阅读说明：本技术 淀粉酶产色链霉菌代谢产物在防治铁皮石斛病害中的应用 (Application of streptomyces diastatochromogenes metabolite in preventing and treating dendrobium officinale diseases ) 是由 申屠旭萍 宋阳 曹瑱艳 俞晓平 许益鹏 刘光富 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种淀粉酶产色链霉菌代谢产物在防治铁皮石斛病害中的应用,涉及微生物技术领域,本发明所述菌株的分类命名为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes),编号为tz3-1,保藏日期2019年12月3日,保藏登记号CGMCC No.19069。本发明最显著的特征是该菌株液体发酵代谢产物能同时抑制铁皮石斛炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、根腐病病原菌(Fusarium chlamydosporum)、梢枯病病原菌(Alternaria alternata)、叶斑病病原菌(Cladosporium cladosporioides)和白绢病病原菌(Sclerotium delphinii)菌丝的生长。田间试验表明该菌株代谢产物在防治铁皮石斛梢枯病上作用比常规化学农药略优。(The invention discloses an application of a metabolite of Streptomyces diastatochromogenes in preventing and treating diseases of dendrobium officinale, and relates to the technical field of microorganisms, wherein the strain is classified and named as Streptomyces diastatochromogenes (Streptomyces diastchromogenes) with the number of tz3-1, the preservation date of 2019, 12 months and 3 days, and the preservation registration number of CGMCC No. 19069. The most remarkable characteristic of the invention is that the liquid fermentation metabolite of the strain can simultaneously inhibit the growth of the hyphae of dendrobium candidum anthracnose pathogenic bacteria (Colletotrichum gloeosporioides), root rot pathogenic bacteria (Fusarium chlamydosporum), tip blight pathogenic bacteria (Alternaria alternata), leaf spot pathogenic bacteria (Cladosporium cladosporioides) and southern blight pathogenic bacteria (Sclerotium delphinii). The field test shows that the metabolite of the strain has slightly better effect on preventing and treating the dendrobium candidum dieback than the conventional chemical pesticide.)

淀粉酶产色链霉菌代谢产物在防治铁皮石斛病害中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种淀粉酶产色链霉菌代谢产物在防治铁皮石斛病害中的应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科石斛属多年生草本植物，主要药用部位是新鲜或干燥的茎，是一种非常珍贵的中药材。传统医学认为铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热、提高免疫力的作用。现代药理学发现铁皮石斛对消化系统、免疫系统、糖尿病血管病变等均具有良好的调节作用，并且具有抗氧化抗衰老抗疲劳抗肿瘤以及护肝等作用。据报道其主要活性物质为倍半帖类生物碱、黏液质、甾醇及酚酸性化合物等。在我国铁皮石斛主产于云南和浙江省内海拔超过1600m的地区，但由于其对生长环境要求苛刻、生长速度慢以及过度的采集等种种因素，自1987年后铁皮石斛就被列入濒危药用植物。近年来随着科学技术的发展育种技术、组织培养、人工栽培技术等已经广泛的应用于铁皮石斛的种植，极大地提高了铁皮石斛的产量与质量，据统计目前浙江铁皮石斛种植面积达3.5万亩，产值超过40亿元，占全国70％以上。

然而铁皮石斛产业的快速发展也带来了一些问题，如栽培技术不规范、农药使用不当等，这些问题严重影响了铁皮石斛产量与质量，限制了铁皮石斛的可持续发展。据统计，铁皮石斛上的病害多达数十种，常见的病害有黑斑病、炭疽病、疫病、白绢病、根腐病、灰霉病等。调查发现化学防治仍然是这些中药材种植地区的首要选择，但这也造成其成品药材农残超标、病原菌产生抗药性、种植环境被污染等种种问题。因此与环境相容性好的生物农药是防治中药材植物病害较佳的选择。淀粉酶产色链霉菌tz3-1是本实验室通过核糖体工程选育获得的一株生防菌，其代谢产物包括核苷类抗生素和多烯大环内酯类抗生素，对多种病原真菌的菌丝生长均有较强的抑制作用。本发明通过菌丝生长速率法研究了该菌株代谢产物对铁皮石斛梢枯病病原真菌、炭疽病病原菌等的抑制作用，并进一步测定了其田间防效，发现该菌株代谢产物在防治铁皮石斛梢枯病上作用比常规化学农药略优，在根腐病、白绢病上，该菌株代谢产物也表现出了不错的防治效果，为铁皮石斛真菌病害生物防治提供新的手段。同时该发明也为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。

发明内容

本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一株生防菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)代谢产物在防治铁皮石斛病害中的应用。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明首先公开了一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)代谢产物在防治铁皮石斛病害中的应用；所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)，编号为tz3-1，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2019年12月3日，保藏登记号CGMCC No.19069。

本发明所述的淀粉酶产色链霉菌tz3-1，经液体发酵可获得对铁皮石斛部分病害具有防治作用的代谢产物。

在一个优选实施方案中，所述淀粉酶产色链霉菌代谢产物直接作为防治铁皮石斛病害的药剂。

在另一个优选实施方案中，所述淀粉酶产色链霉菌代谢产物作为防治铁皮石斛病害的药剂中的组成成分，所述药剂还可以包括其它有利于防治铁皮石斛梢枯病的活性组分或可选的辅助组分，所述辅助组分指可接受的辅料，典型而非限定的，例如为稳定剂、稀释剂。

所述铁皮石斛的病害为炭疽病、梢枯病、叶斑病、根腐病、白绢病中的多种，本发明的淀粉酶产色链霉菌代谢产物可同时对多种病害产生防治效果。

优选的，所述的病害为梢枯病，田间防效发现该菌株代谢产物在防治铁皮石斛梢枯病上作用比常规化学农药还要优。

作为优选的，所述淀粉酶产色链霉菌代谢产物可通过如下步骤制备：

1)将淀粉酶产色链霉菌tz3-1菌种在28℃±1℃条件下活化培养；

2)发酵培养液灭菌后，冷却，无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌tz3-1，在28℃±1℃条件下，发酵培养5d，发酵液经离心后取上清液，上清液即作为淀粉酶产色链霉菌代谢产物。

在一个优选实施方案中，所述的发酵培养液组成为：每1000mL中含有可溶性淀粉20g，CaCO₃ 5g，KH₂PO4 3g，NH₄Cl 3g，FeCl₂ 1g，黄豆粉43g，余量为水。

在一个优选实施方案中，离心所得上清液经0.22μm膜过滤后作为淀粉酶产色链霉菌代谢产物。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果包括：

1)本发明发现了淀粉酶产色链霉菌tz3-1菌种的代谢产物可以用于防治铁皮石斛炭疽病、梢枯病、叶斑病、根腐病、白绢病等病害；相比于化学防治造成的成品药材农残超标、病原菌产生抗药性、种植环境被污染等种种问题,本发明属于生物农药防治，环境相容性好。

2)田间防效测定实验结果表明，50％tz3-1对铁皮石斛梢枯病的防效与100％tz3-1相比无显著性差异，但防效均优于阳性对照50％多菌灵在白绢病的田间防效实验结果中，100％tz3-1代谢产物的防效与50％多菌灵的防效相当。因此，淀粉酶产色链霉菌tz3-1代谢产物在防治铁皮石斛梢枯病的作用上，相比于常规化学农药更优，不但可以避免化学药物长期施用产生的问题，其更是一种极为高效的铁皮石斛梢枯病防治手段。

具体实施方式

实施例1：(淀粉酶产色链霉菌tz3-1的液体发酵)

淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)tz3-1由淀粉酶产色链霉菌D经核糖体工程选育获得，具体见申请的发明专利(申请号：2019114179541)。

发酵培养液为每1000mL中含有可溶性淀粉20g，CaCO₃ 5g，KH₂PO4 3g，NH₄Cl 3g，FeCl₂ 1g，黄豆粉43g，余量为水；每300mL三角瓶装60mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20min，待冷却至50℃，无菌条件下挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D或相应突变株接种，28℃±1℃，发酵培养5d；发酵液经5000r/min离心10min，上清液经0.22μm膜过滤后用于抑菌活性测定和田间防效试验。

实施例2：(淀粉酶产色链霉菌tz3-1代谢产物抑菌活性测定)

取经0.22μm膜过滤后的发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在培养基平面分别放1个直径为5mm的供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：菌丝生长抑制率(％)＝[(对照菌落直径-5)-(处理菌落直径-5)]/(对照菌落直径-5)×100％。

测定结果表明：淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)tz3-1代谢产物对供试5种病原真菌菌丝生长都有较好的抑制效果。

表1淀粉酶产色链霉菌tz3-1代谢产物对铁皮石斛真菌病害病原真菌的抑制效果

其中，表1中的抑制效果(％)^a列数据为采用申请号CN201911417954.1中所述培养基和培养方法培养所得代谢产物对铁皮石斛真菌病害病原真菌的抑制效果数据(该代谢产物为发酵液经离心所得的上清液，且未经分离四霉素Z的步骤处理)，与本发明相比，由于液体发酵培养基不同，抑制效果有明显差异，利用本发明中的培养基和培养方法，代谢产物活性更高。

实施例3：(淀粉酶产色链霉菌tz3-1代谢产物田间防效测定)

选择100％、50％的淀粉酶产色链霉菌tz3-1代谢产物和50％的多菌灵作为田间防效测定的供试药剂，清水为阴性对照，且每块处理田之间用清水处理的阴性对照作间隔田。于7d调查发病情况，统计病情指数，计算校正防效。根据发病严重程度分为4级：0级，健康苗；1级，至少25％的叶片枯死；2级，26％～50％的叶片枯死；3级，51％～75％的叶片枯死；4级，76％～100％的叶片枯死。病情指数＝[∑(各级病株数×对应各级代表数值)/(调查总株数×发病最高级的代表数值)]×100；校正防效(％)＝100×(1-(处理药后病指×对照药前病指)/(处理药前病指×对照药后病指))。

实验结果(表2)表明：50％tz3-1对铁皮石斛梢枯病的防效与100％tz3-1相比无显著性差异，但防效均优于阳性对照50％多菌灵；对于铁皮石斛炭疽病而言效果最好的药剂为多菌灵，防治效果为87.57％，显著高于tz3-1代谢产物；此外在白绢病的田间防效实验结果中，100％tz3-1代谢产物的防效与50％多菌灵的防效相当。

表2淀粉酶产色链霉菌tz3-1代谢产物对铁皮石斛真菌病害的防治效果

注：100％tz3-1指直接发酵获得经0.22μm膜过滤的上清液；

50％tz3-1指100％tz3-1上清液用无菌水体积比1:1稀释后的溶液；

校正防效数值后不同小写字母表示不同生防药剂间防治效果存在差异显著(P<0.05)。