一种制备α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精的方法
阅读说明：本技术 一种制备α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精的方法 (Method for preparing alpha-1, 3 glycosidic bond modified low-calorie dextrin ) 是由 吴敬 夏伟 魏贝贝 王蕾 陈晟 杨卫康 金雪薇 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精的方法,属于功能食品领域。所述低热量糊精,α-1,3糖苷键含量为2～40％,α-1,4糖苷键含量为10～30％,α-1,6糖苷键含量为45～80％,平均分子量约为1000～5000Da,聚合度约5～30。所述低热量糊精的制备方法为：以淀粉为底物,利用4,6-α-葡萄糖基转移酶Gtf B及分支蔗糖酶BSR-B-△1进行酶促反应,经热稳定α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶酶解后分离、干燥,制得含α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精。该方法条件温和,α-1,3糖苷键含量高,成本低,为实现复杂键型低热量糊精的工业化生产奠定基础。(The invention discloses a method for preparing alpha-1, 3 glycosidic bond modified low-calorie dextrin, and belongs to the field of functional foods. The low-calorie dextrin has the alpha-1, 3 glycosidic bond content of 2-40%, the alpha-1, 4 glycosidic bond content of 10-30%, the alpha-1, 6 glycosidic bond content of 45-80%, the average molecular weight of about 1000-5000Da and the polymerization degree of about 5-30. The preparation method of the low-calorie dextrin comprises the following steps: starch is used as a substrate, enzymatic reaction is carried out by using 4, 6-alpha-glucosyltransferase Gtf B and branching sucrase BSR-B-delta 1, and the low-calorie dextrin modified by alpha-1, 3 glycosidic bonds is prepared by separating and drying after thermal stability alpha-amylase and amyloglucosidase enzymolysis. The method has the advantages of mild conditions, high content of alpha-1, 3 glycosidic bonds and low cost, and lays a foundation for the realization of the industrial production of the complex bond type low-calorie dextrin.)
技术领域
本发明涉及一种制备α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精的方法，属于功能食品领域。
背景技术
低热量糊精是一种不能被人体消化的碳水化合物，作为一种新型的食品添加辅料和营养素，低热量糊精被证明具有降低能量值、改善口味、增强质感等多种功效，并且对由生活水平提高饮食精细引起的“富贵病”(糖尿病、肥胖、肠道癌、便秘等)有良好的防治功效，是现代生活不可或缺的重要营养素。
目前为止，主要采用高温酸解化学法介导糖苷键重构制备低热量糊精，以不同浓度酸和温度处理淀粉底物，水解其中的α-1,4糖苷键，使产生的不同糖链之间重新发生脱水缩合而形成抗消化性糖苷键。但高温酸解化学法存在能耗大、产率低、分离纯化工艺复杂且易产生糠醛等有害物质等突出问题，因此酶转化法作为一种绿色节能高效安全的替代方法可显著降低低热量糊精生产成本、提高产品品质、满足大众消费需求，是推动低热量糊精产业可持续发展的原动力。以淀粉为原料高效酶法制备低热量糊精是推动其产业可持续发展的关键。
我们以淀粉为底物利用4,6-α-葡萄糖基转移酶Gtf B生成一种低分子量抗性糊精，该抗性糊精富含α-1,6糖苷键，分子量低且产率高，已公开于公开号为CN202010288282.5的中国专利文献中，但该抗性糊精仅含α-1,4和α-1,6糖苷键。如何进一步丰富抗性糊精中的键型，提高抗性糊精的应用价值，一直是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺点，提供一种α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精制备方法，可在线性α-1,6糖苷键糖链或异麦芽/麦芽-多糖链上引入α-1,3键，使产物具有-(1→3,6)-α-D-Glcp-(1→6)-分支点。本发明的低热量糊精，按质量百分比包括：α-1,3糖苷键含量为2～40％，α-1,4糖苷键含量为10～30％，α-1,6糖苷键含量为45～80％。并利用分支蔗糖酶BSR-B-△1与已公开于公开号为CN202010288282.5的中国专利文献中的4,6-α-葡萄糖基转移酶的生化特性开发了一种新的工艺技术，可获得一系列符合低热量糊精理化指标的产品，该产品溶解性好、α-1,3糖苷键含量高，且抗性含量达60％以上，其可能构成一种新型益生元，为维持和改善人类健康提供有力保障，本发明为酶法制备多键型键型低热量糊精的工业化生产奠定坚实的理论基础。
本发明提供一种制备低热量糊精的方法，所述方法是利用4,6-α-葡萄糖基转移酶和分支蔗糖酶BSR-B-△1，转化淀粉生成低热量糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列已在申请号为CN202010288282.5专利中公开。
在本发明的一种实施方式中，所述分支蔗糖酶BSR-B-△1来源于柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)NRRL B-742。
在本发明的一种实施方式中，分支蔗糖酶BSR-B-△1的述氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述分支蔗糖酶在反应体系中的添加量为0.5-5U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶在反应体系中的添加量为2500-4000U/g底物。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为谷物淀粉，或薯类淀粉，淀粉衍生物，或含有淀粉的物质。
在本发明的一种实施方式中，所述谷物淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉；所述薯类淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉等薯类淀粉；所述淀粉衍生物为麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉等淀粉衍生物；所述含有淀粉的物质为大米蛋白肽。
在本发明的一种实施方式中，将淀粉制备成悬浊液，将悬浊液糊化、液化，制备得到反应液；利用普鲁兰酶和4,6-α-葡萄糖基转移酶催化反应液；催化结束后加入蔗糖和分支蔗糖酶BSR-B-△1，在35-40℃反应20-30h；反应结束后，将反应液灭酶，再加入α-淀粉酶反应20-40min，再加入淀粉葡萄糖苷酶，反应20-40min；将制备得到的反应液进行消化，并过滤干燥，得到成品。
在本发明的一种实施方式中，蔗糖在反应体系中的终浓度为2～40g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，淀粉制成的悬浊液浓度为10～30g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶添加量为10～80U/g底物。
在本发明的一种实施方式中，调节温度至90～100℃，添加热稳定α-淀粉酶，反应30min；α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物。
在本发明的一种实施方式中，调节温度至50～70℃，调节pH至4.0～5.0，加入淀粉葡萄糖苷酶，反应25～35min；反应后对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖；所述淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物。
本发明提供所述方法制备得到的抗性糊精。
本发明提供所述方法，或所述抗性糊精在食品或化妆品领域中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含α-1,3糖苷键的低热量糊精，和/或利用低聚糖，和/或生产含α-1,3糖苷键的糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含乳制品、婴幼儿配方食品、米面制品、肉制品、糖果、饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述乳制品包含酸奶、奶酪、冰淇淋、植物蛋白乳制品。
在本发明的一种实施方式中，饮料包含运动饮料、低糖饮料、膳食纤维饮料、五谷杂粮饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述米面制品包含烘焙制品、面条、米粉、方便面条、方便米饭。
在本发明的一种实施方式中，所述烘焙制品包含面包、西饼、蛋糕。
本发明的有益效果：本发明所提供的方法和现有技术相比，具有以下特点：
(1)本发明所使用的分支蔗糖酶BSR-B-△1不仅能以线性α-1,6键右旋糖酐为受体还可以异麦芽/麦芽-多糖(IMMP)为受体，不同浓度蔗糖为供体，引入-(1→3,6)-α-D-Glcp-(1→6)-分支点，生成一系列α-1,3糖苷键含量可控的低热量糊精；
(2)本发明利用双酶法制备出含α-1,3糖苷键低热量糊精，α-1,3糖苷键含量为2～40％，α-1,4糖苷键含量为10～30％，α-1,6糖苷键含量为45～80％，平均分子量为1000-5000Da，平均聚合度为5～30，且膳食纤维含量在60％以上；
(3)相比于高温酸解法制备低热量糊精，本方法产率高，制备工艺简单，反应条件比较温和，清洁安全、无毒性产物生成；
(4)本发明制备得到的低热量糊精可作为食品添加剂，进入结肠，例如作为益生元能够被用于多种食品应用中，从乳制品到烘焙食品、糖果和饮料应用，可改善食品的质地和口感，便于在食品、保健品尤其是高端食品和保健品领域广泛应用。
附图说明
图1为含α-1,3糖苷键低热量糊精键型比例图，蔗糖供体添加量为25～30％。
图2为含α-1,3糖苷键低热量糊精键型比例图，蔗糖供体添加量为7～10％。
图3为含α-1,3糖苷键低热量糊精键型比例图，蔗糖供体添加量为2～4％。
图4为4,6-α-葡萄糖基转移酶产物键型比例图。
图5为不同含量α-1,3糖苷键低热量糊精分子量分布。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不局限于此。
(一)实施例中所述的培养基配方如下：
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO4 2.31。
(二)实施例中所述的耐高温α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、普鲁兰酶均购自山东隆科特酶制剂有限公司，酶活分别为40kU/mL、100kU/mL、2kU/mL。
(三)酶活测定：
用碘法测定实施例3～5中用到的4,6-α-葡萄糖基转移酶GtfB总酶活，具体测定方法及酶活定义已公开于申请号为CN202010288282.5的中国专利文献中；
采用改良的3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定实施例3～5中用到的分支蔗糖酶BSR-B-△1酶活：
(1)用50mM醋酸缓冲液(pH 5.5)配制20g/L的蔗糖为底物，15mL具塞试管中加入1mL底物、0.9mL 50mM醋酸缓冲液(pH5.5)，震荡混匀后，放入40℃水浴锅预热10min。加入100μL酶液/空白，40℃反应30min后加入3mL DNS，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15mL，540nm下测吸光度(以灭活的酶液或缓冲液做空白对照)；
(2)酶活定义：在上述酶反应条件下，每分钟生成1μmol的果糖所需的酶量为1个酶活单位(U)。
S：还原糖量；1000：mg与μg之间的换算；n：酶活稀释倍数
T：反应时间；V：酶液量；M：相对分子质量
(3)DNS试剂的配制：将6.5g DNS于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解，加入262mL的2mol/L氢氧化钠溶液，再加到500mL含有185.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，然后分别加入5.0g苯酚和5.0g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加入蒸馏水定容1L，充分混匀保存于棕色瓶中。
(四)膳食纤维含量测定方法：
测定方法参照国标GB/T22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》，测定结果为质量占比，采用百分比表示，例如60g/L表示为60％。
(1)IDF+SDF的计算
式中：
IDF+SDF—试样中不溶性膳食纤维(IDF)和高分子质量在乙醇中沉淀的可溶性膳食纤维(SDF)的总含量的百分含量(以质量分数计)，％；
mSR1和mSR2—双份试样中1和2的坩埚中残渣的质量，单位为毫克(mg)；
mPS—残渣中蛋白质的质量，单位为毫克(mg)；
mAS—残渣中灰分的质量，单位为毫克(mg)；
mBR—空白的坩埚中残渣的质量，单位为毫克(mg)；
mS1和mS2—双份试样1和2的质量，单位为毫克(mg)。
(2)RMD的计算
式中：
RMD—试样中低分子质量可溶于乙醇的膳食纤维的百分含量(以质量分数计)，％；
mRMD1和mRMD2—双份试样1和2中DP≥3的低分子质量可溶于乙醇的膳食纤维的质量，单位为毫克(mg)；
mS1和mS2—双份试样1和2的质量，单位为毫克(mg)。
式中：
PARMD—DP≥3的低分子质量可溶于乙醇的膳食纤维的色谱峰面积；
PAglyIS—丙三醇内标的色谱峰面积；
mglyIS—抽滤液中加入的丙三醇内标的质量，单位为毫克(mg)；
RF—右旋葡萄糖的响应因子。
(3)TDF的计算
TDF＝(IDF+SDF)+RMD
式中：
TDF—试样中总膳食纤维的百分含量，％。
(4)色谱参考条件
色谱柱：Agilent Hi-Plex Ca,流动相为超纯水，流速为0.5mL/min,柱温80℃，检测器温度为40℃，进样量为10μL。
实施例1：分支蔗糖酶BSR-B-△1基因的合成及大肠杆菌转化
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的目的基因分支蔗糖酶基因(brs-b-△1)片段，摇瓶发酵，提取重组质粒pET-24a-brs-b-△1，转化至E.coli BL21(DE3)。
(1)将提前制备好的E.coliBL21(DE3)感受态放在冰上5min，向其中加入5μL重组质粒pET-24a-brs-b-△1，轻柔吹吸均匀后，置于冰上静置30min；
(2)42℃水浴热激90s，迅速取出于冰上冷却2min；
(3)加入200μL 37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃轻微振荡培养约40min，使细胞复苏；
(4)取适量复苏的感受态细胞涂布于含卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h，观察单菌落生长情况；
(5)挑选单菌落至含卡那霉素(100μg/mL)抗性的10mL液体LB培养基中，37℃培养8h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。测序验证正确的阳性转化子即为含质粒pET-24a-brs-b-△1的基因工程大肠杆菌。
实施例2：摇瓶发酵产酶
将实施例1中得到的重组大肠杆菌接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后，以发酵培养基体积5％的接种量转接至50mL TB发酵培养基中，37℃、200rpm恒温培养1-2h，在菌体OD600为0.5～0.7时添加IPTG(终浓度0.4mM)并转至25℃、200rpm诱导发酵12h。发酵结束后，将发酵液经高压匀浆破碎(破碎条件为4℃，800Bar)后离心(8000rpm、20min、4℃)，上清即为重组大肠杆菌所产的分支蔗糖酶BSR-B-△1酶液。
测定酶液酶活，经测定，分支蔗糖酶的酶活为1U/mL。
实施例3：4,6-α-葡萄糖基转移酶与分支蔗糖酶BSR-B-△1在低热量糊精制备中的应用
(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％(20g/100mL)的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为3-7；
(2)冷却至30-45℃，调节pH值5.0-7.5，同时添加普鲁兰酶10-50U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶2500-4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，37℃反应24h；
(3)调pH值5.0-6.0，加入终浓度为25-30％(25-30g/100mL)蔗糖，同时加入1-2U/mL的分支蔗糖酶BSR-B-△1，放入恒温式水浴摇床，45℃反应24h；
(4)升温至95℃灭酶，加入热稳定α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物，置于95℃水浴中持续振荡，反应30min；
(5)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；
(6)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖；
(7)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。
测定所得的低热量糊精产率为52.52％，经酵母消化后，抗性含量为89.97％，α-1,3键含量为21.68％，α-1,4键含量为14.45％，α-1,6键含量为63.87％(如图1)，平均分子量约3852Da，约24个聚合度葡萄糖。
实施例4：4,6-α-葡萄糖基转移酶与分支蔗糖酶BSR-B-△1在低热量糊精制备中的应用
(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％(20g/100mL)的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为3-7；
(2)冷却至30-45℃，调节pH值5.0-7.5，同时添加普鲁兰酶10-50U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶2500-4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，37℃反应24h；
(3)调pH值5.0-6.0，加入7-10％(7-10g/100mL)蔗糖，同时加入1-2U/mL分支蔗糖酶，放入恒温式水浴摇床，45℃反应24h；
(3)升温至95℃灭酶，加入热稳定α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物，置于95℃水浴中持续振荡，反应30min；
(4)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；
(5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖；
(6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。
测定所得的低热量糊精产率为60.18％，经酵母消化后，抗性含量为92.1％，α-1,3键含量为14.66％，α-1,4键含量为16.47％，α-1,6键含量为68.89％(如图2)，平均分子量约3234Da，约20个聚合度葡萄糖。
实施例5：4,6-α-葡萄糖基转移酶与分支蔗糖酶BSR-B-△1在低热量糊精制备中的应用
(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％(20g/100mL)的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为3-7；
(2)冷却至30-45℃，调节pH值5.0-7.5，同时添加普鲁兰酶10-50U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶2500-4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，37℃反应24h；
(3)调pH值5.0-6.0，加入2-4％(2-4g/100mL)蔗糖，同时加入1-2U/g分支蔗糖酶，放入恒温式水浴摇床，45℃反应24h；
(4)升温至95℃灭酶，加入热稳定α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物，置于95℃水浴中持续振荡，反应30min；
(5)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；
(6)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖；
(7)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。
测定所得的低热量糊精产率为63.25％，经酵母消化后，抗性含量为90.32％，α-1,3键含量为7.55％，α-1,4键含量为17.15％，α-1,6键含量为75.3％(如图3)，平均分子量约3097Da，约19个聚合度葡萄糖。
对比例1
具体实施方式参见实施例3，区别在于，在制备过程中不添加蔗糖与分支蔗糖酶，反应结束后，测定所得的低热量糊精产率为49.91％，经酵母消化后，抗性含量为89％(在制备得到的低热量糊精中的占比)，α-1,4键比率为12.19％，α-1,6键比率为87.81％，无α-1,3糖苷键，平均分子量约3057Da，约19个聚合度葡萄糖。
(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化，加α-淀粉酶液化10-30min，控制DE值为3-7；
(2)冷却至30-45℃，调节pH值5.0-7.5，同时添加普鲁兰酶10-50U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶2500-4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，37℃反应24h；
(3)升温至95℃灭酶，加入热稳定α-淀粉酶至酶的作用剂量不少于1000U/g底物，置于95℃水浴中持续振荡，反应30min；
(4)将反应物取出冷却至室温，调pH至4.0-5.0，加淀粉葡萄糖苷酶至酶的作用剂量不少于660U/g底物，置于60℃水浴摇床中持续振荡，反应30min；
(5)反应结束后95℃，20min灭酶，加入食品级干酵母粉10g/L进行消化，放入酵母摇床中，30℃、200rpm反应12h，以对产物进行纯化，去除体系中的葡萄糖、麦芽糖等小分子糖；
(6)将反应产物8000rpm离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤后喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。
由于该反应产物在酶反应后处理时淀粉葡萄糖苷酶加量不足660U/g底物(实际添加66U/g底物)，造成转化产物中部分α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键未被糖化酶水解完全，使膳食纤维含量偏高至75.32％，我们根据国标GB/T22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》规定的淀粉葡萄糖苷酶处理后测得该转化产物实际产率为49.91％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种制备α-1,3糖苷键修饰的低热量糊精的方法
<130> BAA200815A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1282
<212> PRT
<213> Leuconostoc citreum
<400> 1
Met Ala Asp Thr Gln Thr Pro Val Gly Thr Thr Gln Ser Gln Gln Asp
1 5 10 15
Leu Thr Gly Gln Thr Gly Gln Asp Lys Pro Thr Thr Lys Glu Val Ile
20 25 30
Asp Lys Lys Glu Pro Val Pro Gln Val Ser Ala Gln Asn Val Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Ala Asp Ala Lys Thr Pro Lys Ala Asp Asp Lys Gln Asp Thr
50 55 60
Gln Pro Thr Asn Ala Gln Leu Pro Asp Gln Gly Asn Lys Gln Thr Asn
65 70 75 80
Ser Asn Ser Asp Lys Gly Val Lys Glu Ser Thr Thr Ala Pro Val Lys
85 90 95
Thr Thr Asp Val Pro Ser Lys Ser Val Ala Pro Glu Thr Asn Thr Ser
100 105 110
Ile Asn Gly Gly Gln Tyr Val Glu Lys Asp Gly Gln Phe Val Tyr Ile
115 120 125
Asp Gln Ser Gly Lys Gln Val Ser Gly Leu Gln Asn Ile Glu Gly His
130 135 140
Thr Gln Tyr Phe Asp Pro Lys Thr Gly Tyr Gln Thr Lys Gly Glu Leu
145 150 155 160
Lys Asn Ile Asp Asp Asn Ala Tyr Tyr Phe Asp Lys Asn Ser Gly Asn
165 170 175
Gly Arg Thr Phe Thr Lys Ile Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Glu Lys Asp
180 185 190
Gly Met Trp Gln Tyr Val Asp Ser His Asp Lys Gln Pro Val Lys Gly
195 200 205
Leu Tyr Asp Val Glu Gly Asn Leu Gln Tyr Phe Asp Leu Ser Thr Gly
210 215 220
Asn Gln Ala Lys His Gln Ile Arg Ser Val Asp Gly Val Thr Tyr Tyr
225 230 235 240
Phe Asp Ala Asp Ser Gly Asn Ala Thr Ala Phe Lys Ala Val Thr Asn
245 250 255
Gly Arg Tyr Ala Glu Gln Thr Thr Lys Asp Lys Asp Gly Asn Glu Thr
260 265 270
Ser Tyr Trp Ala Tyr Leu Asp Asn Gln Gly Asn Ala Ile Lys Gly Leu
275 280 285
Asn Asp Val Asn Gly Glu Ile Gln Tyr Phe Asp Glu His Thr Gly Glu
290 295 300
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Asn Glu Ala Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Asn Gly Asn Leu Asn Tyr
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Asn Ala Val Asn Asn Leu Ser Ala Asn Asn Phe Lys Asn Leu Val Asp
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Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Gly Ser Asn Ile Pro Gln Val Gly Met
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His His His His
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<210> 2
<211> 3858
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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caccaccatt aagaattc 3858
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