具体实施方式

本申请提供了用于抑制生物膜形成和/或清除生物膜的组合物和方法。具体而言，本申请提供了使用弹性蛋白酶抑制剂以抑制和/或清除生物膜的组合物和方法。在某些实施方案中，抗生物膜组合物可包含抗菌化合物和/或传统涂层成分。

选择的定义

除非上下文另外明确说明，如本文中使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”旨在包括复数引用。此外，就在详细描述和/或权利要求这两者中的一者中使用的术语“包括(including)”、“包含(includes)”、“具有(having)”、“有(has)”、“拥有(with)”或它们的变型而言，这样的术语旨在是包含性的，与术语“含有(comprising)”具有相同的方式。变型术语/短语(及其任何语法变体)“含有(comprising)”、“具备(comprises)”、“涵盖(comprise)”包括词组“基本上由…组成(consisting essentiallyof)”、“基本上由…构成(consists essentially of)”、“由…组成(consisting)”和“由…构成(consist)”。

词组“基本上由…组成(consisting essentially of)”或“基本上由…构成(consists essentially of)”表示权利要求包括含有特定材料或步骤的实施方案以及实质上不影响权利要求的基础特征和新颖特征的那些实施方案。

术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测定或确定该值，即测定系统的限制。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”是指在特定值的可接受误差范围内。

在本公开中，范围以简写方式描述，从而避免必须对范围内的各个值和所有值进行详细地陈述和描述。在适当的情况下，可以选择在范围内的任何适当的值作为该范围的上限值、下限值或端值。例如，1至10的范围表示1和10的端值，以及2、3、4、5、6、7、8、9的中间值，并且包括在1至10内的所有中间范围，例如2至5、2至8和7至10。此外，当在本文中使用范围时，旨在明确包括范围的组合和子组合(例如，在所公开的范围内的子范围)以及其中的具体实施方案。

如本文中使用的，“生物膜”为诸如细菌之类的微生物的复杂聚集体，其中细胞利用胞外多糖基质彼此附着和/或附着到表面上。生物膜中的细胞在生理学上不同于相同生物体的浮游细胞，浮游细胞为可以在液体介质中漂浮或浮起的单细胞。

如本文中使用的，“获得”是指从生长容器中移出一些或全部的基于微生物的组合物。

根据本申请，包括活生物体或非活性物质的材料的有害累积导致了“污染”过程。“污染”可以导致堵塞、结垢或其他不需要的积聚。“污染”可以影响目标对象的效率、可靠性或功能性。

弹性蛋白酶抑制剂组合物

本公开提供了使用包含弹性蛋白酶抑制剂的组合物抑制和/或清除生物膜的方法。

在优选的实施方案中，根据本申请的组合物和方法利用弹性蛋白酶抑制剂和/或细菌培养提取物。弹性蛋白酶抑制剂可为纯化的形式或细菌生长产物的混合物，包括粗提取物。添加的弹性蛋白酶抑制剂的浓度可为0.01％重量含量至90％重量含量(wt％)，优选为0.1wt％至50wt％，并且更优选为0.1wt％至20wt％。在其他实施方案中，纯化的弹性蛋白酶抑制剂可以与可接受的载体组合，其中存在的弹性蛋白酶抑制剂的浓度可为0.001体积％至50体积％，优选为0.01体积％至20体积％，更优选0.02体积％至10体积％。

根据本申请使用的微生物可为天然的或基因修饰的微生物。例如，可以用特定基因转化微生物以表现出特定特征。微生物也可为所需菌株的突变体。如本文中使用的，“突变体”是指参考微生物的菌株、基因变异或亚型，其中与参考微生物相比，突变体具有一种或多种基因变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、复制、移码突变或重复扩增)。用于制作突变体的方法是微生物学领域公知的。例如，为此目的广泛使用UV诱变和亚硝基胍。

在某些实施方案中，微生物为产生弹性蛋白酶抑制剂的任何细菌。可以通过包括茂原链霉菌的细菌产生弹性蛋白酶抑制剂和/或相关的细菌培养提取物。在优选的实施方案中，通过茂原链霉菌DSM40847产生弹性蛋白酶抑制剂。

在一个实施方案中，在约5℃至约100℃，优选为15℃至60℃，更优选为25℃至50℃进行用于培养微生物的方法。在另一实施方案中，可以在恒定温度连续进行培养。在又一实施方案中，培养可以经历温度改变。

在一个实施方案中，用于该方法和培养过程的装置是无菌的。诸如反应器/容器之类的培养装置可以与(例如)为高压灭菌器的灭菌单元分开，但是与该灭菌单元相连。培养装置还可以具有在开始接种之前原位灭菌的灭菌单元。可以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，在将环境空气引入到容器中之前可以使环境空气穿过至少一个过滤器。在其他实施方案中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或者任选地，根本不加热，其中可以利用低水分活性和低pH的使用来控制细菌生长。

细菌生长肉汤培养基的生物量含量可为(例如)5g/l至180g/l或更多。在一个实施方案中，肉汤培养基的固体含量为10g/l至150g/l。

在一个实施方案中，抗生物膜组合物包含根据本申请的方法产生的细菌培养物。

由目标微生物产生的微生物生长副产物可以保留在微生物中或分泌到液体培养基中。在另一实施方案中，用于产生微生物生长副产物的方法还可以包括浓缩和纯化目的微生物生长副产物的步骤。在又一实施方案中，液体培养基可以包含稳定微生物生长副产物的活性的化合物。

抗生物膜制品的制备

本申请的一种基于弹性蛋白酶抑制剂的制品为仅包含细菌的细菌生长肉汤培养基和/或由细菌产生的弹性蛋白酶抑制剂和/或任何残留营养物。可以直接使用细菌生长产物而无需提取或纯化。如果需要，可以使用标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。

在优选的实施方案中，可以通过正己烷从细菌中提取弹性蛋白酶抑制剂，从而获得粗提取物。粗提取物可进一步加工形成涂层。可以通过粗提取物和聚酯的混合溶液来制备粗提取物涂层(CR涂层)。通常，能够以约1％重量含量至约50％重量含量、约5％重量含量至约25％重量含量或约10％重量含量添加粗提取物，并且能够以约50％重量含量至约99％重量含量、约5％重量含量至约75％重量含量或约90％重量含量添加诸如聚(ε-己内酯)二醇之类的聚酯，包括PCL-PU80，并且可以通过在约25℃的二甲苯和THF(v:v＝1:2)中剧烈搅拌来溶解该组合物。在充分混合后，溶液可以涂覆表面。可以在约5℃至约50℃、约10℃至约37℃或约15℃至约25℃将表面干燥至少1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、72小时、1周、2周的更长时间段以除去溶剂。可以按照相同的过程制备具有不同浓度的粗提取物和/或聚酯的涂层。

在从生长容器收获抗生物膜组合物时，在将获得的制品置于容器和/或管道中(或以其他方式运输以供使用)时可以添加其他组分。添加剂可为(例如)染料、颜料、pH调节剂、缓冲剂、盐、促进附着化合物、溶剂(例如，异丙醇、乙醇)、抗微生物剂、其他微生物和其他专用于预期用途的成分。

在某些实施方案中，可以将抗生物膜组合物添加到传统上用于涂覆表面的现有组合物中。此外，在施加传统上用于涂覆表面的组合物之前、同时或之后，可以将抗生物膜组合物施加到表面上。

在某些实施方案中，本申请的抗生物膜组合物包括粘合剂，其主要负责抗生物膜组合物对目标对象和/或表面的附着。粘合剂化合物可以选自(例如)丙烯、醇酸树脂、丙烯酸、丙烯酰胺、酚醛树脂、酚醛-醇酸树脂、聚丙烯酰胺、聚氨酯、硅氧烷-醇酸树脂、聚酯、环氧树脂、乙烯基树脂、乙酸乙烯酯-乙烯、乙烯基-醇酸树脂、无机粘合剂(钠、乙基硅酸钾(potassium ethyl silicate)、锂等)、有机粘合剂(碳基的)、(Daubert ChemicalCompany,Inc.，芝加哥，IL)、脂族-聚氨酯树脂以及油改性的聚氨酯树脂。

在某些实施方案中，本申请的抗生物膜组合物包括颜料或染料，其可以为底漆提供颜色。颜料或染料可为天然的、合成的、无机的或有机的。颜料或染料可以选自(例如)二氧化钛、氧化锌、锌黄、黄色染料、联苯胺黄、氧化铬绿、酞菁绿、酞菁蓝、群青蓝、朱红、颜料棕6、红170、二恶嗪紫、炭黑、氧化铁(II)、石英砂(SiO₂)、滑石、重晶石(BaSO₄)、高岭土和石灰石(CaCO₃)。

在某些实施方案中，用于组合物的溶剂中的一者选自矿物或有机溶剂，包括(例如)乙醇、丁醇、丙醇、脂肪烃、脂环烃、二甲苯、甲苯、酮和/或异丙醇。

在某些实施方案中，组合物还包含水作为溶剂。水可以通过颗粒活性炭过滤、去离子、蒸馏或通过反渗透处理。此外，pH调节剂可用于增加或降低pH，从而(优选地)促进抗生物膜组合物中各种组成的溶解。水基抗生物膜组合物可为丙烯酸基或胶乳基的。胶乳可以来自天然来源，如(例如)开花植物(被子植物)，或者优选地，胶乳合成地衍生自(例如)聚合苯乙烯。可由丙烯酸树脂产生用于抗生物膜组合物的丙烯酸基料，丙烯酸树脂为合成热塑性塑料。

在某些实施方案中，抗生物膜组合物可为油基的。合成树脂或天然树脂可以与上述溶剂中的任一者组合使用以产生油基树脂。醇酸树脂可以(例如)用于本申请的组合物中。可以使用诸如(例如)亚麻籽油、红花油、大豆油、葵花籽油、桐油或蓖麻油之类的天然油产生醇酸树脂。

在一个实施方案中，基于弹性蛋白酶抑制剂的制品还可以包含缓冲剂，缓冲剂包括有机酸和氨基酸或它们的盐。合适的缓冲剂包括(例如)柠檬酸盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳糖二酸盐、葡糖二酸盐、丙醇二酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、精氨酸和它们的混合物。也可使用磷酸和亚磷酸或它们的盐。使用合成缓冲液是适合的，但优选使用天然缓冲液，例如上面列出的有机酸和氨基酸或它们的盐。

在另一实施方案中，可以将pH调节剂添加到组合物中，pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸或混合物。

抗生物膜制品可以与促进抗生物膜制品附着到待处理表面上的组合物一起施加。促进附着物质可为抗生物膜制品的组分，或者促进附着物质可以与抗生物膜制品同时或依次施加。有用的附着促进剂的实例包括马来酸、巴豆酸、富马酸、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚丙烯酸酯和聚氨酯。

可用于抗生物膜组合物的其他添加剂包括水软化剂、螯合剂、防腐剂和抗氧化剂，以有效实现其预期功能的量添加这些添加剂。这些添加剂的识别和使用以及这些添加剂的量完全在本领域技术范围内。适当的水软化剂包括直链磷酸酯、苯乙烯-马来酸共聚物和聚丙烯酸酯。适当的螯合剂包括1,3-二甲基-2-咪唑啉酮；1-苯基-3-异庚基-1,3-丙二酮；以及2-羟基-5-壬基乙酰苯酮肟。腐蚀抑制剂的实例包括2-氨甲基丙醇、二乙基乙醇胺苯并三唑和甲基苯并三唑。适用于本申请的抗氧化剂包括(BHT)2,6-二叔丁基-对甲酚、(BHA)2,6-二叔丁基-对苯甲醚、Eastman抑制剂O A B M-乙二酰双(苯亚甲基酰肼)和Eastman DTBMA2,5-二叔丁基氢醌。

可以包含在根据本申请的配方中的其他适当添加剂包括通常用于这种制剂的物质。添加剂可为(例如)载体、在相同或不同设备中产生的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、示踪剂、灭微生物剂、干燥剂、流动控制剂、消泡剂、UV稳定剂、防结皮剂、增稠剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、螯合剂和/或稳定剂。

有利地，根据本申请，抗生物膜制品可包括使微生物生长的肉汤培养基。制品可为(例如)至少0.01％重量含量、0.1％重量含量、1％重量含量、5％重量含量、10％重量含量、25％重量含量、50％重量含量、75％重量含量或100％重量含量的肉汤培养基。制品中生物量的量可为(例如)0％重量含量至100％重量含量的任何值，包括其间的所有百分比。

任选地，制品可以在使用之前储存。优选为具有较短储存时间。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在优选的实施方案中，如果制品中存在活细胞，那么在较冷温度下储存该制品，例如，低于20℃、15℃、10℃或5℃。

在某些实施方案中，本申请的抗生物膜组合物可包含抗菌剂。抗菌剂可为杀菌的或抑菌的。示例性抗菌剂为万古霉素；然而，其他预想的抗菌剂包括β-内酰胺抗生素、达托霉素、氟喹诺酮(例如，环丙沙星)、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明、泰利霉素和氨基糖苷抗生素。

弹性蛋白酶抑制剂在抗生物膜组合物中的用途

在优选的实施方案中，提供了将抗生物膜组合物直接施加到现有生物膜上或施加到可被生物膜污染的表面上的方法，其中将弹性蛋白酶抑制剂和/或包含弹性蛋白酶抑制剂的细菌培养物施加到生物膜或表面上。在施加到生物膜、表面和/或目标对象上之后，可以对根据本申请的抗生物膜组合物的用途提供各种改进。本申请的所述要素不是所有应用的详尽审查。

在某些实施方案中，抗生物膜组合物可破坏生物膜的结构，包括EPS。抗生物膜组合物可以抑制形成生物膜的生物体建立生物膜结构，主要是EPS、水通道和孔结构。

可以将本申请的抗生物膜组合物施加到各种无机的或有机的目标对象的表面上，例如，包括钢、铝、铁的金属；包括木材、珊瑚、纸、棉花、丝绸、毛发、皮肤、毛皮、橡胶或植物的有机物；塑料；包括石膏的矿物；玻璃；混凝土；石膏；粘土；或灰泥。该表面可用于各种行业，包括医疗器械、水产养殖、捕鱼、海水淡化、水净化、核电站以及海洋和淡水航行。该表面可为管道、管线、针、泵、推进器、船体、甲板、栏杆、浮标、驳船、码头和链条、绳索。该组合物可应用于处于一定温度范围、水环境或其他诱导应激条件下的目标对象。可以将抗生物膜组合物添加到传统涂层制品中，例如油漆、底漆、清漆、染色剂和密封剂。此外，可以在施加传统涂层制品之前、同时或之后，将抗生物膜组合物施加到目标对象上。

可通过使用(例如)喷雾瓶或加压喷雾装置进行喷雾来将该组合物施加到表面或生物膜上。也可以使用布或刷子施加该组合物，其中将组合物擦涂、铺展或刷涂到表面或生物膜上。此外，可以通过将表面浸渍、浸泡或浸没到其中具有该组合物的容器中，从而将组合物施加到表面或生物膜上。

在某些实施方案中，基于弹性蛋白酶抑制剂的组合物可以抑制生物膜形成和/或清除细菌的成熟或不成熟的生物膜，而对细胞具有非致死作用。如果需要抑菌或杀菌活性，基于弹性蛋白酶抑制剂的组合物可以与抗菌剂组合。优选地，生物膜由革兰氏阳性细菌组成，但也可以是包括革兰氏阴性细菌的其他细菌。

可以将抗生物膜组合物添加到现有的抗菌制品中。此外，可以在施加抗菌制品之前、同时或之后，将抗生物膜组合物施加到目标对象上。

在某些实施方案中，弹性蛋白酶抑制剂可以抑制或清除非生物膜形成生物体。这些生物体可以包括沉降在生物膜上或在生物膜附近的肉眼可见的生物体，包括海洋生物体，如(例如)贝类和藻类。

在优选的实施方案中，提供了抑制生物膜形成和/或清除现有生物膜的方法，该方法包括将弹性蛋白酶抑制剂施加到表面上。在某些实施方案中，向表面添加基于弹性蛋白酶抑制剂的组合物增强了表面的性能和/或延长了表面的寿命。通过减少诸如船舶的船体或飞机机翼之类的摩擦，可以提高性能。通过减少清洁污染表面的频率和/或减少由于生物源造成的生物腐蚀，可以延长寿命。在某些实施方案中，包含弹性蛋白酶抑制剂的抗生物膜组合物通过抑制活生物体或非活性物质对表面和/或目标对象的污染来延长施加有包含弹性蛋白酶抑制剂的抗生物膜组合物的表面和/或目标对象的寿命。本申请可用于抑制生物体或沉淀物的沉积。因此，本申请能够延迟或完全去除与去除沉淀物和沉积物相关的预防性维护的必要性，以及更换或修理装置部件的需要。

材料和方法

菌株、培养基和抗生素

12种放线菌菌株购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。待测菌株MRSA ATCC 43300、大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923购自美国典型菌种保藏中心；海洋金黄色葡萄球菌B04是从海洋生物膜分离的实验室的储备液，并且从实验室的储备液中获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)168。大豆粉购自中国的Wugumf；可溶性淀粉购自美国的Affymetrix；硫酸镁水合物购自德国的Riedel-De Haen；细菌蛋白胨获自意大利的Oxoid；Mueller Hinton Broth(MHB)购自瑞士的Fluka AG；磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自美国的Thermo Fisher Scientific Inc；LB、葡萄糖、MTT、万古霉素、氯霉素和1-丁醇购自英国的VWR；并且由美国的Sigma Chemical Ltd.提供所有其他化学品。

次级代谢产物的筛选和化合物的分离

将12种放线菌的贮存培养物接种到50ml的AM4、AM5和AM6培养基中，培养基内有玻璃珠(以破碎球状菌落)，并且在22℃和30℃在旋转振荡器(170rpm)上孵育。AM4培养基由大豆粉(20g/L)、细菌蛋白胨(2g/L)、葡萄糖(20g/L)、可溶性淀粉(5g/L)、酵母提取物(2g/L)、NaCl(4g/L)、K₂HPO₄(0.5g/L)、MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)和CaCO₃(2g/L)组成，pH为7.8。AM5培养基由麦芽提取物(10g/L)、酵母提取物(4g/L)和葡萄糖(4g/L)组成，pH为6至7。AM6培养基由可溶性淀粉(20g/L)、葡萄糖(10g/L)、细菌蛋白胨(5g/L)、酵母提取物(5g/L)和CaCO₃(5g/L)组成，pH为7.2至7.5。在第3、5和7天用1-丁醇提取培养用肉汤培养基；将粗提取物用DMSO溶解以用于储存和生物试验。通过反相高效液相色谱(HPLC，Waters 2695，Milford，MA，美国)使用Semi-Prep C18柱(10×250mm)分离纯化合物，用55-min梯度的包含0.05％四氢呋喃(TFA)的5％至95％含水乙腈(ACN)以3ml/min的流量洗脱Semi-Prep C18柱。

抗菌剂敏感性试验

根据临床和实验室标准协会指南CLSI M100(2018)，用MRSA ATCC 43300和大肠杆菌ATCC 25922确定最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。将约10⁵CFU/ml细菌菌株的过夜培养物接种到MHB中，并用一系列浓度的弹性蛋白酶抑制剂(或粗提取物和抗生素)处理。孵育24小时后，将没有示出可见细菌生长的最低浓度记录为MIC。在MIC测定之后，通过将来自各孔的1ml菌液用肉汤培养基适当的稀释并涂覆在Mueller Hinton Agar(MHA)板上来测定MBC。将MBC定义为抗菌剂引起＞99.9％细胞减少的最低浓度。进行多次各个测定，并且重复3次。

抗生物膜测定

如前所述确定最低生物膜抑制浓度(MBIC)和最低生物膜清除浓度(MBEC)。

MBIC测定

用LB和0.5％葡萄糖将待测菌株的过夜培养物稀释到约10⁷，并在96孔细胞培养板中用各种浓度的弹性蛋白酶抑制剂进行处理。然后将菌液在37℃下培养24小时，并通过1×PBS冲洗两次以除去未附着的浮游细胞。在洗涤之后，进行MTT染色测定以测定生物膜中的活细胞，因为MTT可与活细胞线粒体中的活化琥珀酸脱氢酶反应以形成蓝紫甲瓒，在溶于DMSO后可在570nm处读数。

MBEC测定

通过MBEC测定测试了弹性蛋白酶抑制剂清除预形成的成熟生物膜的能力。与MBIC测定相同，将待测菌株的过夜培养物在96孔细胞培养板中培养24小时，但不添加弹性蛋白酶抑制剂以形成生物膜。然后通过1×PBS对形成的生物膜进行两次冲洗，并用一系列浓度的弹性蛋白酶抑制剂(用LB和0.5％葡萄糖稀释)处理，并在37℃再培养24小时。在培养之后，通过1X PBS对各孔进行两次冲洗，并进行MTT测定以测定剩余生物膜中的活细胞。

浓度响应曲线研究

将MRSA ATCC 43300用于浓度响应曲线研究。将4×10⁵CFU/ml的指数生长的MRSA接种到在15ml Falcon管中具有不同浓度的弹性蛋白酶抑制剂和万古霉素的MHB中。将该管在旋转振荡器上于37℃培养24小时；用MHB稀释各管中1ml的培养用肉汤培养基，并且将1ml稀释的细菌涂覆在MHA板上以用于CFU计数。将各浓度涂覆在两个平板上，并且重复3次实验。

产量监控和提取效率的比较

如Secondary metabolites screening and compound isolation(次级代谢产物筛选和化合物分离)中所述，将茂原链球菌DSM 40847的贮存培养物在AM4培养基中孵育。每12小时除去1ml的培养用肉汤培养基，并分别用1ml的1-丁醇、乙酸乙酯(EA)和己烷提取弹性蛋白酶抑制剂。然后通过蒸发除去溶剂。将粗提取物溶解在甲醇中，并通过HPLC分析用Phenomenex Luna C18柱进行定量。进行三次实验。通过保留时间识别弹性蛋白酶抑制剂的峰，并基于建立的标准曲线计算其浓度。通过在Bruker AV500光谱仪(500MHz)上使用二甲基亚砜-d₆标记的1H、1H-1H-COSY、1H-13C-HSQC和1H-13C-HMBC NMR谱的核磁共振(NMR)分析(1H-NMR DMSO-d₆:δH＝2.50ppm；DMSO-d₆:δC＝39.50ppm)阐明弹性蛋白酶抑制剂的结构。

涂层制剂

通过正己烷提取4L茂原链球菌DSM 40847的培养用肉汤培养基(如次级代谢产物筛选和化合物分离所述进行孵育)，从而获得高弹性蛋白酶抑制剂含量的粗提取物。通过混合溶液制备粗提取物涂层(CR涂层)。通常，对于10％重量含量的CR涂层，通过在25℃剧烈搅拌将PCL-PU80(0.90g，90％重量含量)和粗提取物(0.10g，10％重量含量)溶解在二甲苯和THF(v:v＝1:2)中。充分混合后，将溶液涂覆到载玻片上并在室温干燥一周以除去溶剂。按照相同的程序制备具有不同浓度的粗提取物的涂层。

海洋天然生物膜分析和释放速率确定

如前所述，在2019年4月，在香港的Yung Shue O Fish Farm，将具有CR涂层的载玻片暴露于潮下水(22°20'16.7”N,114°16'08.0”E)中2周、3周和4周。将载玻片与原位海水一起在冷却器中运输回实验室，并使用高压灭菌和0.22μm过滤的海水洗涤两次以除去松散的颗粒和细胞；然后，通过Filmtracer^TMLIVE/DEAD^TMBiofilm Viability Kit对生物膜进行染色，并送去进行共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察。同时，通过在静态条件下使用高效液相色谱(HPLC)测定浓度来确定弹性蛋白酶抑制剂的释放速率。将涂覆有粗提取物和聚合物的板浸渍到装有100ml的灭菌人工海水的测定容器中。在浸渍24小时后，取10ml海水，并且用相同体积的二氯甲烷提取，然后在氮气中除去二氯甲烷。干燥后，将提取物重悬于100ml的甲醇中，并如上所述进行HPLC分析。每周测定释放速率，持续4周，并且各浓度进行多次测定。

利用生物膜细胞和基质染色的CLSM观察

如MBIC和MBEC测定所述，在玻璃盖玻片上使生物膜生长。然后用1×PBS对经处理的生物膜进行两次冲洗，并在室温用FilmTracer^TM 1-43Green Biofilm Cell Stain和FilmTracer^TM Ruby Biofilm Matrix Stain在黑暗中进行30分钟的染色。采用Leica Sp8共聚焦显微镜在488nm处观察生物膜中的细胞和基质。

DNA提取、16S rRNA基因测序和分析

用高压灭菌的棉花收集经涂覆的载玻片表面上的生物膜样品，并储存在-80℃的DNA储存缓冲液(10mM Tris-HCl；0.5mM EDTA，pH 8.0)中。在提取之前，使样品涡旋数次以将微生物细胞释放到DNA储存缓冲液中。然后将所有样品以10,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。用10mg/mL溶菌酶和20mg/mL蛋白酶K连续处理后，用微生物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech，北京，中国)按照制造商的方案从待处理微生物细胞中提取DNA。

使用NanoDrop(测试DNA纯度，OD260/OD280)和琼脂糖凝胶电泳(测试DNA降解和潜在的污染)控制DNA样品的质量。将原核生物16S rRNA基因的高变V3-V4区(正向引物：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'(SEQ ID NO:1)；反向引物：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'(SEQ IDNO:2))用于通过聚合酶链式反应(PCR)从生物膜扩增DNA。在文库构建之前对PCR产物进行纯化，并在Novogene(北京，中国)的NovaSeq 6000System中进行测序。读数长度为250bp，且每对读数具有50bp的重叠区。使用NGS QC Toolkit(2.0版)对双端读数进行质量控制。使用软件包QIIME2分析16S rRNA基因扩增子数据，然后使用QIIME2中的Q2_manifest_maker.py进行合并。在QIIME2中使用dada2命令去除低质量的读数和嵌合体。为了使不均匀的测序深度标准化，挑选各样品的500,000个经过滤的读数。使用通过朴素贝叶斯方法训练的分类器，以97％序列相似性从汇集的读数中重新分类运算分类单位(OTU)。然后使用QIIME2中的特征分类器分类-sklearn脚本恢复典型序列。使用QIIME2中的脚本“qiime diversityalpha”进行α-多样性分析(观察OTU和Shannon多样性)。通过软件PAST(3.0版)中的聚类分析进行基于Bray-Curtis距离的β-多样性分析。此外，基于相对丰度在Excel(Office365MSO 64位)中绘制分类结构。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行所有数据的统计分析。使用不成对t检验，将CR涂覆的载玻片上的生物膜组成与对照组进行比较。

本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部内容均通过引用并入本文，包括所有附图和表格，在一定程度上它们与本说明书的明确教导一致。

以下是说明实施本申请的过程的实施例。不应将这些实施例解释为限制性的。除非另有说明，否则所有的百分比都是重量百分比，并且所有的溶剂混合物比例都是体积百分比。

实施例1—由放线菌产生的代谢产物

微生物对抗生素抗性不可避免的增加对现代医学构成严重威胁，对新药品开发施加了巨大压力。然而，药品研发受困于飞涨的成本。世界范围的抗生素市场仍然由数十年前发现的抗生素主导。研究人员已经开始寻找再利用旧药品的方法。在我们的生物测定指导的药品研发中，从各种放线菌细菌中识别出四种分离的抗菌化合物，并且它们中的弹性蛋白酶抑制剂为唯一对附着细胞呈现活性的化合物。弹性蛋白酶抑制剂由Satoshi首次发现，弹性蛋白酶抑制剂作为新的人类粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，由诺布托链霉菌(Streptomyces noboritoensi)KM 2753菌株产生。弹性蛋白酶抑制剂抑制了人粒细胞弹性蛋白酶，但对胰弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶几乎没有活性。低毒性和特异活性使其成为治疗急性关节炎、各种炎症、肺气肿和胰腺炎的理想候选。然而，还没有已知的关于弹性蛋白酶抑制剂作为抗生物膜剂用途报道。

评估12种放线菌菌株在不同培养条件下产生的次级代谢产物对革兰氏阳性菌MRSA和革兰氏阴性大肠杆菌的生物活性(表1)。发现四种主要化合物具有抗MRSA的抗菌活性。在这些菌株中，只有由茂原链球菌DSM 40847产生的化合物具有抗生物膜活性。随后通过高效液相色谱(HPLC)纯化该化合物，并通过超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)和核磁共振(NMR)分析进行结构表征(图1C和图1A)。如UPLC-MS/MS所示，分子量为392.3，并且通过NMR分析完成的结构说明识别出从茂原链球菌粗提取物中分离的生物活性片段(图1A)是一种已知的化合物，即弹性蛋白酶抑制剂(图7)。然后探究菌株DSM 40847中弹性蛋白酶抑制剂(图1D)的产量。如图1D所示，在接种12小时后，弹性蛋白酶抑制剂的产率迅速增加，并且在第二天达到峰值，产率为332mg/L。弹性蛋白酶抑制剂的产率保持恒定，在示出的范围内有轻微变化(289±83mg/L)。

表1.示出了来自12种放线菌菌株的粗提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物测定结果。

实施例2—弹性蛋白酶抑制剂活性

由于存在EPS和各种耐受机制，生物膜通常对传统抗生素治疗具有抗性。在常规疗法中，万古霉素一直是治疗大多数MRSA感染的选择。为了确定弹性蛋白酶抑制剂对生物膜和浮游细胞的活性，用万古霉素来进行对比，以MRSA测定了最低抑制浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)、最低生物膜抑制浓度(MBIC)和最低生物膜清除浓度(MBEC)。

基于MIC、MBC和浓度-响应试验的结果确定弹性蛋白酶抑制剂对浮游细胞的作用。根据该结果，浮游细胞对弹性蛋白酶抑制剂和万古霉素这两者都是敏感的，具有相同的MIC，为0.5μg/ml至2μg/ml。测定MBC，并且结果表明弹性蛋白酶抑制剂表现出抑菌活性，MBC大于100μg/ml，而万古霉素示出了强杀菌活性，MBC在20μg/ml至50μg/ml之间(图2D)。通过图2C中的浓度-响应曲线进一步揭示了试剂对浮游细胞的作用。在0μg/ml至50μg/ml的范围内，万古霉素的活性是浓度依赖性的，这导致了细胞密度随着浓度增加而急剧降低。相反，随着弹性蛋白酶抑制剂的化合物浓度在0μg/ml至100μg/ml范围内变化，细胞密度没有显著的不同。

测试MBIC和MBEC以探究弹性蛋白酶抑制剂对生物膜细胞的影响。在附着细胞中观察到抗性的升高，而弹性蛋白酶抑制剂表现出对抗附着细胞的最佳活性。弹性蛋白酶抑制剂和万古霉素这两者都可以抑制生物膜形成，MBIC为1.25μg/ml至2.5μg/ml(图2A)。在MBEC试验中观察到在两种试剂之间存在显著差异。在发育的成熟生物膜中的细胞对抗生素有抗性。需要大于10μg/ml的万古霉素以使得细胞密度下降50％。有趣的是，弹性蛋白酶抑制剂的活性不受生物膜抗性的影响，1.25μg/ml的浓度的弹性蛋白酶抑制剂能在24小时内清除50％的成熟生物膜(图2B)。

与先前的研究一致，在预形成的成熟生物膜中，细菌对万古霉素产生了抗性，而在弹性蛋白酶抑制剂处理的附着细胞中没有观察到抗性的增加。

实施例3—弹性蛋白酶抑制剂对生物膜结构的影响

为了研究弹性蛋白酶抑制剂对生物膜结构的影响，使用生物膜细胞和基质染色在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下观察。在生物膜抑制测定中，未处理的生物膜(图3A)示出了具有高密度组织化的细胞和基质的清晰形状。然而，用弹性蛋白酶抑制剂处理的生物膜(图3B)表现出细胞和基质的密度显著下降，并且细胞和基质这两者都是分散随机分布的。在生物膜清除测定中，用弹性蛋白酶抑制剂处理后，预先形成的生物膜中的细胞变得分散，并被释放到培养基中(图3D)。共聚焦图像证明在弹性蛋白酶抑制剂处理之后的细胞的分布模式明显改变。未处理的生物膜细胞(图3C)分布为具有粗糙边缘的细胞聚集簇；而弹性蛋白酶抑制剂处理过后的生物膜细胞分布为具有平滑边缘的窄条状(图3D)。相同地，在用弹性蛋白酶抑制剂处理后，高密度组织化的生物膜基质变得稀疏和分散。根据定量分析，在弹性蛋白酶抑制剂处理之后，细胞和基质这两者都显著减少。与未处理的生物膜相比，在生物膜抑制测定中，用弹性蛋白酶抑制剂处理的生物膜的细胞和基质的密度分别降低约80％和35％(图3E)。对于生物膜清除测定，细胞和基质的减少分别超过50％和70％(图3F)。

弹性蛋白酶抑制剂破坏生物膜基质，但对细胞没有致死作用。如诸多研究所提及的，生物膜基质对于生物膜细胞的抗性是至关重要的。弹性蛋白酶抑制剂的非致死作用及其在生物膜基质破坏中的活性进一步证实了弹性蛋白酶抑制剂是生物膜靶向剂，并且弹性蛋白酶抑制剂的应用对研发抗菌耐受性而言具有较小风险，因为抗菌耐受性的出现仅与杀菌抗生素的使用有关。此外，弹性蛋白酶抑制剂抗MRSA的抗生物膜活性也值得注意。如MRSA、VRSA和VRE的细菌的多药耐药性的持续出现给现代医学施加了压力。弹性蛋白酶抑制剂的有效清除效率表明其在诱导生物膜的解离中的应用可能，弹性蛋白酶抑制剂在与其他抗生素联合治疗MRSA的生物膜相关疾病中具有巨大的潜力。

实施例4—弹性蛋白酶抑制剂示出的对革兰氏阳性细菌的生物膜的偏好

选择总共6个菌株(图4C)，以测试弹性蛋白酶抑制剂对生物膜的活性，包括金黄色葡萄球菌ATCC 25923、金黄色葡萄球菌B04、MRSA ATCC 43300、枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌ATCC 25922和绿脓杆菌PAO1。就MBIC和MBEC而言，在革兰氏阳性菌株中观察到相同的模式；而革兰氏阴性菌株表现出出了完全不同的趋势。除枯草芽孢杆菌168的MBIC为2.5μg/ml至5μg/ml之外，所有革兰氏阳性细菌的弹性蛋白酶抑制剂的MBIC都在1.25μg/ml至2.5μg/ml的范围内(1.25μg/ml抑制了至少80％的生物膜)(图4A)。观察到MBEC的变化；金黄色葡萄球菌B04是对弹性蛋白酶抑制剂抗性最强的菌株，MBEC为2.5μg/ml至5μg/ml；最敏感的菌株是金黄色葡萄球菌ATCC 25923，其MBEC最低，为0.625μg/ml至1.25μg/ml；并且对于MRSA和枯草芽孢杆菌，MBEC为1.25μg/ml至2.5μg/ml(图4B)。当用弹性蛋白酶抑制剂处理革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)时，没有观察到活性。生物膜形成的发展不受弹性蛋白酶抑制剂的影响，即使在100μg/ml的浓度亦是如此，并且在MBIC和MBEC测定这两者中生物膜细胞的活力都随着弹性蛋白酶抑制剂浓度的增加而恒定。总体而言，上述结果表明弹性蛋白酶抑制剂可能具有对革兰氏阳性菌的特异性活性。

实施例5—基于弹性蛋白酶抑制剂的涂层对多物种生物膜的形成和大型生物污染生物体的附着的抑制

考虑到弹性蛋白酶抑制剂具有高的抗生物膜效率，制备基于弹性蛋白酶抑制剂的抗生物膜涂层并将其浸渍到养鱼场中，以评价对天然海洋生物膜的效率(图5D)。予以注意，在本研究中，将包含非常高浓度的弹性蛋白酶抑制剂(在正己烷中等于336.64mg/L，图8)的茂原链霉菌DSM 40847粗提取物用于代替纯弹性蛋白酶抑制剂。将提取物与基于聚ε-己内酯的聚氨酯(聚合物)混合，并直接涂覆在载玻片的表面上。基于总涂层(聚合物和粗提取物)中的粗提取物的重量百分比来计算涂层的浓度。因此，分馏提取物中的其他化合物可能对我们的现场测试结果产生影响。然而，它们的作用应该是可忽略的，因为在粗提取物中没有检测到次要化合物的活性影响(图9)。

发现弹性蛋白酶抑制剂从涂层中的释放速率依赖于时间和浓度这两者(图5C)。总体上来说，弹性蛋白酶抑制剂在整个阶段中以相对较低低速率从涂层中进行释放；浓度越高，弹性蛋白酶抑制剂向人工海水中的释放越快。对于10wt％的浓度，在第二周出现的最高释放速率为约5μg天^-1cm^-2；对于其他浓度，在第一周的最大释放速率为约4μg天^-1cm^-2。释放速率随时间而降低，并取决于涂层中剩余的弹性蛋白酶抑制剂的总量。在浸渍四周后，对于10wt％和5wt％的浓度，释放速率降低至约1μg天^-1cm^-2，并且对于1.5wt％和2.5wt％的浓度，释放速率降低至0.5μg天^-1cm^-2。

从第二周到第四周，通过直接观察和CLSM观察，每周分析抗生物膜涂层的性能。根据CLSM图像的定量分析，不含弹性蛋白酶抑制剂的载玻片上的平均生物膜生物量在第二周为116.44μm³μm^-2，在第三周为259.95μm³μm^-2；而在5wt％和10wt％涂层载玻片上测定的生物膜的平均生物量在第二周小于0.1μm³μm^-2，在第三周小于120μm³μm^-2。对于低浓度(1.5wt％和2.5wt％)的涂层，在第二周的平均生物量方面与没有涂层的载玻片没有显著差异(分别为61.97μm³μm^-2和84.73μm³μm^-2)，但在第三周，生物量显著低于对照的生物量(为259.95μm³μm^-2)，平均生物量分别为约125μm³μm^-2和145μm³μm^-2(图5B)。在第四周，涂覆有低浓度的弹性蛋白酶抑制剂(1.5wt％、2.5wt％和对照)的载玻片受大型海洋生物体污染，而涂覆有高浓度的弹性蛋白酶抑制剂的载玻片表现出抗生物污染活性，并且除了边缘附近的小区域以外几乎没有幼虫沉积，这是由于在测试板上通常发现的边缘效应(图5A)。总体而言，基于弹性蛋白酶抑制剂的抗生物膜涂层在前两周中抑制了多物种细菌生物膜的形成。然而，在浸渍四周后，大型生物污染生物体最终覆盖了涂覆有低浓度的弹性蛋白酶抑制剂的载玻片，这可能是由于三周后弹性蛋白酶抑制剂的释放减少。

除了生物膜相关的感染之外，在如船体结构和海上基础设施的各种浸没表面上形成海洋生物膜也是一个严重的问题。与单种群生物膜相比，由于物种间交流作用的增加，混合种群生物膜的生物膜内具有更复杂的结构；因此，混合物种生物膜通常显著地更耐抗菌处理(30)。本申请的基于弹性蛋白酶抑制剂的涂层显著抑制多物种生物膜形成。值得注意的是，在处理期间，只有微量的弹性蛋白酶抑制剂被释放到周围环境中，从而限制了对非预期生物体的间接影响。

实施例6—弹性蛋白酶抑制剂使天然海洋生物膜的微生物群落的改变

因为在第二周结束时形成的生物膜很少，但在第四周结束时肉眼可见的污染生物体过度生长，因此仅选择在10wt％涂层上形成的三周龄生物膜和在对照载玻片(仅用基于聚ε-己内酯的聚氨酯涂覆)上的那些生物膜进行16S扩增子分析，以确定由弹性蛋白酶抑制剂触发的生物膜微生物群落的改变。将总计为3,000,000个16S rRNA基因序列(每个样品500,000个)分到31个门(将变形菌分到种水平)。如通过α-多样性和β-多样性分析所证实的，在10wt％涂层和对照载玻片之间的生物膜的微生物组成不同(图10)。在Bray-Curtis相异度(β-多样性)树状图(图6A)中，基于样品之间的微生物丰度的差异，对照组和处理组被分为两类；经处理的生物膜所观察到的OTU和Shannon多样性显著低于对照组的OTU和Shannon多样性(图6B)，这表明经处理的生物膜中物种丰富性和多样性这两者均降低。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将想到根据本申请的实施例和实施方案的各种修改或变化，并且这些修改或变化将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案进行组合，并且认为所有这些组合在本申请的范围内，但不限于此。

序列表

<110> 香港科技大学

中国大洋矿产资源研究开发协会

<120> 弹性蛋白酶抑制剂、具有对单物种和多物种生物膜都有效的抗生物膜活性的抑菌剂

<130> HKUS.148X

<150> 62/890786

<151> 2019-08-23

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 硫黄色链霉菌（Streptomyces sulphureus）

<400> 1

cctaygggrb gcascag 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 硫黄色链霉菌（Streptomyces sulphureus）

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> n为a, c, g,或者t

<400> 2

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