一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法
阅读说明：本技术 一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法 (Method for removing endotoxin in PHAs by fermentation method ) 是由 沈宏伟 余柳松 吕金艳 司徒卫 林枫 于 2021-01-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医用材料技术领域,尤其涉及一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法。微生物发酵法生产的PHAs中含有内毒素,含量值超过限量标准,使其难以作为医疗器械产品的原料使用。采用化学降解法能有效去除内毒素,但很可能造成PHAs的降解,使其分子量降低从而失去应用价值。针对上述问题,本发明提供一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法,主要利用内毒素脂质A中β-1,6糖苷键在酸性条件下容易水解,酸性体系中加入甘油等小分子醇可以保护PHAs的酯键不被破坏的特点,不仅成功去除了PHAs中大量的内毒素,还使得PHAs几乎不被降解,其分子量基本不变,取得了显著的效果,此方法简单、高效,具有较高的商业价值。(The invention relates to the technical field of medical materials, in particular to a method for removing endotoxin in PHAs by a fermentation method. PHAs produced by microbial fermentation contain endotoxin, and the content value exceeds the limit standard, so that the PHAs are difficult to be used as raw materials of medical appliance products. Endotoxin can be effectively removed by adopting a chemical degradation method, but the degradation of PHAs is likely to be caused, so that the molecular weight of PHAs is reduced, and the application value is lost. Aiming at the problems, the invention provides a method for removing endotoxin in fermentation-process PHAs, which mainly utilizes the characteristic that beta-1, 6 glycosidic bonds in endotoxin lipid A are easy to hydrolyze under an acidic condition, and micromolecular alcohol such as glycerol is added into an acidic system to protect ester bonds of the PHAs from being damaged, thereby successfully removing a large amount of endotoxin in the PHAs, ensuring that the PHAs are hardly degraded, ensuring that the molecular weight of the PHAs is basically unchanged, obtaining remarkable effects, and having simple and efficient method and higher commercial value.)
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法。
背景技术
多聚羟基烷酸(PHAs)是一类由微生物合成的天然高分子聚酯，因其具有良好的热塑性、压电性、光学活性和力学机械性能等物理学特性及优良的生物可降解性、生物相容性、生物可再生性、表面可修饰性和降解产物无毒性等生物学与环境学特性，已成为当前生物医用材料的重要候选材料之一。
目前，大多数PHAs的生产方法为微生物发酵法，生产PHAs菌株为革兰氏阴性细菌。而革兰氏阴性细菌细胞壁中含有一种蛋白质、多糖和脂类的抗原复合物(即细菌内毒素)，当细胞破裂或溶解时这类物质会被释放出来。内毒素可以使人体产生各种临床反应，如果将含有大量内毒素的PHAs用于医疗卫生，特别是医学组织工程方面，会使人体发热、头痛、恶心、呕吐和休克,严重时甚至会导致死亡。因此，国内外对于应用于临床的医疗器械材料都有严格的要求，例如：美国食品与药品管理局(FDA)要求医疗器械用具的内毒素含量不得超过20EU/g。
由于PHAs为胞内产物，所以必须经破壁或改变细胞透性才能被分离纯化。如果用革兰氏阴性细菌发酵生产PHAs，在破壁提取产物的同时也会致使大量的内毒素释放而污染PHAs产品，进而影响该产品在医学组织工程方面的应用。因此，在PHAs材料用于临床之前必须进行内毒素的去除，使之符合FDA规定的要求。
目前，化学降解法是去除PHAs中内毒素的常用方法，化学降解法是指用强酸、强碱或强氧化剂等使内毒素降解达到去除内毒素的目的(Campbell D H,Cherkin A.THEDESTRUCTION OF PYROGENS BY HYDROGEN PEROXIDE[J].Science,1945,102(2656):535-536.)，但这种方法很可能造成PHAs的降解，使其分子量降低从而失去应用价值。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题是：微生物发酵法生产的PHAs中含有内毒素，含量值超过限量标准，使其难以作为医疗器械产品的原料使用。采用化学降解法能有效去除内毒素，但很可能造成PHAs的降解，使其分子量降低从而失去应用价值。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供一种去除发酵法PHAs中内毒素的方法，按照以下步骤进行：
(1)在医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝0-3；
(2)在上述溶液中加入小分子醇，使得小分子醇在上述溶液中的质量体积浓度为0.001-0.01g/cm3，搅拌得到均匀溶液；
(3)将1重量份PHAs加入到3-50重量份步骤(2)得到的均匀溶液中，搅拌均匀后，在5-70℃下处理30min-12h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医药用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到PHAs固体。
具体地，所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸或丁酸。
具体地，所述小分子醇为甘油、丙二醇、丁二醇或己二醇。
具体地，所述PHAs的单体包括PHB、PHBV、P(HDD-HO-HTDE)、P(3HB-4HB)、P(HO-HD-HDD)、P(HD-HDD)、P(HB-HHx)、P(3HB-4HB-3HHx)、P(HHx-HO)或P(HD-HDD-HO-HHx)。
具体地，所述步骤(3)中离心机的转速为3000-12000rpm。
本发明的有益效果是：
(1)本发明去除PHAs中内毒素的方法简单、高效，不仅可以有效去除PHAs中的内毒素，还能防止PHAs被降解；
(2)本发明主要利用了内毒素脂质A中β-1,6糖苷键在酸性条件下容易水解且酸性体系中加入甘油等小分子醇可以保护PHAs的酯键不被破坏的特点，不仅成功去除了PHAs中大量的内毒素，还使得PHAs几乎不被降解，其分子量基本不变，取得了显著的效果。
具体实施方式
现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明以下实施例所采用的调节溶液pH的酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸或丁酸。
本发明以下实施例步骤(3)中离心机的转速为3000-12000rpm。
实施例1
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝2；
(2)在上述溶液中加入0.5mL甘油，搅拌得到均匀溶液；
(3)取150g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为15EU/g，分子量为60.6kDa的PHB，搅拌均匀后，在37℃下处理5h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到PHB固体。
实施例2
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝0；
(2)在上述溶液中加入0.1mL丁二醇，搅拌得到均匀溶液；
(3)取30g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量8EU/g，分子量为620kDa的PHBV，搅拌均匀后，在5℃下处理12h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到PHBV固体。
实施例3
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝3；
(2)在上述溶液中加入0.2mL丙二醇，搅拌得到均匀溶液；
(3)取500g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为11EU/g，分子量为580kDa的P(3HB-4HB)，搅拌均匀后，在70℃下处理1h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到P(3HB-4HB)固体。
实施例4
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝2；
(2)在上述溶液中加入0.3mL甘油，搅拌得到均匀溶液；
(3)取300g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为4EU/g，分子量为550kDa的P(HD-HDD)，搅拌均匀后，在50℃下处理3h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到P(HD-HDD)固体。
实施例5
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝2.5；
(2)在上述溶液中加入0.6mL丁二醇，搅拌得到均匀溶液；
(3)取100g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为7.3EU/g，分子量为650kDa的P(HHx-HO)，搅拌均匀后，在50℃下处理3h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到P(HHx-HO)固体。
实施例6
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝2；
(2)在上述溶液中加入0.5mL己二醇，搅拌得到均匀溶液；
(3)取150g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为15EU/g，分子量为60.6kDa的P(HB-HHx)，搅拌均匀后，在37℃下处理5h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到P(HB-HHx)固体。
对比例1同实施例1，不同之处在于：对比例1中PHB的内毒素按照以下步骤去除：
(1)在100mL医用纯水中加入酸，调节溶液的pH＝2；
(2)取150g步骤(1)得到的溶液，加入10g内毒素含量为15EU/g，分子量为606kDa的PHB，搅拌均匀后，在37℃下处理5h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到PHB固体。
对比例2同实施例1，不同之处在于：对比例2中PHB的内毒素按照以下步骤去除：
(1)在100mL医用纯水中加入0.5mL甘油，搅拌得到均匀溶液；
(3)取150g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为15EU/g，分子量为606kDa的PHB，搅拌均匀后，在37℃下处理5h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到PHB固体。
对比例3同实施例1，不同之处在于：对比例3中PHB的内毒素按照以下步骤去除：
(1)在100mL医用纯水中加入碳酸氢钠，调节溶液的pH＝10；
(2)在上述溶液中加入0.5mL甘油，搅拌得到均匀溶液；
(3)取150g步骤(2)得到的均匀溶液，加入10g内毒素含量为15EU/g，分子量为606kDa的PHB，搅拌均匀后，在37℃下处理5h，然后离心分离去掉上清液收集底部沉淀，将获得的沉淀用无热源医疗用水清洗3次，每次充分搅拌30min，最后，离心分离收集底部沉淀，冷冻干燥24h后再在40℃、-0.1MPa下真空干燥24h，即得到PHB固体。
性能评价：
根据《中国药典》中所述的内毒素检查法(鲎试剂凝胶法)分析检测实施例1-6和对比例1-3中PHAs纯化后的内毒素含量；采用GPC检测实施例1-6和对比例1-3中PHAs纯化后的的分子量。具体结果见表1：
表1
测试项
内毒素(EU/g)
分子量(kDa)
实施例1
0.015
560
实施例2
0.030
580
实施例3
0.026
535
实施例4
0.011
508
实施例5
0.023
600
实施例6
0.035
591
对比例1
0.012
120
对比例2
14.4
603
对比例3
0.019
30
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。