1的结果表明党参果聚糖复合物主要由33.550分钟和35.614分钟两个主要色谱峰，根据HPGPC分子量和时间（分钟）线性曲线可知33.550分钟和35.614分钟两个主要色谱峰代表的多糖分子量大小分别为2000~2500Da和1000~1500Da。

图2A、2B、2C的结果表明党参果聚糖复合物酸水解产物主要为D-果糖和D-葡萄糖，说明组成党参果聚糖复合物多糖的单糖为D-果糖和D-葡萄糖。

二、党参多糖NMR分析

党参多糖样品（50mg）溶解于1mL氘代水（D₂O）中，400MHz核磁共振仪进行¹H-NMR、¹³C-NMR、¹³C-DEPT135及2D-NMR分析，获得分析该果聚糖复合物NMR谱。

图3A、3B、3C的结果表明党参果聚糖复合物的糖信号主要为果糖信号和微弱的葡萄糖信号，与酸水解结果一致。根据碳信号强弱可知33.550分钟和35.614分钟两个主要色谱峰代表的多糖分别为β-D-呋喃果糖基-（2→1）-连接而成的果聚糖和β-D-吡喃果糖基-（2→1）-连接而成的果聚糖。

图4结果能够清晰归属β-D-呋喃果糖基3位、4位、5位的氢信号和β-D-吡喃果糖基3位、4位、5位的氢信号。

图5结果能够清晰归属β-D-呋喃果糖基1位、3位、4位、5位、6位的氢信号和碳信号以及β-D-吡喃果糖基1位、3位、4位、5位、6位的氢信号和碳信号。

图6结果能够清晰确认两种果糖基的-（2→1）-连接方式。

表1 党参果聚糖复合物H和C核磁数据归属。

三、获得的党参果聚糖复合物对体外粪菌培养中戊糖片球菌生长促进作用。

（1）、粪菌体外培养：将党参果聚糖复合物按照2%的比例与1%的MRS琼脂高压灭菌后制成平板，将粪便（取自一名年轻健康女性）按0.1g/mL PBS稀释，纱布过滤，将滤液平铺于上述平板上厌氧培养，待生长出菌落后，将菌落再次接种于该平板，三次接种培养后接入乳酸细菌培养基扩大培养；

（2）、优势细菌培养：再次接种于党参复合物为唯一碳源的液体内进行培养，检测其生长；

（3）、16SrRNA序列分析：对从步骤（2）中培养获得的细菌进行16SrRNA序列分析，鉴定菌种类型。

根据党参果聚糖复合物为唯一碳源所促生长的戊糖片球菌16SrRNA测序结果，通过与数据库比对确认为戊糖片球菌。

图7结果表明，党参果聚糖复合物在48小时内能够显著促进戊糖片球菌生长。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖权利要求保护范围中。

<110>山西医科大学

<120>一种具有促戊糖片球菌生长的党参果聚糖复合物及制备方法和应用

<160>1

<210>1

<211>1479

<212>RNA

<213>戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）

<220>

<223>益生乳酸菌

<400>1

GGCGTGCGGG TGCTATACAT GCAAGTCGAA CGAACTTCCG TTAATTGATT ATGACGTACT 60

TGTACTGATT GAGATTTTAA CACGAAGTGA GTGGCGAACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA 120

CCTGCCCAGA AGTAGGGGAT AACACCTGGA AACAGATGCT AATACCGTAT AACAGAGAAA 180

ACCGCATGGT TTTCTTTTAA AAGATGGCTC TGCTATCACT TCTGGATGGA CCCGCGGCGT 240

ATTAGCTAGT TGGTGAGGTA AAGGCTCACC AAGGCAGTGA TACGTAGCCG ACCTGAGAGG 300

GTAATCGGCC ACATTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTAGGG 360

AATCTTCCAC AATGGACGCA AGTCTGATGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAA GAAGGGTTTC 420

GGCTCGTAAA GCTCTGTTGT TAAAGAAGAA CGTGGGTAAG AGTAACTGTT TACCCAGTGA 480

CGGTATTTAA CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGT 540

GGCAAGCGTT ATCCGGATTT ATTGGGCGTA AAGCGAGCGC AGGCGGTCTT TTAAGTCTAA 600

TGTGAAAGCC TTCGGCTCAA CCGAAGAAGT GCATTGGAAA CTGGGAGACT TGAGTGCAGA 660

AGAGGACAGT GGAACTCCAT GTGTAGCGGT GAAATGCGTA GATATATGGA AGAACACCAG 720

TGGCGAAGGC GGCTGTCTGG TCTGCAACTG ACGCTGAGGC TCGAAAGCAT GGGTAGCGAA 780

CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCATGCCG TAAACGATGA TTACTAAGTG TTGGAGGGTT 840

TCCGCCCTTC AGTGCTGCAG CTAACGCATT AAGTAATCCG CCTGGGGAGT ACGACCGCAA 900

GGTTGAAACT CAAAAGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT 960

CGAAGCTACG CGAAGAACCT TACCAGGTCT TGACATCTTC TGACAGTCTA AGAGATTAGA 1020

GGTTCCCTTC GGGGACAGAA TGACAGGTGG TGCATGGTTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG 1080

ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTATTAC TAGTTGCCAG CATTAAGTTG 1140

GGCACTCTAG TGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGACGAC GTCAAATCAT 1200

CATGCCCCTT ATGACCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG ATGGTACAAC GAGTCGCGAG 1260

ACCGCGAGGT TAAGCTAATC TCTTAAAACC ATTCTCAGTT CGGACTGTAG GCTGCAACTC 1320

GCCTACACGA AGTCGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC 1380

CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGAGAGTTT GTAACACCCA AAGCCGGTGG 1440

GGTAACCTTT TAGGAGCTAG CCGTCTAAGT GACAGATTG 1479