一种[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物及其制备方法和用途 ([1,2,4] triazolo [4,3-b ] pyridazine compound and preparation method and application thereof ) 是由 温万东 石万棋 陈齐 史焱 代明星 吴瑕 陈科 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物及其制备方法和用途。具体提供了式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其旋光异构体、或其同位素替换形式。实验结果表明,本发明提供的化合物对TRK激酶具有良好的抑制作用,对与TRK过表达相关的肿瘤(例如结肠癌)细胞具有良好的抑制效果。本发明提供的化合物在制备TRK激酶抑制剂,以及制备预防和/或治疗与TRK过表达相关的肿瘤的药物中具有广阔的应用前景。(The invention relates to a [1,2,4]]Triazolo [4,3-b]Pyridazine compounds and preparation method and application thereof. Specifically provided are compounds represented by formula I, or pharmaceutically acceptable salts thereof, or stereoisomers thereof, or optical isomers thereof, or isotopic substitution forms thereof. Experimental results show that the compound provided by the invention has a good inhibitory effect on TRK kinase and a good inhibitory effect on tumor (such as colon cancer) cells related to TRK overexpression. The compound provided by the invention has wide application prospects in preparation of TRK kinase inhibitors and medicines for preventing and/or treating tumors related to TRK overexpression.)
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
原肌球蛋白相关激酶(tropomyosin-related kinase，Trk)是一类神经生长因子受体，其家族由高度同源性的原肌球蛋白相关激酶A(tropomyosin-relatedkinase A，TrkA)、原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)、原肌球蛋白相关激酶C(TrkC)组成，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3编码。Trk激酶通过Ras/MAPK、PI3K/AKT和PLCγ等下游通路影响细胞增殖、分化、代谢、凋亡。当染色体变异发生NTRK基因融合，可导致Trk激酶下游信号通路调控失常，该通路的过度激活可导致癌症产生。
近几十年的研究结果表明，Trk激酶与多种肿瘤的发生、转移和恶化也有密切的关系，如Trk激酶在黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、恶性骨髓白血病(AML)、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、结肠癌等中都存在过表达，且这种过表达与肿瘤细胞的迁移有密切的关系。
Trk激酶在恶性肿瘤中通过多种机制激活，主要是结构重排和表达的改变。Trk激酶的编码基因NTRK重排产生嵌合癌基因，导致Trk激酶组成型激活，不再受到神经生长因子配体的调节和控制，具有致癌的风险，如在结肠癌KM12细胞中，位于1号染色体长臂上的原肌球蛋白-3基因TPM3与NTRK1就发生了基因片段重排，TPM3在第7号和8号外显子之间断裂，NTRK1在第8号外显子内部断裂，然后，TPM3直接和表达胞内结构区域的NTRK1连接，异常表达TPM3-TRKA嵌合蛋白。这种基因的改变破坏了细胞中配体NGF与TrkA的相互作用，胞内TRKA处于过度表达和持续激活状态，而下游的PI3K/AKT、Ras/MAPK和PLCγ三条信号通路也处于异常活跃状态。
越来越多的研究表明，Trk激酶选择性抑制剂对人类肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，而对正常细胞抑制作用较低，Trk激酶可以作为肿瘤治疗的有效靶点。2017年12月下旬，拜耳公司和Loxo Oncology公司合作开发的口服选择性原肌球蛋白相关激酶抑制剂Larotrectinib(LOXO-101)在美国递交新药上市申请，用于治疗携带NTRK融合基因的成人或儿童实体瘤。之前Larotrectinib已被FDA授予孤儿药资格和突破性疗法认定。该事件是精准医学走向实践的重要一步，也是基于精准医学设计的创新性临床试验-篮子试验(Basket Trial)的又一伟大实践。Larotrectinib的疗效数据早在2017年6月的ASCO会议就已公布：在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中，共招募了55例涉及13种不同肿瘤类型的NTRK融合患者，包括唾液腺癌(12人)、肉瘤癌(10人)、婴儿纤维肉瘤癌(7人)、肺癌(5人)、甲状腺癌(5人)、结直肠癌(4人)、黑色素瘤(4人)、胆管癌(2人)、胃肠道间质瘤(2人)、其他癌症(4人)，其中46个可评估的患者整体反应率(ORR)达78％，有2位患者肿瘤完全消失，最长应答时间达23个月。
因此，研究出更多结构新颖、对Trk激酶具有优异的抑制效果的化合物，对开发治疗TRK过表达的肿瘤(比如唾液腺癌、肺癌、胆管癌、胃肠道间质瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、甲状腺癌、恶性骨髓白血病、恶性胶质瘤、星形细胞瘤或结肠癌)的药物具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构新颖、对Trk激酶具有优异的抑制效果的[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物及其制备方法和用途。
本发明提供了式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其旋光异构体、或其同位素替换形式：
其中，X选自N或CR4；
R1～R5各自独立地选自氢、卤素、C1～4烷基或C1～4烷氧基；
R6～R7各自独立地选自氢、C1～4烷基或C1～4烷氧基；
R8选自羟基或羧基；
n为0～5的整数。
进一步地，
X选自N或CR4；
R1～R5各自独立地选自氢、卤素，且其中至少一个为卤素；
R6～R7各自独立地选自氢、C1～2烷基；
R8为羟基；
n为0～3的整数。
进一步地，所述化合物的结构如式II-1或式II-2所示：
其中，R1、R2、R3、R5各自独立地选自氢、氟、氯或溴，且其中至少一个为氟，一个为氯；
R6～R7各自独立地选自氢、C1～2烷基；
n为1或2；
或，所述化合物的结构如式II-2所示：
其中，R1、R2、R3、R4、R5各自独立地选自氢、氟、氯或溴，且其中至少两个为氟；
R6～R7各自独立地选自氢、C1～2烷基；
n为1或2。
进一步地，所述化合物为以下化合物之一：
本发明还提供了一种制备上述化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)化合物A’与化合物B’反应得到化合物C’；
(2)化合物C’与化合物D’反应，即式I所示化合物；
其中，Y为卤素；X、R1～R8、n如上所述。
进一步地，步骤(1)中，所述化合物A’与化合物B’的摩尔比为1：(0.8～1.2)，优选为1：1；所述反应是在有机碱的催化下进行的，所述有机碱优选为N,N'-二异丙基乙胺或吡啶；所述反应的溶剂为醇类溶剂，优选为正丁醇；所述反应的温度为105-115℃，优选为110℃，反应的时间为2～5小时，优选为3小时；所述Y为氯；
和/或，步骤(2)中，所述化合物C’与化合物D’的摩尔比为1:(3～10)，优选为1：4；所述反应的溶剂为醇类溶剂，优选为正丁醇；所述反应的温度为105-115℃，优选为110℃，反应的时间为0.5～3小时，优选为1小时。
进一步地，步骤(1)中，所述反应结束后，还包括以下提纯步骤：将反应所得体系浓缩，除去溶剂，然后经过硅胶柱层析分离，层析分离采用的流动相为石油醚：乙酸乙酯体积比＝2:1的混合溶液；
和/或，步骤(2)中，所述反应结束后，还包括以下提纯步骤：将反应所得体系浓缩，除去溶剂，然后经过硅胶柱层析分离，层析分离采用的流动相为二氯甲烷：甲醇体积比＝10:1的混合溶液。
本发明还提供了上述化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其旋光异构体、或其同位素替换形式在制备TRK激酶抑制剂中的用途。
本发明还提供了上述化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其旋光异构体、或其同位素替换形式在制备预防和/或治疗与TRK过表达相关的肿瘤的药物中的用途，所述TRK过表达的肿瘤优选为唾液腺癌、肺癌、胆管癌、胃肠道间质瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、甲状腺癌、恶性骨髓白血病、恶性胶质瘤、星形细胞瘤或结肠癌，更优选为结肠癌。
本发明还提供了一种治疗与TRK过表达相关的肿瘤的药物，它是以上述化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其旋光异构体、或其同位素替换形式为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，前缀Ca～b烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，C1～4烷基是指包含1～4个碳原子的直链或支链的烷基。
C1～4烷氧基是指包含1～4个碳原子的直链或支链的烷氧基。
卤素为氟、氯、溴或碘。
“同位素替换形式”指化合物中的一个或两个以上的原子被其对应的同位素替换后得到的化合物。比如化合物中的一个或两个以上的氢(H)被氘(D)或氚(T)替换后得到的化合物；比如化合物中的一个或两个以上的碳12被碳11或碳13替换后得到的化合物。
“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
“盐”是将化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和/或碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。
本发明中所述“药学上可接受的盐”可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
实验结果表明，本发明提供的化合物对TRK激酶具有良好的抑制作用，对与TRK过表达相关的肿瘤(例如结肠癌)细胞具有良好的抑制效果。本发明提供的化合物在制备TRK激酶抑制剂，以及制备预防和/或治疗与TRK过表达相关的肿瘤的药物中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1本发明化合物1的制备
按照以下合成路线制备化合物1：
具体制备方法包括以下步骤：
(1)向反应瓶中加入化合物A0.40g(即2.21mmol)、化合物B0.50g(即2.21mmol)、2.5mL N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA)和10mL正丁醇，加热至110℃搅拌反应3h，TLC显示原料消失，反应完全。减压浓缩除去溶剂，将所得浓缩物经硅胶柱层析分离(流动相为石油醚：乙酸乙酯体积比＝2:1的混合溶液)，得到0.73g类白色固体，即化合物C，收率91.7％。LC/MS:m/z＝360.1[M+H]。
(2)取化合物C 0.50g(即1.4mmol)、乙醇胺(即化合物D，0.37g，6.0mmol)和10mL正丁醇加入反应瓶，反应体系在110℃下搅拌1h，TLC显示原料消失，反应完全。减压浓缩除去溶剂，将所得浓缩物经硅胶柱层析分离(流动相为二氯甲烷：甲醇体积比＝10:1的混合溶液)，得0.45g化合物1，收率83.8％。LC/MS m/z＝389.1[M+H]；1HNMR(dmso-d6):9.01(1H)，8.10(d,J＝7.5,1H)，7.35(d,J＝7.51H),7.05-7.19(m，3H)，4.65(s,1H),4.35(m,1H),3.50(t,2H),3.07-3.14(m,4H),1.55-1.78(m,4H)。
实施例2本发明化合物2～4的制备
将实施例1中的化合物A、D分别替换为表1中对应的化合物，采用与实施例1相同的合成路线和方法，制得本发明得化合物2～4。
化合物2～4的结构表征如下：
化合物2：LC/MS m/z＝417.4[M+H]；1HNMR(dmso-d6):8.35(s，1H)，8.10(d,J＝7.5,1H)，7.35(d,J＝7.5，1H),7.05-7.19(m，3H)，4.41(s,1H),4.30-4.38(m，1H)，4.18(m,1H),3.82-3.84(m，2H)，3.07-3.14(m,2H),1.55-1.78(m,6H)，1.26(d,3H)。
化合物3：LC/MS m/z＝406.1[M+H]；1HNMR(dmso-d6):9.01(1H)，8.52(s,1H)，8.10(d,J＝7.5,1H)，7.92(s,1H)7.35(d,J＝7.5，1H)，4.69(s,1H),4.35(m,1H)，3.50(t,2H),3.07-3.14(m,4H),1.55-1.78(m,4H)。
化合物4：LC/MS m/z＝435.1[M+H]；1HNMR(dmso-d6):8.56(s,1H),8.35(s,1H)，8.10(d,J＝7.5,1H)，7.92(s,1H)7.35(d,J＝7.5，1H),4.41(s,1H),4.38(m,1H),4.13(m，1H)，3.87(t,2H),3.07-3.14(m,2H),1.55-1.78(m,6H)，1.27(d,3H)。
表1化合物2～4的制备原料和结构
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1本发明化合物对TRK激酶的抑制作用
1.实验方法
将TK-biotin底物，ATP，酶以及一定浓度的待测化合物在相应的1×KinaseBuffer中室温反应。待测化合物的作用终浓度为1uM和0.1uM，控制反应体系中DMSO为1％。向所有反应孔中加入10μl经50mM Hepes/NaOH pH 7.0，0.1％BSA，0.8M KF，20mM EDTA稀释的Streptavidin-XL665和TK antibody europium cryptate(1:100)混合检测液，室温反应1h后，用Multilabel Reader(MD,SpectraMax i3x)仪器检测荧光信号(320nm刺激,665nm，615nm发射)。分别加入TRK激酶A，活性稳定后，加入本发明待测化合物和LOXO-101，计算待测化合物对TRK激酶的活性抑制率达到50％所需要添加的浓度，记为IC50。
2.实验结果
表2各化合物对TRK激酶的活性抑制效果
化合物
IC<sub>50</sub>(nM)
LOXO-101
32
化合物1
4.2
化合物2
18.2
化合物3
24
化合物4
35
结果如表2所示。可以看出，本发明化合物对TRK激酶具有良好的抑制作用，其IC50为4.2～35nM；尤其是化合物1、化合物2和化合物3，其对TRK激酶的活性抑制效果甚至比阳性对照药物LOXO-101更好。
实验例2本发明化合物对Trk过表达肿瘤细胞株的抑制作用
1.实验方法
将KM12细胞(人结肠癌细胞)平铺于384孔板上，培养24小时，将不同浓度的待测化合物加入到培养孔板中，每个待测化合物设置9个浓度，最高浓度为10uM，按照1：3比例梯度稀释。然后将细胞于37℃下培养24小时。加入CellTiter-Glo试剂，并以envision方法进行检测。计算各待测化合物对KM12细胞的半数抑制浓度IC50。以FDA批准的在中国申报临床实验的Trk激酶抑制剂LOXO-101作为阳性对照。
2.实验结果
表3各化合物对KM12细胞的抑制效果
结果如表3所示。可以看出，本发明化合物对KM12细胞具有良好的抑制作用，其IC50为0.014～0.102uM；尤其是化合物1和化合物4，其IC50分别低至0.014uM和0.054uM，对KM12细胞的抑制效果甚至比阳性对照药物LOXO-101更好。
综上，本发明提供了一种式I所示的[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物化合物。实验结果表明，本发明提供的化合物对TRK激酶具有良好的抑制作用，对与TRK过表达相关的肿瘤(例如结肠癌)细胞具有良好的抑制效果。本发明提供的化合物在制备TRK激酶抑制剂，以及制备预防和/或治疗与TRK过表达相关的肿瘤的药物中具有广阔的应用前景。
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