可代谢的ph敏感聚合物囊泡
阅读说明：本技术 可代谢的ph敏感聚合物囊泡 (Metabolizable pH-sensitive polymersome ) 是由 朱塞佩·巴塔利亚 亚历山德罗·波马 丹尼斯·赛钦 于 2019-04-11 设计创作，主要内容包括：本申请涉及pH敏感聚合物囊泡。聚合物囊泡能够在核内体的温和酸性pH下降解为可再次吸收的材料,这还使得避免脂质体一旦被内化在细胞内,有效载荷的脂质体过早降解。因此,该聚合物囊泡可用于治疗或预防疾病的方法中。(The present application relates to pH sensitive polymersomes. The polymersomes are capable of degrading to resorbable materials at the mildly acidic pH of endosomes, which also allows for the avoidance of premature degradation of the payload liposome once the liposome is internalized within the cell. Thus, the polymersome can be used in a method for treating or preventing a disease.)
技术领域
本发明涉及可代谢的pH敏感聚合物囊泡。该聚合物囊泡由FDA和MHRA归类为公认安全(Generically recognized as safe，GRAS)的可代谢材料制成。已经使用具有咪唑环的衍生物作为两亲性嵌段共聚物的疏水部分。一类示例性聚合物，聚丙烯((((1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯(Polypropylene((((1H-imidazol-5-yl)acetamido)-3-oxopropyl)thio)succinate，PPITS)及其衍生物是pH敏感的，在中性pH下为疏水的，在弱酸性pH下为亲水的，其水解产物将被肝脏代谢或作为克雷布斯循环(Krebscycle)的成分被重新吸收。因此，该聚合物囊泡可用于治疗或减轻糖尿病、癌症、传染性和自身免疫性疾病的症状的方法。
背景技术
对于有效且安全的疾病管理至关重要的是，需要使用一种将有助于患者依从性的途径，将药理剂量的药物高效递送至目标部位。
聚合纳米载体正用于解决药物递送中的关键问题：装载足够剂量的活性物质，在体内保护其免受周围环境的影响，并在不引起系统毒性的情况下将其稳定释放到目标部位。
细胞内递送药物已经引起了越来越多的研究兴趣，这主要是由于其在若干疾病中的重要作用和功能。亚细胞靶向对于有效的特异性治疗至关重要，因此必须克服特定的障碍。当药物有效地治疗或减轻诸如癌症、阿尔茨海默氏病、糖尿病、传染性和自身免疫性疾病等疾病的症状时，细胞器靶向的重要性就会提高。具体而言，细胞内环境包含负责细胞生长、增殖、分化和死亡的化合物，因此这些化合物是有希望的药物靶标。因此，靶位点可分布于整个细胞质、细胞核、线粒体、内质网(Endoplasmic reticulum，ER)和高尔基复合体。然而，pH低且富含酶的核内体和溶酶体会导致药物降解或非特异性分布。因此，纳米材料的尺寸、电荷和表面组成的调节可指示内化通路，使纳米材料能够逃避溶酶体并与其靶细胞器相互作用。确实，纳米材料克服这种障碍的潜力已导致聚合物、例如聚[丙烯(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯](PPITS)及其衍生物的开发，其能够通过利用其pH敏感性来提高药物的生物利用度和细胞内递送。
使用PPITS及其衍生物形成的纳米囊泡很重要，因为其使药物能够越过生理屏障安全且可持续地到达其靶位点。实际上，纳米囊泡提供了稳定的生物相容性环境来封装药物，促进药物细胞内释放和有效吸收。纳米囊泡还通过以特定方式驱使药物朝向作用位点并增加病理区域中药物的浓度来改善治疗效果的持续时间，并将不良反应最小化。
pH敏感智能聚合物包含弱酸性或弱碱性官能团，这些官能团会根据局部pH接受或失去质子。这在核内体水平上刺激了聚合物的降解，提供了细胞内释放并避免了有效载荷的溶酶体降解。
这种聚合物的开发通常采用“点击”化学方法，包括炔烃-叠氮化物环加成反应、狄尔斯-阿尔德(Diels–Alder)反应、硫醇-烯加成反应以及其他偶联策略(例如迈克尔(Michael)加成反应)，从而增加了能接近的大分子结构的多样性。炔烃-叠氮化物环加成反应是对预形成的大分子的修饰及其合成进行最广泛研究的点击反应之一。狄尔斯-阿尔德环加成反应已用于构建一系列大分子，其热敏可逆性为开发用于药物递送的可降解的纳米载体提供了平台。
聚合物上的咪唑基团展示出用于避免溶酶体降解的期望的pH范围内的pKa。然而，pKa值也可通过修饰咪唑环周围不同取代基的位置和性质来进一步调整。通过利用聚(富马酸丙酯)(PPF)中存在的双键或聚(马来酸丙酯)(PPM)异构化后出现的双键、以及在原始PPM上通过硫醇-烯加成反应使叔丁基半胱氨酸共轭来引入PH敏感性。这仅仅是涉及聚合物结构内双键的可能的共轭化学(例如，狄尔斯-阿尔德醛醇缩合反应)的一个例子。半胱氨酸N末端可与含咪唑或甲基咪唑的酸共轭，包括1H-咪唑-1-乙酸(pKa 6.8)、4-咪唑乙酸(pKa6.6)、二甲基咪唑乙酸(pKa 6.4)和甲基咪唑乙酸(pKa 6.2)。该共轭反应可通过本领域技术人员已知的NHS化学或其他类型的共轭反应在硫醇-烯加成反应之前或之后进行。类似地，在氨基基团上进行保护(用叔丁氧基羰基部分)的和具有游离羧基基团的相同的半胱氨酸衍生物也可与相同的咪唑部分(但衍生自组胺衍生物)共轭。在所有情况下，所有这些结构都是组氨酸代谢和/或组胺分解代谢的代谢产物部分，并且它们将使最终的聚合物pKa从6.2调节到6.8。此外，可通过向聚合混合物中添加饱和单体(例如琥珀酸(在缩聚的情况下)或琥珀酸酐(在开环共聚或ROCOP的情况下))来调节官能度的数目，从而创建一系列的饱和和不饱和聚酯。
调节化学性质使得创建具有增强的细胞内递送、具有逃避过早的溶酶体降解并到达特异性细胞内靶标的能力的官能化聚合物囊泡成为可能。
发明内容
本发明提供聚合物囊泡，该聚合物囊泡包括：(a)蛋白质排斥聚合物；和(b)包含pKa为4至7的侧基的pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物。
聚合物囊泡(由两亲性嵌段共聚物形成的囊泡)是脂质体的聚合等效物。由于聚合物囊泡的大分子性质，已知聚合物囊泡比其脂质对应物更为坚固和稳定。另外，聚合物囊泡的大分子性质还允许非常有效地调节膜厚度。先前已经开发出对pH敏感的聚合物囊泡，并示出了能够将某些类型的分子递送至细胞胞液的能力。
现已发现，包含组分(a)和(b)的聚合物囊泡提供了能够在生理pH下自组装成坚固的聚合物囊泡的共聚物，该聚合物囊泡随后能够在温和酸性的细胞内pH(核内体)下分解成可再次吸收的材料。
已经发现，聚合物囊泡内的组分(a)和(b)协同地作用。组分(a)是蛋白质排斥的，并且可选择性地靶向由疾病细胞表达的受体。组分(b)是可生物降解的聚合物，其通过原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)来释放分子，例如富马酸酯、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。本发明的聚合物囊泡结合调节的固有pH敏感性的能力显著增强了细胞内药物递送，同时还避免了有效载荷的溶酶体降解。
本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含：多个本发明的聚合物囊泡；和一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
附图说明
图1示出了如在实施例部分中进一步描述的PMPC-PPITS聚合物囊泡的透射电子显微镜图像(比例尺为50nm)；
图2示出了如在实施例部分中进一步描述的PMPC-PPITS的NMR表征(在8.7和7.4的峰对应于咪唑环质子)；
图3示出了如在实施例部分中进一步描述的PMPC-PPITS的pH滴定。该聚合物在酸性pH下用0.5N HCl溶解。向溶液中缓慢添加0.5N NaOH至pH 12。
具体实施方式
聚合物囊泡(Polymersome)
本发明的聚合物囊泡包含：(a)蛋白质排斥聚合物；和(b)包含pKa为4至7的侧基的pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物。
聚合物囊泡是由两亲性嵌段共聚物形成的合成囊泡。在过去的15年中，聚合物囊泡由于其具有胶体稳定性、可调节的膜特性以及封装或整合其他分子的能力，因此作为多功能载体而受到了广泛的研究关注(一个代表性综述文章，参见J Control Release 2012161(2)473-83，其内容通过引用整体并入本文)。
用于本发明的聚合物囊泡通常是自组装结构。聚合物囊泡通常包含两亲性嵌段共聚物。两亲性嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段。在本发明的聚合物囊泡中，亲水性嵌段通常包含：蛋白质排斥聚合物(a)，其通常包含磷酰胆碱侧基；疏水性嵌段(b)，其是包含pKa为4至7的侧基的pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物，例如聚丙烯((((1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯(PPITS)聚合物或其衍生物。
这种聚合物囊泡能够模仿生物磷脂。这些聚合物的分子量比天然存在的磷脂基表面活性剂高得多，因此它们可组装成更加缠绕的膜(J.Am.Chem.Soc.2005,127,8757，其内容通过引用整体并入本文)，从而提供具有改善的机械性能和胶体稳定性的最终结构。此外，共聚物合成的柔性性质允许在宽范围的分子量以及由此的膜厚度上应用不同的组成和官能度。因此，将这些嵌段共聚物用作递送载体提供了显著优点。
聚合物囊泡通常是基本上球形的。聚合物囊泡通常包含双层膜。双层通常由两层两亲性分子形成，该两层两亲性分子对齐以形成封闭的核，其中亲水性头基面对该核和囊泡的外部，而亲水性尾基形成膜的内部。
聚合物囊泡的典型(最大)直径在50nm至5000nm的范围内。更典型地，直径在50nm至1000nm的范围内。直径在该范围内的聚合物囊泡通常被称为“纳米聚合物囊泡”或“纳米囊泡”。纳米聚合物囊泡的形状优选地是基本上球形的。典型地，纳米聚合物囊泡的数均直径小于300nm，优选小于250nm，最优选小于200nm或150nm。双层的厚度通常为2nm至50nm，更典型地为5nm至20nm。这些尺寸可常规地测量，例如通过使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)和/或小角度X射线散射(Small Angle X-rayScattering，SAXS)来测量(参见，例如，J.Am.Chem.Soc.127 8757 2005，其内容通过引用整体并入本文)。
在水溶液中，通常在不同类型的结构之间，例如在聚合物囊泡和胶束之间存在平衡。优选溶液中结构的至少80wt％、更优选至少90wt％或95wt％、最优选所有结构均以聚合物囊泡形式存在。这可使用本文概述的方法来实现。
在向对象给药后，聚合物囊泡通常在体内释放例如富马酸酯和丙二醇、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。通常，聚合物囊泡解离，并且由于聚合物(b)的原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)，富马酸酯和丙二醇、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑被释放。当起始材料的富马酸酯主链在官能化(连接侧基)过程中未完全饱和时，则聚合物囊泡在解离时释放富马酸酯。
在一个优选的实施方式中，聚合物(b)为或包含聚丙烯((((1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯或其衍生物。更优选地，聚合物(b)为或包含聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]。
聚[丙烯(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]聚合物或其衍生物，例如聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]是水解可以释放富马酸酯、丙二醇、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑的聚合物的实例。当起始材料的富马酸酯主链在官能化(连接侧基)过程中未完全饱和时，则聚合物囊泡在解离和随后降解时释放富马酸酯。
如果聚合物囊泡包含封装在聚合物囊泡中的药物，那么在向对象给药后，聚合物囊泡还能够在体内释放药物。同样，通常聚合物囊泡解离，从而释放出药物。
如已经解释的，聚合物囊泡的组分(a)是蛋白质排斥聚合物，一旦被注射，该蛋白质排斥聚合物使纳米颗粒的循环半衰期延长。组分(b)是pH敏感的，并且通常通过原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)来释放例如富马酸酯和丙二醇、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。因此，在聚合物囊泡已在细胞内被内化后，封装的药物(如果有的话)被释放。
聚合物囊泡的解离可以通过多种机制来促进，但是通常通过疏水性嵌段共聚物的水解来促进。通常，聚合物主链中的酯键通过原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)被水解，释放例如富马酸酯、丙二醇(一种代谢产物，其被肝脏迅速(半衰期2小时)代谢以形成乳酸盐、乙酸盐和丙酮酸盐)、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。该过程由称为酯酶的酶和酸性pH来催化。两种情况都是内溶酶体区室的典型情况，聚合物囊泡在吞噬作用下向溶酶体区室中迁移。
通常，聚合物(b)包含咪唑基团(通常作为侧基)，通常其pKa在6.4至7的范围内。内吞作用的过程包括聚合物囊泡所经历的局部pH从大约pH 7.4降低至大约pH 5-6。该pH下降通常足以触发聚合物囊泡的崩解。
pKa意指一半侧基被离子化时的pH。pKa可以通过多种方法来确定，包括pH滴定，之后是电位滴定、UV光谱和动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)。应根据被分析的共聚物及其在测试介质中的溶解度来选择适当的方法以测量pKa。
DLS是用于测量pKa的特别优选的方法。如在J.Am.Chem.Soc 2005 12717982-17983(其内容通过引用整体并入本文)中所指出的，在水中来自共聚物(例如PMPC25-b-PDPA20共聚物)的DLS信号随pH而变化。在一定的pH下，信号随着共聚物经历从分子上解离到缔合的转变而迅速增加。将pKa视为该快速增加的中点的pH。这些实验在Biomacromolecules 2006,7,817-828中有进一步描述，其内容通过引用整体并入本文。在该参考文献中，对嵌段共聚物的胶束进行了实验，但是当相变涉及聚合物囊泡形成时，也可以应用该技术。
聚合物中基团的pKa是基于聚合物系统确定的(并且不假定与非聚合物系统中相似部分的pKa相同)。
通常，聚合物囊泡的聚合物(b)的侧基包含可阳离子化的部分。可阳离子化的部分为，例如伯胺、仲胺或叔胺或咪唑基团，其能够在低于3至6.9范围内的pH值下被质子化。可选择地，该基团可以是膦。这些可阳离子化的部分可固有地存在于单体单元内，或者可选择地通过利用合适的共轭策略(例如，对富马酸酯主链的双键进行硫醇-烯加成反应)而共轭之后聚合。优选地，可阳离子化的部分是咪唑。
优选地，侧基的pKa在4.0至6.9的范围内，更优选在5.5至6.9的范围内。聚合物囊泡相应地能够在这种pH范围内解离。
PPITS聚合物或其衍生物上的咪唑基团展示出用于避免溶酶体降解的期望的pH范围内的pKa。然而，pKa值也可通过修饰咪唑环周围不同取代基的位置和性质来进一步调整。通过利用聚(富马酸丙酯)(PPF)中存在的双键或聚(马来酸丙酯)(PPM)异构化后出现的双键、以及在原始PPM上通过硫醇-烯加成反应使叔丁基半胱氨酸共轭来引入PH敏感性。这仅仅是涉及聚合物结构内双键的可能的共轭化学(例如，狄尔斯-阿尔德醛醇缩合反应)以及共轭模体(例如氨基酸、DNA、寡肽、完整蛋白质、药物，等等)的一个例子。聚合物结构内的双键可以被完全或部分官能化。当聚合物结构内的双键被部分官能化时，形成在主链中同时包含饱和(例如，琥珀酸酯)和不饱和(例如，富马酸酯)单体单元的聚合物。半胱氨酸N末端可与含咪唑或甲基咪唑的酸共轭，包括1H-咪唑-1-乙酸(pKa 6.8)、4-咪唑乙酸(pKa 6.6)、二甲基咪唑乙酸(pKa 6.4)和甲基咪唑乙酸(pKa 6.2)。该共轭反应可通过本领域技术人员已知的NHS化学或其他类型的共轭反应在硫醇-烯加成反应之前或之后进行。类似地，在氨基基团上进行保护(用叔丁氧基羰基部分)的和具有游离羧基基团的相同的半胱氨酸衍生物也可与相同的咪唑部分(但衍生自组胺衍生物)共轭。在所有情况下，所有这些结构都是组氨酸代谢和/或组胺分解代谢的代谢产物部分，并且它们将使最终的聚合物pKa从6.2调节到6.8。此外，可通过向聚合混合物中添加饱和单体(例如琥珀酸(在缩聚的情况下)或琥珀酸酐(在开环共聚或ROCOP的情况下))来调节官能度的数目，从而创建一系列的饱和和不饱和聚酯。
优选地，聚合物(b)(聚合物囊泡的疏水性嵌段)的聚合度至少为5，更优选地至少为10。优选地，聚合度不大于250，甚至更优选地，不大于200。优选地，蛋白质排斥聚合物(a)(亲水性嵌段)与聚合物(b)(疏水性嵌段)的聚合度的比例在1：2.5至1：8范围内。所有这些限制促进了聚合物囊泡的形成，而不是胶束的形成。
蛋白质排斥聚合物(a)可以基于缩聚物，例如聚酯、聚酰胺、聚酸酐、聚氨酯、聚醚(包括聚亚烷基二醇，尤其是PEG)、聚亚胺、多肽、聚脲、聚缩醛和多糖，但优选基于烯键式不饱和单体的受控自由基聚合。该蛋白质排斥聚合物优选包含磷酰胆碱作为侧基，在这种情况下，侧基可以存在于单体中并且在聚合过程中保持不变。或者，可以在聚合之后使单体的侧基衍生化以使其转变成磷酰胆碱基团。
在一个目前优选的实施方式中，该蛋白质排斥聚合物(a)由烯键式不饱和单体形成。非限制性的合适的烯键式不饱和单体具有通式(IV)
YBX(IV)，
其中：
Y是选自以下的烯键式不饱和基团：H2C＝CR-CO-A-、H2C＝CR-C6H4-A1-、H2C＝CR-CH2-A2-、R2O-CO-CR＝CR-CO-O-、RCH＝CH-CO-O-、RCH＝C(COOR2)CH2-CO-O-、
A为-O-或NR1；
A1选自键、(CH2)LA2和(CH2)LSO3 -，其中L为1至12；
A2选自键、-O-、-O-CO-、-CO-O、-CO-NR1-、-NR1-CO-、-O-CO-NR1-和-NR1-CO-O-。
R为氢或C1-4烷基；
R1为氢、C1-4烷基或BX；
R2为氢或C1-4烷基；
B为键，或为任选地包含一个或多个氟取代基的直链或支链的烷二基、亚烷基氧杂亚烷基、或亚烷基(低聚氧杂亚烷基)基团；以及
X为磷酰胆碱基团，即具有下式的基团
在通式(IV)的单体中，优选地烯键式不饱和基团Y为H2C＝CR-CO-A-。这种丙烯酸部分优选为甲基丙烯酸，即其中R为甲基；或为丙烯酸，其中R为氢。尽管该化合物可以是(甲基)丙烯酰胺基化合物(其中A为NR1)，在这种情况下R1优选为氢，或次优选为甲基，最优选地，该化合物为酯，即其中A为O。
在通式(IV)的单体中，特别是其中Y为优选的(烷基)丙烯酸基团时，B最优选为烷二基基团。当该基团的一些氢原子可以被氟原子取代时，优选地B为未取代的烷二基基团，最优选为具有2至6个碳原子的直链基团。
通式(IV)的特别优选的单体是2-甲基丙烯酰氧基乙基-磷酰胆碱(MPC)。可以使用具有上述通式的各单体的混合物，也可使用与其他单体例如与其他亲水性单体的混合物。
优选地，蛋白质排斥聚合物(a)为丙烯酸酯聚合物。丙烯酸酯聚合物是由一种或多种丙烯酸酯单体形成的聚合物。丙烯酸酯单体是包含可以被取代或未取代的丙烯酸酯基团(即CH2＝CH-COO-)的单体，因此包括甲基丙烯酸酯单体和由式(IV)覆盖的其他此类单体。优选地，蛋白质排斥聚合物(a)为包含磷酰胆碱侧基的聚合物。特别优选地，蛋白质排斥聚合物(a)为包含磷酰胆碱侧基的丙烯酸酯聚合物。例如，蛋白质排斥聚合物(a)可以包含式(I)的单元
其中Rp为氢或甲基且Ap为式(I')的基团
其中Xp为C1-6亚烷基基团。在一些情况下，Xp可以是一个或多个氨基酸，例如肽、二肽或寡肽。
优选地，Xp为C2-6亚烷基基团。优选地，Rp为甲基。在特别优选的实施方式中，磷酰胆碱聚合物为聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱。
可选择地，蛋白质排斥聚合物(a)可以为多肽，例如在Yakovlev and Deming,J.Am.Chem.Soc.,2015,137(12),pp 4078–4081中描述的那些，其通过引用整体并入本文。例如，蛋白质排斥聚合物(a)可以包含聚(L-磷酰胆碱丝氨酸)或聚(L-磷酰胆碱高丝氨酸)。
可选择地，可以将蛋白质排斥聚合物(a)与由环氧化物、酸酐、丙交酯和/或CO2产生的聚合物偶联，以产生聚酯和聚碳酸酯。例如，在Shyeni and Williams,Chem.Commun.,2015,51,6459中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
通常，pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物(b)上的侧基的pKa为5.5至7，优选为6.2至7。
通常，pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物(b)在聚合物主链中包含琥珀酸酯单体单元。pH敏感可生物降解的聚合物(b)可以在聚合物主链中包含琥珀酸酯和富马酸酯单体单元的混合物。如本领域技术人员将容易理解的，例如，当从在聚合物主链中包含富马酸酯单体单元的聚合物开始时并且当向这些单体单元添加侧基的官能化(在每种情况下，导致富马酸酯单体单元转化为具有侧基的琥珀酸酯单体单元)是部分的但不完全(即，不是试剂聚合物中的所有富马酸酯单体单元都转化为具有侧基的琥珀酸酯单体单元)时，可以得到这种可生物降解的聚合物(b)。为避免疑义，本文定义的“包含pKa为4至7的侧基的pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物”包括：(i)由包含侧基的琥珀酸酯单体单元组成的聚合物；和(ii)同时含有包含侧基的琥珀酸酯单体单元和富马酸酯单体单元的聚合物。
优选地，pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物(b)在聚合物主链中还包含丙烯单体。
通常，pH敏感可生物降解的琥珀酸酯聚合物(b)上的侧基包含咪唑部分。
咪唑部分可以是咪唑或取代的咪唑，例如烷基取代的咪唑。咪唑可以是单取代的或多取代的。优选地，烷基取代基为甲基或乙基。
通常，咪唑部分是咪唑、甲基咪唑或二甲基咪唑。
优选的pH敏感可生物降解的富马酸酯聚合物(b)包括包含聚(丙烯(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯或其衍生物的那些聚合物。最优选地，聚合物(b)为或包含聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]。
在降解过程中，例如，聚合物(b)分子的水解，可以通过聚合物囊泡的原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)释放例如富马酸酯和丙二醇(一种代谢产物，其被肝脏迅速(半衰期2小时)代谢以形成乳酸盐、乙酸盐和丙酮酸盐)、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。
优选的聚合物(b)包含琥珀酸酯和丙烯单体。该聚合物的优点是其水解的副产物是丙二醇，丙二醇通常被认为是安全的材料，并且已经被批准用于若干临床应用。丙二醇被肝脏代谢以形成乳酸盐、乙酸盐和丙酮酸盐。未代谢的药物主要以葡糖苷酸缀合物的形式排泄在尿中，大约有12％至45％以不变的方式排泄在尿中。
更通常地，聚合物(a)和(b)之一或二者都可以包括共聚单体，例如以提供官能度、对疏水性的控制、对pH敏感性的控制、pKa或pKb(视情况而定)、对温度敏感性的控制或作为一般的稀释剂。例如，提供官能度的共聚单体可用于在聚合反应和/或聚合物囊泡形成之后提供侧基的共轭，以提供靶向部分或以提供生物活性分子与聚合物之间的共轭。可选择地，官能团可以允许聚合物囊泡形成后聚合物的交联，以赋予聚合物囊泡结构增加的稳定性。合适的共聚单体的实例为通式(VI)的化合物
其中
R18选自氢、卤素、C1-4烷基和基团COOR22，其中R22为氢或C1-4烷基；
R19选自氢、卤素和C1-4烷基；
R20选自氢、卤素、C1-4烷基和基团COOR22，条件是R18和R20不都是COOR22；以及
R21为1-10烷基、C1-20烷氧羰基、单(C1-10烷基)氨基羰基或二(C1-10烷基)氨基羰基、C6-20芳基(包括烷芳基)、C7-20芳烷基、C6-20芳氧羰基、C1-20-芳烷氧基羰基、C6-20芳氨基羰基、C7-20芳烷基-氨基、羟基或C2-10酰氧基基团，其中的任何一个可以具有一个或多个选自以下的取代基：卤素原子、烷氧基、低级烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、胺(包括烷基基团可以被取代的单烷基氨基和二烷基氨基和三烷基铵)、羧基、磺酰基、磷酰基、膦基(包括单烷基膦和二烷基膦和三烷基鏻)、两性离子、羟基基团、乙烯基氧羰基和其他乙烯基或烯丙基取代基、以及反应性甲硅烷基或甲硅烷氧基基团(例如三烷氧基甲硅烷基)；或R21和R20或R21和R19可以一起形成-CONR23CO，其中R23为C1-20烷基基团。
优选基团R18、R19、R20和R21中的至少两个基团为卤素，或更优选地，为氢原子。优选地，R18和R19都是氢原子。特别优选地，通式X的化合物为苯乙烯或丙烯酸化合物。在苯乙烯化合物中，R21代表芳基基团，特别是取代的芳基基团，其中取代基为氨基烷基基团、羧酸酯或磺酸酯基团。当共聚单体是丙烯酸类化合物时，R21为烷氧基羰基、烷基氨基羰基或芳氧基羰基基团。最优选地，在这种化合物中，R21为任选地具有羟基取代基的C1-20-烷氧基羰基基团。丙烯酸化合物通常是甲基丙烯酸，在这种情况下，R20是甲基。
优选地，共聚单体是非离子型共聚单体，例如(烷基)丙烯酸C1-24烷基酯或C1-24烷基(烷基)-丙烯酰胺、(烷基)丙烯酸单羟基-C1-6烷基酯或(烷基)丙烯酸二羟基-C1-6烷基酯或单羟基-C1-6烷基(烷基)-丙烯酰胺或二羟基-C1-6烷基(烷基)-丙烯酰胺、(烷基)丙烯酸低聚(C2-3烷氧基)C2-18烷基酯或低聚(C2-3烷氧基)C2-18烷基(烷基)-丙烯酰胺、苯乙烯、醋酸乙烯酯或N-乙烯基内酰胺。
为了最佳纳米囊泡的形成，嵌段共聚物应具有受控的分子量。每个嵌段优选具有在窄带内受控的分子量，即具有窄的多分散度。分子量的多分散度应例如优选小于2.0，更优选小于1.5，例如在1.1至1.4的范围内。
在本发明的一个优选的实施方式中，聚合物囊泡包含聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱和聚丙烯((((1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯(PPITS)或其衍生物。在该优选的实施方式中，聚合物囊泡通常包含嵌段共聚物，其中一个嵌段包含聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱，另一个嵌段包含聚丙烯((((1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯(PPITS)或其衍生物。在一个示例性实施方式中，聚合物囊泡包含含有聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱嵌段和聚丙烯((((1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯(PPITS)或其衍生物嵌段的嵌段共聚物。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，聚合物囊泡包含聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱和聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]。在该特别优选的实施方式中，聚合物囊泡通常包含嵌段共聚物，其中一个嵌段包含聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱，另一个嵌段包含聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]。在一个示例性实施方式中，聚合物囊泡包含含有聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱嵌段和聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯]嵌段的嵌段共聚物。
该嵌段共聚物可以是简单的A-B嵌段共聚物，或也可以是A-B-A或B-A-B嵌段线性三嵌段共聚物或(A)2B或A(B)2星型共聚物(其中A为含嵌段的磷酰胆碱聚合物，B为含嵌段的富马酸酯聚合物)。该嵌段共聚物也可以是A-B-C、A-C-B或B-A-C线性三嵌段共聚物或ABC星型共聚物，其中C是不同类型的嵌段。C嵌段可以例如，包括功能性的，例如交联或离子基团，以允许共聚物发生反应，例如在新型组合物中。交联反应，尤其是A-C-B型共聚物的交联反应，可以赋予聚合物囊泡有用的稳定性。交联本质上可以是共价的，有时也可以是静电式的。交联可以涉及添加单独的试剂以连接官能团，例如使用双官能烷化剂来连接两个氨基基团。可选择地，嵌段共聚物可以是具有亲水或疏水核的星型分子，或者可以是具有亲水主链(嵌段)和疏水侧链的梳状聚合物，反之亦然。这种聚合物可以例如通过单不饱和大分子单体与单体的无规共聚形成。
在WO 03/074090中可以找到合适的用于聚合单体的方法的更多细节，其内容通过引用整体并入本文。
用于聚合单体的方法是活性自由基聚合方法、官能化NCA(N-羧基酸酐)聚合、缩聚和开环聚合(Ring opening polymerisation，ROP)以及共聚(Copolymerisation，ROCOP)。在所有情况下，可通过利用带有适当模体的适当单体进行有效的后聚合修饰，该模体在与聚合方法相容性差的情况下得到合适的保护，如本领域技术人员众所周知的。通过凝胶渗透色谱法判断，已发现活性自由基聚合提供了多分散度(分子量)小于1.5的单体的聚合物。该嵌段或每个嵌段的多分散度在1.2至1.4的范围内是优选的。可以使用pH变化系统、电穿孔或膜水合来加载聚合物囊泡。在pH变化系统过程中，聚合物以离子化形式分散在水性液体中，其中聚合物以相对高的浓度溶解而不形成聚合物囊泡。随后改变pH，使得离子化基团中的一些基团或所有基团去变为质子化，使得它们呈非离子形式。在第二个pH下，嵌段的疏水性增加，聚合物囊泡自然形成。
形成在核中封装有药物的聚合物囊泡的方法可以涉及以下步骤：(i)将两亲性共聚物分散在有机介质中；(ii)通过注射泵将磷酸盐缓冲液添加到步骤(i)中形成的组合物中；(iii)如果药物是亲水的，则将药物添加至水相，或者如果药物是疏水的，则将药物添加至有机相；以及(iv)在添加结束时，将过量的PBS添加到制剂中，并通过使用透析管相对于无菌磷酸盐缓冲液进行透析而除去残留的有机溶剂。
该方法优选包括预备步骤，其中在反应容器中将两亲性共聚物分散在有机溶剂中，然后用注射泵添加磷酸盐缓冲液以形成聚合物囊泡。
步骤(ii)，改变溶剂并将pH增加到聚[丙烯(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯](PPITS)基团的pKa值以上。
形成在核中封装有药物的聚合物囊泡的另一种方法可以涉及以下步骤：(i)在反应容器中将两亲性共聚物以及疏水性和/或两亲性药物(当需要时)分散在有机溶剂中；(ii)蒸发溶剂以在反应容器的内部形成膜；以及(iii)用任选地包含增溶的亲水性药物的水溶液将膜再水化。
更详细地讲，聚合物囊泡通常是通过在玻璃容器中将共聚物溶解在有机溶剂(例如2：1的氯仿：甲醇混合物)中来制备的。如果要封装疏水性或两亲性药物，则可以将其与共聚物一起添加。可以在真空下蒸发溶剂，从而在容器壁上沉积共聚膜。然后用水溶液例如使用磷酸盐缓冲液将膜再水化。如果要封装亲水性药物，则可将其包括在水溶液中。将所得悬浮液的pH降低至大约为2的pH以溶解膜，然后缓慢升高pH至大约6。聚合物在中性pH下水化使得药物封装。然后可以例如使用台式挤出机对分散体进行超声和挤出。使用本领域公知的技术，可以使用UV光谱法和HPLC色谱法来计算封装效率。形成具有封装的药物的聚合物囊泡的另一种方法可以涉及药物和聚合物囊泡在水中的简单电穿孔。例如，药物可以固体形式与聚合物囊泡的水分散体接触，并施加电场以允许在聚合物囊泡膜上形成孔。然后，可溶的药物分子可以通过该孔进入聚合物囊泡。随后是膜自我修复过程，其中活性分子连续被包埋在聚合物囊泡内部。
可选择地，可以将溶解在有机溶剂中的药物乳化成聚合物囊泡的水分散体，从而将溶剂和药物掺入囊泡的核中，随后从系统中蒸发掉溶剂。
本发明中使用的聚合物囊泡可以由两种或更多种不同的嵌段共聚物形成。在该实施方式中，在形成聚合物囊泡的方法中，使用两种或更多种嵌段共聚物的混合物。
例如，在上述方法中，将0.01％至10％(w/w)的药物与共聚物混合。
封装的药物
本发明的聚合物囊泡可以包含封装在聚合物囊泡内的药物。
应当理解，本发明的聚合物囊泡能够通过原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)在体内降解为可再次吸收的材料，例如富马酸酯、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。聚合物囊泡还可提供药物封装。为避免疑义，也可以将多种不同的药物封装在单个聚合物囊泡中，或者提供多个均包含特定封装的药物的聚合物囊泡。
可以封装的特定药物的非限制性实例包括：肌肽、积雪草酸、类黄酮(例如，黄腐酚、柚皮素、高良姜精、非瑟酮和黄芩苷)、大麻素(例如，WIN55,212-2、JWH-133和TAK-937)、胞磷胆碱、米诺环素、脑活素、人参皂苷-Rd、粒细胞集落刺激因子、Tat-NR2B9c、镁、白蛋白、扑热息痛、阿司匹林、胆碱和水杨酸镁、塞来昔布、双氯芬酸(例如双氯芬酸钾、双氯芬酸钠)、双氟尼酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸盐、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生(包括萘普生钠)、奥沙普嗪、吡罗昔康、罗非考昔、双水杨酸酯、水杨酸钠、苏灵大、托美丁、伐地考昔、皮质类固醇、阿仑单抗、干扰素β-1b、芬戈莫德、醋酸格拉替雷、那他珠单抗、plegridy、聚乙二醇化干扰素β-1a、特立氟胺、氨甲蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗、优特克单抗、硫唑嘌呤、环孢菌素、英夫利昔单抗、戈利木单抗、塞妥珠单抗、羟氯喹、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、麦考酚酯、维生素A酸、羟基脲、异维A酸、麦考酚酸酯、柳氮磺吡啶、6-硫鸟嘌呤、钙泊三醇、骨化三醇、他卡西醇、他克莫司、吡美莫司、蒽三酚、恩达莫司汀、苯达莫司汀、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺、美法仑、普罗卡巴嗪、链脲菌素、替莫唑胺、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、放线菌素D、博来霉素、阿霉素、表柔比星、丝裂霉素、米托蒽醌、依托泊苷、多西他赛、伊立替康、紫杉醇、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、艾日布林、卡铂、顺铂、奥沙利铂、阿法替尼、阿柏西普、BCG、贝伐珠单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、狄诺塞麦、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、干扰素、易普利姆玛、拉帕替尼、帕尼单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、舒尼替尼、索拉非尼、曲妥珠单抗美坦、西罗莫司脂化物、曲妥珠单抗、维莫非尼、氯膦酸盐、伊班膦酸、氨羟二磷酸二钠、唑来膦酸、阿纳托唑、阿比特龙、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、布舍瑞林、环丙孕酮、地加瑞克、依西美坦、氟他胺、亚叶酸、氟维司群、戈舍瑞林、兰瑞肽、来那度胺、来曲唑、亮丙瑞林、甲羟孕酮、甲地孕酮、美司钠、奥曲肽、己烯雌酚、他莫昔芬和萨力多胺。为避免疑义，封装的药物也可以是富马酸酯(fumarate；fumarate ester)，以补充由体内聚合体降解产生的富马酸酯的作用。
药物组合物
可以使用本领域已知的常规技术将本发明的聚合物囊泡配制为药物组合物。例如，已经用于配制聚合物囊泡或含药物的脂质体的药物组合物。
该药物组合物包含多种本发明的聚合物囊泡。该药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂可以是任何合适的赋形剂或稀释剂。药物组合物通常是水性的，即其含有水(特别是无菌水)。
水性药物组合物的典型pH为7.0至7.6，优选7.2至7.4。可以使用药学上可接受的缓冲剂来达到所需的pH。药物组合物可以是无菌的、水性的、等渗盐溶液的形式。
通常，该药物组合物是可注射的组合物，例如该药物组合物适用于静脉递送，例如该药物组合物适用于输注。
实施例
合成囊泡是使用两亲性共聚物制成的，该两亲性共聚物是由聚[丙烯2-((2-(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰胺基)-3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)硫代)琥珀酸酯](一种PPITS衍生物；以下简称为“PPITS”)作为疏水性嵌段以及聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)(PMPC)作为亲水性嵌段制成的。
开发了一种新的合成路线来生产二嵌段PMPC-PPITS共聚物，并研究了其组装成囊泡。结果表明，PMPC-PPITS共聚物通过原位水解和/或酶促降解(例如，通过脂肪酶或酯酶)降解为富马酸酯(由于聚富马酸酯原料的不完全官能化所致)和丙二醇(一种代谢产物，其被肝脏迅速(半衰期2小时)代谢以形成乳酸盐、乙酸盐和丙酮酸盐)、具有或不具有叔丁基基团的硫代琥珀酸酯衍生物和咪唑。因此证明了PMPC-PPITS形成了降解为可再次吸收的材料的聚合物囊泡。
聚合物囊泡的产生
PMPC-PPF的合成
开环共聚步骤的实施例(合成PPM)
在受控的干燥气氛中，将0.020mmol SalenCrCl(或其他合适的催化剂；例如，二苯基锌)和4.0mmol马来酸酐置于装有搅拌棒的小瓶中。添加适当的溶剂(甲苯，0.50mL)，随后添加4.0mmol氧化丙烯(环氧化物)。将密封的小瓶置于预热至所需温度(45℃)的铝制加热块中。反应变得粘稠后，使用1H-NMR光谱分析来确定单体转化率。然后将粘稠的反应混合物溶解在最少量的二氯甲烷中，并沉淀到过量的己烷中。重复该过程(在PPM的情况下，使用乙醚作为非溶剂)，直到除去所有残留的单体。将聚合物洗涤后，将材料重新溶解在THF中，并通过离子交换柱以去除金属催化剂。在该进一步的纯化步骤之后，收集材料并真空干燥。
异构化步骤实施例(从PPM到PPF)
对于一锅法，在聚合反应结束时将0.1当量的二乙胺直接添加到聚合物混合物中，并将聚合物溶解在CDCl3中。对于两步法，将分离的聚合物样品溶解在CDCl3中，然后添加0.1当量的二乙胺。对于这两个步骤，使溶液搅拌，并通过1H-NMR光谱检查异构化进程。反应完成后，在真空下除去所有挥发物。随后将该聚合物重新溶解在CH2Cl2中，并沉淀到己烷中。然后将聚合物真空干燥，并通过1H NMR光谱确认异构化完成。
缩聚反应实施例(直接合成PPF)
聚富马酸丙二醇酯是使用ZnCl2为催化剂、对苯二酚为自由基抑制剂通过富马酸二乙酯与丙二醇的酯交换缩聚反应来合成的。在典型的两步聚合反应中，将14.98mL富马酸二乙酯和20mL丙二醇添加到两口圆底烧瓶中，并将试剂在氮气流下搅拌30min。然后，将200mg ZnCl2和124mg对苯二酚添加至反应混合物中，并将试剂在氮气流下加热至150℃过夜。然后，停止氮气流，并在170℃搅拌同时施加真空6小时。通过相对于CHCl3、CHCl3/MeOH然后是MeOH(每种溶剂至少更换三次)的彻底透析(截留3.5KDa)来纯化产物。
合成PPF ATRP大分子引发剂的实施例
将PPF(1当量)和三乙胺(3当量)的无水THF溶液在冰水浴中稍微冷却。然后，将2-溴代异丁酰溴(4当量)的最少量无水THF溶液滴加到反应混合物中。将该溶液加热至室温并搅拌48h。将该混合物倒入水中，并用1000kDa MWCO膜相对于水充分透析，然后冷冻干燥。
通过ATRP合成PMPC-PPF的实施例(原子转移自由基聚合)
将PPF大分子引发剂(1当量)和MPC单体(5当量)称量在圆底烧瓶中，并溶解在2：1(v/v)的甲苯/异丙醇中。然后，添加2当量的N，N，N′，N′-五甲基二亚乙基三胺，并在搅拌下用N2吹扫反应混合物1小时。然后称量2当量的Cu(I)Br，并在氮气流下添加，将反应在氮气气氛下密封，并保持在35℃搅拌48h。48h后，将反应物用2：1(v/v)的CHCl3/MeOH稀释，并在二氧化硅上过滤以除去氧化的催化剂。产物通过旋转蒸发浓缩，并进一步通过相对于2：1v/v的CHCl3/MeOH混合物(更换2次)、MeOH(更换3次)、然后相对于Milli-Q水(至少更换4次)彻底透析(截留3.5KDa)来纯化。通过冷冻干燥回收产物。然后通过冷冻干燥分离产物，并通过1H-NMR表征。
通过ATRP合成PMPC-PPITS的实施例
将PPF-PMPC(1当量)溶解在2mL 2：1(v/v)的CHCl3/MeOH中，并且添加溶解在20mLMeOH中的叔丁基(2-(1H-咪唑-5-基)乙酰基)半胱氨酸(3当量)。将反应混合物在搅拌下用UV灯在λ＝365nm下照射6h。然后通过对MeOH(更换3次)、然后对酸性Milli-Q水(pH＝3，至少更换2次)、最后是中性Milli-Q水(至少更换4次)的彻底渗析(截留3.5KDa)来纯化产物。通过冷冻干燥回收产物。然后通过冷冻干燥分离产物，并通过1H-NMR和GPC表征。
聚合物囊泡制备
通过溶剂转换来制备聚合物囊泡，这是本领域已知的技术。在无菌条件下在生物安全柜(KS15-Thermo Fisher Scientific)中进行制备。在进行任何操作之前，将聚合物储备溶液(0.5mL，在2：1v/v的DMF/MeOH中10mg/mL至80mg/mL)无菌0.22μm无菌过滤器上过滤。然后，在剧烈搅拌下通过注射泵以1μL/min至100μL/min的流速添加0.1M pH 7.4的PBS(1.15mL)，以形成聚合物囊泡。在添加结束时，将过量的PBS(1.85mL)添加到制剂中，并使用透析管(MWCO＝1000)在25℃的条件下，通过相对于无菌pH 7.4的0.1M PBS透析48h(4-6次更换/每天)来去除残留的有机溶剂。之后，通过在0℃超声15分钟并在1000g离心20分钟来进一步纯化得到的聚合物囊泡制剂。用重量分析来评估该溶液的浓度，同时通过DLS和TEM分析表征聚合物囊泡的尺寸和形状。
使用琼脂糖凝胶4B作为底物，通过凝胶渗透色谱法(Gel permeationchromatography，GPC)从聚集体和胶束中纯化聚合物囊泡。通过配备有He-Ne4mW 633nm激光器的Malvern Zetasizer Nano ZS激光散射器，使用动态光散射(DLS)来评估聚合物囊泡的粒径分布。在1ml一次性比色皿中将聚合物囊泡稀释在过滤的PBS中，实验是在173°的设定角度下运行n＝3次的平均值。还使用透射电子显微镜(TEM)评估了过滤的PBS中的聚合物囊泡的形态。通过将网格浸入到聚合物溶液中60秒以将样品安装在放电碳涂层网格上，随后用0.75％(w/w)磷钨酸(Phosphotungstic acid，PTA)染色5秒。然后用PBS洗涤网格，在真空下干燥，并通过JEOL显微镜使用100kV的电压张力进行评估。
PMPC-PPITS降解测定
通过用合适的酶混合物(例如，来自猪和/或人源)孵育聚合物囊泡来进行降解研究，这定性地以及在酶浓度方面模拟了暴露于核内体的条件。降解的表征可通过场流分级(Field flow fractionation，FFF)以及动态光散射(DLS)来评估，这允许跟踪从囊泡向胶束结构的转变。此外，还进行了GPC和HPLC分析，以评估酶促消化产生的分子量变化。还利用HPLC-MS确认了降解后得到的代谢物的身份。