包含来源于半乳糖酵母的外排体作为活性成分的化妆品组合物
阅读说明：本技术 包含来源于半乳糖酵母的外排体作为活性成分的化妆品组合物 (Cosmetic composition comprising exosome derived from galactose yeast as active ingredient ) 是由 李龙源 赵柄成 于 2019-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于皮肤再生、皮肤弹性改善和皮肤皱纹减少的化妆品组合物,其包含半乳糖酵母(Galactomyces)来源外排体作为活性成分。本发明的包含半乳糖酵母来源外排体作为活性成分的化妆品组合物具有可用于功能性化妆品的功能活性,即,比半乳糖酵母条件培养基的经过滤产物高得多的胶原蛋白合成提高。因此,本发明的化妆品组合物具有优异的作用,例如皮肤再生、皮肤弹性改善和/或皮肤皱纹减少。(The present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration, skin elasticity improvement and skin wrinkle reduction, comprising galactococcus (Galactomyces) derived exosome as an active ingredient. The cosmetic composition of the present invention comprising the galactose yeast-derived exosome as an active ingredient has functional activity useful for functional cosmetics, i.e., a much higher collagen synthesis increase than that of the filtered product of a galactose yeast-conditioned medium. Therefore, the cosmetic composition of the present invention has excellent effects such as skin regeneration, improvement of skin elasticity and/or reduction of skin wrinkles.)
技术领域
本发明涉及用于皮肤再生、皮肤弹性改善和皮肤皱纹减少的化妆品组合物，其包含来源于半乳糖酵母(Galactomyces)的外排体作为活性成分。
背景技术
已知皮肤老化导致皮肤弹性降低和皮肤皱纹增多，并且已知由于胶原蛋白的合成降低和胶原酶基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的受刺激表达而发生皮肤弹性降低和皮肤皱纹的形成。
另外，已知在皮肤细胞中，由于衰老渐进或紫外(UV)线，产生炎性细胞因子的酶COX-2增多，导致前列腺素E2(prostaglandin E2)的合成提高和炎症诱导物的产生提高。由于炎性反应，MMP的生物合成提高，导致胶原蛋白降解，并导致皮肤弹性降低和皮肤皱纹的形成。特别地，当日光和紫外线直接辐照到皮肤上时，会产生大量自由基，并且这些自由基可损害皮肤的抗氧化防御系统，从而增加皱纹、使皮肤松弛并加速皮肤老化。因此，为了减少皮肤皱纹并保持弹性，有必要通过抑制活性氧类和自由基的产生、抑制炎性应答以及促使伤口的皮肤再生来保护皮肤。
已知有效减少皮肤皱纹的物质包括腺苷和视黄酸。然而，腺苷在临床实践中几乎没有效力，并且视黄酸不能用于孕妇并且具有副作用，例如红斑。因此，包含来源于植物或天然产物的活性成分的用于皮肤抗老化的功能性化妆品最近引起了关注。然而，包含植物提取物作为活性成分的功能性化妆品具有以下问题：它们在施加至皮肤之后在其蒸发期间可引起异物感，并且其作用持续时间短。
最近，有报道称细胞分泌组(secretome)包含调节细胞行为的多种生物活性分子。特别地，细胞分泌组包含具有细胞间信号传导功能的“外排体(exosome)”，并且因此已积极地对其组分和功能进行了研究。
细胞向其胞外环境释放多种膜囊泡，并且这些释放的囊泡通常称为胞外囊泡(Extracellular vesicle，EV)。EV也被称为细胞膜来源囊泡、核外颗粒体(ectosome)、脱落囊泡、微粒、外排体等，并且在一些情况下也与外排体区别使用。
外排体是尺寸为数十至数百纳米的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成。该外排体包含被称为外排体载物(cargo)的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知，外排体载物包括范围广泛的信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性且根据分泌细胞的环境而受到不同调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传输的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。根据外排体来源于其中的细胞的性质和状态，外排体包含特定的遗传物质和生物活性因子。来源于增殖中干细胞的外排体调节细胞行为，例如细胞迁移、增殖和分化，并且概括参与组织再生的干细胞的功能(Nature Review Immunology 2002(2)569-579)。
已知称为细胞的“化身”的外排体不仅会从干细胞和癌细胞中释放，而且从多种生物体(例如植物、细菌、真菌和藻类)的细胞中释放。例如，外排体可从酵母的条件培养基或发酵产物以及间充质干细胞的条件培养基和成纤维细胞的条件培养基中分离。
酵母用于制备多种发酵食品，并且已知在酿造酒精饮料的过程中获得的酵母发酵产物对皮肤状况的改善具有作用。然而，关于分离、纯化和表征来源于酵母的外排体的研究仍然不足。因此，需要对来源于酵母的外排体进行更详细的表征和功能性研究。
在这方面，发酵化妆品最近已经广受欢迎，并且化妆品中使用的酵母类型也已增多。约数百种类型的酵母用作化妆品成分，并且在发酵化妆品成分中，半乳糖酵母发酵滤液获得了最佳的消费者响应。半乳糖酵母是在着眼于以下事实研究多种酵母的过程中发现的一种酵母属：酿造精制米酒的工匠的手的皮肤对于其年龄来说是具有弹性且干净的。半乳糖酵母发酵滤液富含维生素、矿物质、氨基酸、有机酸、酶、酵母肽等。然而，半乳糖酵母发酵滤液可在其皮肤对发酵成分敏感的人中引起副作用，例如皮肤问题、皮肤发红或皮炎。
本发明人已经发现来源于半乳糖酵母的外排体在皮肤再生、皮肤弹性改善和/或皮肤皱纹减少等方面是有效的，并且已经开发了用于皮肤再生、皮肤弹性改善或皮肤皱纹减少的化妆品组合物，其包含来源于半乳糖酵母的外排体作为活性成分。
同时，应理解的是，作为背景技术描述的内容仅旨在帮助理解本发明的背景，并不被认为是针对本发明的现有技术。
发明内容
技术挑战
本发明的一个目的是提供用于皮肤再生、皮肤弹性改善或皮肤皱纹减少的化妆品组合物，其包含来源于半乳糖酵母的外排体作为活性成分。
然而，如上所述的本发明目的是举例说明性的并且本发明的范围不受此限制。另外，通过以下描述、所附权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将变得更加明显。
技术方案
本发明提供了用于皮肤再生、皮肤弹性改善或皮肤皱纹减少的化妆品组合物，其包含来源于半乳糖酵母的外排体(半乳糖酵母来源外排体)作为活性成分。
本文中使用的术语“半乳糖酵母”是双足囊菌科(Dipodascaceae)中的一种真菌属，并且是指用于酿造或发酵过程的半乳糖酵母属的酵母。多种用于通过使谷物发酵来酿造酒精饮料的过程的半乳糖酵母菌株是已知的。
本文中使用的术语“外排体”是指从酵母分泌或释放到胞外空间中并具有膜结构的纳米尺寸的囊泡，并且还被称为外排体样囊泡或外排体样颗粒。
本文中使用的术语“来源于半乳糖酵母的外排体(半乳糖酵母来源外排体)”意指包括从半乳糖酵母的条件培养基或半乳糖酵母发酵物、或者从与其等同的半乳糖酵母的生物溶液中分离的，或者从半乳糖酵母本身分泌和/或释放的所有外排体。
本文中使用的术语“皮肤弹性”是指其中当去除外力时，由外力引起的变形的皮肤容易恢复其原始形状的特征。术语“皮肤皱纹”是指由皮肤老化引起的细纹。皮肤皱纹可由遗传因素、皮肤真皮中存在的胶原蛋白和弹性蛋白的减少、外部环境因素等引起。因此，本文中使用的术语“皮肤皱纹减少或改善”是指抑制或防止皮肤上皱纹的形成，或减少已经形成的皱纹。
在根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物中，半乳糖酵母来源外排体可从半乳糖酵母的条件培养基或半乳糖酵母发酵物中分离。
根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物可以是例如霜或乳液。
同时，在不损害本发明效果的范围内，根据需要，根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物可适当地包含化妆品产品中通常使用的组分，例如，保湿剂、抗氧化剂、油性组分、UV吸收剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂、醇、粉组分、着色剂、水性组分、水和多种皮肤营养素等。
此外，在不损害效果(例如，皱纹改善、皮肤再生、皮肤弹性改善、皮肤美容等)的范围内，根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物除半乳糖酵母来源外排体之外，还可包含在现有技术中已使用的用于改善皮肤状况的试剂和/或保湿剂。例如，本发明的半乳糖酵母来源外排体可被包含在以下的至少一种中或与以下的至少一种混合：水凝胶、透明质酸、透明质酸的盐(例如，透明质酸钠等)或透明质酸凝胶。在根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物中，水凝胶的种类没有特别限制，但是水凝胶可优选地通过将胶凝聚合物分散在多元醇中来获得。胶凝聚合物可以是选自以下的至少一种：普朗尼克、纯化琼脂、琼脂糖、结冷胶、藻酸、卡拉胶、肉桂胶、黄原胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、果胶、纤维素、瓜尔胶和槐豆胶，并且多元醇可以是选自以下的至少一种：乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油。
根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物可以以多种形式使用，例如，贴剂片装面膜面膜巾霜活肤水软膏混悬剂乳剂糊剂乳液凝胶剂油剂剥撕式面膜喷雾剂气雾剂雾剂粉底粉和油纸例如，可将化妆品组合物施加至贴剂、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或者浸在所述贴剂、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。
所述化妆品组合物用于皮肤再生、皮肤弹性改善、皱纹改善等目的，并且所述化妆品组合物可制备为本领域中通常制备的任何制剂。例如，其可配制为：贴剂、片装面膜、面膜巾、皮肤软化剂营养品收敛乳液滋养霜按摩霜眼霜清洁霜精华眼部精华清洁乳液清洁泡沫清洁水防晒霜唇膏肥皂洗发香波含表面活性剂的清洁剂浴用制剂身体洗剂身体霜身体油身体精华身体清洁剂染发剂生发剂等，但不限于此。
根据本发明的一个实施方案的化妆品组合物包含化妆品产品中通常使用的组分。例如，化妆品组合物可包含常规的辅料和载体，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料。另外，根据化妆品组合物的类型或预期用途，本领域技术人员可毫无困难地适当选择化妆品组合物的每种制剂中的其他组分。
本发明的另一个实施方案提供了用于除治疗目的之外，使用所述化妆品组合物来调节哺乳动物皮肤状况的美容方法。在本发明的美容方法中，表述“调节皮肤状况”意指改善皮肤状况和/或预防性地调节皮肤状况，并且表述“改善皮肤状况”意指皮肤组织的外观和感觉的视觉上和/或触觉上可感知的积极变化。例如，表述“改善皮肤状况”可包括皮肤再生、皮肤弹性改善和/或皮肤皱纹减少。
根据本发明的一个实施方案的美容方法包括：(a)将所述化妆品组合物直接施加至哺乳动物皮肤；或者(b)使贴剂、片装面膜或面膜巾与哺乳动物皮肤接触或附着至哺乳动物皮肤，所述贴剂、片装面膜或面膜巾具有向其施加或浸在其中的所述化妆品组合物；或者先后进行(a)和(b)。在步骤(a)中，化妆品组合物可以是乳液或霜。
或者，根据本发明的一个实施方案的美容方法可还包括(c)在步骤(b)之后从哺乳动物皮肤去除贴剂、片装面膜或面膜巾，以及将所述化妆品组合物施加至哺乳动物皮肤。在步骤(c)中，所述化妆品组合物可以是乳液或霜。
在根据本发明的一个实施方案的美容方法中，哺乳动物可以是人、狗、猫、啮齿动物、马、牛、猴或猪。
有益效果
与半乳糖酵母条件培养基的滤液相比，根据本发明的用于皮肤再生、皮肤弹性改善或皮肤皱纹减少的包含来源于半乳糖酵母的外排体作为活性成分的化妆品组合物对皮肤再生、皮肤弹性改善和/或皮肤皱纹减少具有更好的作用。因此，本发明的化妆品组合物对皮肤再生、皮肤弹性改善和/或皮肤皱纹减少具有优异的作用。
应当理解，本发明的范围不限于上述效果。
附图说明
图1A示出了根据本发明的一个实施方案获得的半乳糖酵母来源外排体的通过透射电子显微术(transmitted electron microscopy，TEM)获得的颗粒图像。图1B示出了图1A的放大的颗粒图像。
图2A和2B是示出了半乳糖酵母来源外排体的NTA分析结果的图。
图3描绘了显示经荧光染色的外排体被递送到人真皮成纤维细胞中的细胞的荧光显微图像(绿色：递送到细胞中的外排体；蓝色：细胞核；以及红色：细胞膜)。
图4描绘了显示在将人真皮成纤维细胞用不同浓度的半乳糖酵母来源外排体处理并随后培养24小时时提高的相对胶原蛋白量的图。
图5描绘了显示在将人真皮成纤维细胞用不同浓度的半乳糖酵母来源外排体或半乳糖酵母条件培养基的滤液处理并随后培养48小时时提高(或降低)的相对胶原蛋白量的图。
具体实施方式
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅是举例说明本发明并且不旨在限制或约束本发明的范围。本领域技术人员可从本发明的详细描述和实施例中容易地推断出的那些被解释为落入本发明的范围内。本发明中提及的参考文献通过引用并入本文。
应当理解的是，在本说明书通篇，当任何部分被提及“包含”任何组分时，除非另外指明，否则其不排除其他组分，而是还可包含其他组分。
实施例
实施例1：半乳糖酵母来源外排体的制备
将用于酿造或发酵的可商购半乳糖酵母菌株白地霉(G.candidum)和地霉半乳糖酵母(G.geotrichum)振荡培养，并随后通过离心使条件培养基沉淀并除去沉淀的半乳糖酵母细胞。
将通过上述过程获得的半乳糖酵母条件培养基的上清液通过0.22-μm的过滤器过滤，以除去杂质，例如细胞碎片、废物和大颗粒。通过切向流过滤(tangential flowfiltration，TFF)方法从经过滤的半乳糖酵母条件培养基中分离半乳糖酵母来源外排体。
通过透射电子显微术(TEM)分析分离的半乳糖酵母来源外排体的尺寸。如图1A和1B中所示，确定了分离的半乳糖酵母来源外排体是纳米尺寸的囊泡。使用NS300(购自Malvern Panalytical)，通过纳米粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)分析了半乳糖酵母来源外排体的尺寸和浓度(图2A和2B)。
实施例2：半乳糖酵母来源外排体向真皮成纤维细胞中的递送能力的评价
为了检查半乳糖酵母来源外排体是否会被递送到人真皮成纤维细胞(购自CEFOCo.，Ltd.)中，进行了以下分析。为了对实施例1中制备的半乳糖酵母来源外排体的膜进行荧光染色，使外排体与PKH67荧光染料(购自Sigma-Aldrich)反应。在反应之后，将反应溶液用MW3000柱(购自ThermoFisher Scientific)分级，以除去在外排体膜中未被染色的游离PHK67。通过使PKH67荧光染料与缓冲溶液反应并用MW3000柱对反应产物进行分级来制备阴性对照。将用PKH67染色的外排体与预培养的人真皮成纤维细胞一起孵育，并随后使用荧光显微镜观察外排体是否会随时间被递送到细胞中。使用Hoechst荧光染料(购自Sigma-Aldrich)对细胞核进行染色，以及使用CellMask橙色质膜染色荧光染料对细胞膜进行染色。作为检查外排体是否会被递送到细胞中的结果，确定了经荧光染色的外排体被递送到细胞中并且绿色荧光在细胞中随时间累积(图3)。
实施例3：刺激胶原蛋白产生的作用的评价
将分散在包含胎牛血清的DMEM培养基中的人真皮成纤维细胞(购自CEFO Co.，Ltd.)分配到多孔板中，并随后培养24小时，并在无血清培养基中另外培养24小时。此后，将实施例1中制备的半乳糖酵母来源外排体在不同浓度的无血清培养基中稀释，并随后将人真皮成纤维细胞用每种稀释物处理并培养。此后，收集培养基并将其离心，并随后制备经离心的培养基。使用针对I型前胶原蛋白C-肽(PIP)的EIA试剂盒(购自Takara Bio)，测量由人真皮成纤维细胞合成并在培养基中累积的胶原蛋白的量。用BCA蛋白质测定试剂盒(购自ThermoFisher Scientific)测量细胞裂解物的总蛋白质量。通过总蛋白质量将胶原蛋白的量归一化，并计算胶原蛋白的相对量。作为在通过半乳糖酵母来源外排体处理的人真皮成纤维细胞培养24小时之后测量胶原蛋白量的结果，确定了半乳糖酵母来源外排体剂量依赖性地提高了人真皮成纤维细胞中的胶原蛋白合成(图4)。
另外，将实施例1中制备的经过滤的半乳糖酵母条件培养基在无血清培养基中稀释至20％、6％和2％的浓度，并随后将人真皮成纤维细胞用每种稀释物处理并培养。此外，将实施例1中制备的半乳糖酵母来源外排体在不同浓度的无血清培养基中稀释，并随后将人真皮成纤维细胞用每种稀释物处理并培养。在地霉半乳糖酵母(Galactomycesgeotrichum)的情况下，对人真皮成纤维细胞进行处理的半乳糖酵母来源外排体的浓度分别为2.8×109个颗粒/mL(对应于20％的经过滤的地霉半乳糖酵母条件培养基)、1.0×109个颗粒/mL(对应于7.1％的经过滤的地霉半乳糖酵母条件培养基)和3.0×108个颗粒/mL(对应于2.0％的经过滤的地霉半乳糖酵母条件培养基)。在白地霉(Galactomyces candidum)的情况下，对人真皮成纤维细胞进行处理的半乳糖酵母来源外排体的浓度分别为4.5×109个颗粒/mL(对应于20％的经过滤的白地霉条件培养基)、1.0×109个颗粒/mL(对应于4.5％的经过滤的白地霉条件培养基)和3.0×108个颗粒/mL(对应于1.3％的经过滤的白地霉条件培养基)。作为在通过半乳糖酵母来源外排体处理的人真皮成纤维细胞培养48小时之后测量胶原蛋白量的结果，确定了半乳糖酵母来源外排体剂量依赖性地提高了人真皮成纤维细胞中的胶原蛋白合成(图5A和5B)。
在地霉半乳糖酵母的情况下，与用20％的经过滤的地霉半乳糖酵母条件培养基进行的处理相比，用2.8×109个颗粒/mL的半乳糖酵母来源外排体(对应于20％的经过滤的地霉半乳糖酵母条件培养基)进行的处理显示出胶原蛋白合成的显著提高，并且用2％的经过滤的地霉半乳糖酵母条件培养基进行的处理反而抑制了胶原蛋白的合成(图5A)。
在白地霉的情况下，与用6％的经过滤的白地霉条件培养基进行的处理相比，用1.0×109个颗粒/mL的半乳糖酵母来源外排体(对应于4.5％的经过滤的白地霉条件培养基)进行的处理显示出胶原蛋白合成的显著提高，尽管以条件培养基表示的半乳糖酵母来源外排体的浓度低于6％的经过滤的白地霉条件培养基。此外，与20％的经过滤的白地霉条件培养基相比，用4.5×109个颗粒/mL的半乳糖酵母来源外排体(对应于20％的经过滤的白地霉条件培养基)进行的处理显示出胶原蛋白合成的显著提高。此外，与用2％的经过滤的白地霉条件培养基进行的处理相比，用3.0×108个颗粒/mL的半乳糖酵母来源外排体(对应于1.3％的经过滤的白地霉条件培养基)进行的处理显示出胶原蛋白合成的提高，尽管以条件培养基表示的半乳糖酵母来源外排体的浓度低于2％的经过滤的白地霉条件培养基。
根据以上结果，确定了与半乳糖酵母条件培养基的滤液相比，用于皮肤再生、皮肤弹性改善或皮肤皱纹减少的包含半乳糖酵母来源外排体作为活性成分的化妆品组合物具有作为功能性化妆品组合物的有用功能活性(即，显著提高胶原蛋白合成的活性)。因此，本发明的半乳糖酵母来源外排体可用作用于功能性化妆品组合物的活性成分。
尽管已参照一些实施方案描述了本发明，但是本发明的范围不限于这些实施方案。本领域的任何技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种修改和改变，并且这些修改和改变也落入本发明的范围内。
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