一种酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法 (Method for preparing thermoreversible starch-based gel with controllable gel strength by enzyme method ) 是由 柏玉香 王禹 金征宇 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法,属于淀粉改性技术领域。本发明通过从热变形菌(Thermoproteus uzoniensis)中克隆到一株4-α-糖基转移酶基因(TuαGT),通过大肠杆菌异源表达,酶学性质表征,确定其为4αGT,并且该酶具有较好的温度稳定性和底物耐受性,使其能够在高温下催化高浓度的淀粉改性,延长其支链淀粉的侧链。本发明的酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法,以淀粉为原料,添加适量的4-α-糖基转移酶,选择合适的添加量和作用时间,来制备高强度抗回生淀粉基凝胶。(The invention discloses a method for preparing thermoreversible starch-based gel with controllable gel strength by an enzyme method, belonging to the technical field of starch modification. The invention clones a 4-alpha-glycosyltransferase gene (Tu alpha GT) from thermomyces (Thermoproteus uzoniensis), and determines the gene to be 4 alpha GT by escherichia coli heterologous expression and enzymological property characterization, and the enzyme has better temperature stability and substrate tolerance, so that the enzyme can catalyze the modification of starch with high concentration at high temperature and prolong the side chain of amylopectin. The method for preparing the thermoreversible starch-based gel with controllable gel strength by the enzyme method takes starch as a raw material, adds a proper amount of 4-alpha-glycosyltransferase, and selects a proper addition amount and action time to prepare the high-strength retrogradation-resistant starch-based gel.)
技术领域
本发明涉及一种酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法，属于淀粉改性技术领域。
背景技术
淀粉是一种来源广泛、价格低廉的纯天然原料。利用淀粉为原料所生产的淀粉胶体广泛应用于食品、化工等多个行业中。淀粉凝胶是一种高分子化合物，是淀粉经过糊化后形成的具有一定弹性和硬度的透明或半透明的凝胶。在食品行业中，与其他食品胶体相比，淀粉胶体更易于被人体消化吸收，不易产生胀气、肾毒性等不良反应，并且可以添加在婴幼儿食品中，具有广泛的市场前景。在其他行业中，淀粉胶体具有重量轻、无腐蚀、不污染及成本低等优点。然而，由于原淀粉凝胶存在较多缺陷，其中淀粉凝胶强度过高且不可控，导致淀粉凝胶产品难以应用。因此，对于淀粉凝胶的改性具有非常重要的工业价值。
影响淀粉凝胶强度的因素很多，例如直链淀粉含量及大小、淀粉中多糖含量、脂质含量等。其中直链淀粉含量及大小一直是人们研究的热点。淀粉凝胶是淀粉经糊化后，直链淀粉释放，互相缠绕形成三维网络结构，在冷却过程中，直链淀粉与支链淀粉通过氢键相互作用形成的混合体系。当直链淀粉含量较少，或者因与脂质络合而影响直链淀粉的双螺旋结构，淀粉形成的凝胶强度会受到影响。因此淀粉凝胶的形成与淀粉中直链淀粉的含量有着密切的关系。各种不同来源的淀粉，其直链淀粉含量不同，分子量大小也有区别，因此在相同条件下，其凝胶强度也有很大差别。故可以通过控制直链淀粉含量，进而达到控制淀粉凝胶强度的功能。
因此如何对淀粉进行改性，改变淀粉中直链淀粉含量的同时保持淀粉整体结构并未被破坏，改善淀粉基凝胶的强度且制备后的淀粉凝胶特性良好是一个亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明提供一种改性淀粉从而实现淀粉基凝胶热可逆且凝胶强度可控的方法，该方法通过从热变形菌(Thermoproteus uzoniensis)中克隆到一株4-α-糖基转移酶基因(TuαGT)，通过大肠杆菌异源表达，酶学性质表征，确定其为4αGT，并且该酶具有较好的温度稳定性和底物耐受性，使其能够在高温下催化高浓度的淀粉改性，延长其支链淀粉的侧链。本发明主要采取了三个关键方面的控制来实现高强度抗回生淀粉基凝胶的制备：1)淀粉种类的筛选；2)优化4-α-糖基转移酶的添加量；3)优化4-α-糖基转移酶的作用时间。本发明的酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法，以淀粉为原料，添加适量的4-α-糖基转移酶，选择合适的添加量和作用时间，来制备高强度抗回生淀粉基凝胶。本发明制备过程简单、设备简易、产品效果好。
本发明的第一个目的是提供一种凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将淀粉溶于缓冲液中进行调浆，在70-120℃条件下完全糊化；
(2)将温度降至40-90℃，pH调至4.0-13.0，添加氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4-α-糖基转移酶，然后灭酶，干燥，研磨得到改性淀粉；
(3)对得到的改性淀粉进行溶解，并在70～90℃加热搅拌，凝固后即得改性淀粉凝胶。
在本发明一种实施方式中，酶解作用时间为1-12h。
在本发明一种实施方式中，步骤(1)中所述淀粉的质量浓度是5％～10％。
在本发明一种实施方式中，步骤(1)中所述淀粉主要包括马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、豌豆淀粉和大米淀粉。
在本发明一种实施方式中，优选地，所述淀粉为马铃薯淀粉。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)中所述4-α-糖基转移酶添加量为4-α-糖基转移酶/淀粉0.5～10U/g。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)中所述灭酶方法包括高温灭酶，酸碱灭酶，乙醇灭酶。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)中所述的干燥方法包括冷冻干燥、常压干燥、喷雾干燥、滚筒干燥、微波干燥。
在本发明一种实施方式中，所述凝胶强度可控是根据酶解作用时间计算凝胶强度，计算方法为：y＝-898.39x+6298.3，R2＝0.9343。其中，y为凝胶强度，x为改性时间；凝胶强度为3000-8000Pa。
本发明的第二个目的是提供一种应用上述方法制备得到的淀粉基凝胶。
本发明第三个目的是提供一种上述淀粉基凝胶在果冻，老酸奶，龟苓膏，奶酪，糖果，冰淇淋中的应用。
本发明的有益效果：
(1)4-α-糖基转移酶的来源为Thermoproteus uzoniensis。通过序列比对发现该酶序列与其他4-α-糖基转移酶序列最高相似度仅为70％；4-α-糖基转移酶的最适反应温度为50～80℃，最适反应pH为5.0～8.0；4-α-糖基转移酶的最小作用底物单元为麦芽糖，对葡萄糖等单糖并无活力。
(2)本发明的4-α-糖基转移酶，在65℃-80℃之间，该酶的相对酶活均保持在90％以上，具有较好的温度稳定性；可以在高温60-90℃下催化淀粉改性，淀粉转化率高达80％以上；可以催化10～30％(w/v)高浓度的淀粉改性，淀粉转化率高达90％以上。
(3)与现有技术相比，本发明可实现在较短时间的情况下，得到较高的凝胶强度。
(4)不同产品所需的凝胶强度不同，本发明通过调节酶解时间制备得到的凝胶的凝胶强度在2000～8000Pa的范围内，适用于制备果冻，老酸奶，龟苓膏，奶酪，糖果，冰淇淋，适用范围更广。
附图说明
图1：4-α-糖基转移酶镍柱纯化结果。
图2：酶的最适反应温度。
图3：酶的最适反应pH。
图4：4-α-糖基转移酶作用时间和凝胶强度关系曲线。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
(1)4αGTase酶活测定方法
取100μL适当稀释的酶液加入1％麦芽三糖(G3)溶液(50mM柠檬酸钠缓冲液配制，pH6.0)，75℃反应6h。沸水浴10min停止反应。采用葡萄糖氧化酶试剂盒法测定反应液中的葡萄糖含量。歧化活力定义为每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶的量。
酶活单位定义为：每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶的量。
(2)淀粉转化率的计算公式：
式中：X为淀粉转化率；c0为原淀粉中直链淀粉含量；c1为酶改性后淀粉中直链淀粉含量。
(3)凝胶强度的测定方法：
使用质构仪测定样品的凝胶强度。将凝胶样品切成直径25mm，高10mm的圆柱体。利用采用英国TA-XT plus型质构分析仪在25℃测定淀粉凝胶的质构特性。采用P36R探头，测定高度15mm,测前速度0.5mm/s，测试速度0.5mm/s，测后速度0.5mm/s，触发力5g。
(4)热可逆性能的测定方法：
使用旋转流变仪测定样品的热可逆性能。将凝胶样品均匀放置于流变仪测试平台。选用直径为40mm的不锈钢平板夹具，设置间距为1000μm，扫描应变值1％，振荡频率1Hz，以10℃/min的恒定速度由5℃升温至90℃，测定淀粉凝胶储能模量G’和损耗模量G”随温度升高的变化情况。
实施例1：酶的制备
人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的基因片段，选用pET-28a质粒构建重组质粒，利用BL21表达菌株表达，经摇瓶发酵，离心沉淀，超声破壁得到粗酶，经过镍柱纯化最终获得4αGTase纯酶(见图1)。
MLRGAGILLPLFSLPGPHGIGDMGPAAYRFVEFLRDAGQTYWQLLPLNPVLPEYDNSPYSSTSSFAGEPAYISLELLAEQGVLRRSASAEFGAGRADYEAARAYKVKIIAEAERPKDLDEFVGRNEWLEDYALYSALREYFGRPWVEWPRELRDRDPAALRQWREKLRRRIELEYLLQYFFWTQWRELKRHANSLGIFLIGDLPIYLSLDSADVWAHRELFKLDAEGRPLYVAGVPPDYFSPTGQLWGNPVYDWDAMRKEGFRWWLDRLRYTLSVFDYVRLDHFRGYAAYWEVPAGEKTAVNGRWVPAPGGELLERARDELGGLKIIAEDLGYITPDVVELRDRFGLPGMRVLQFAWDGNPANEHKPHNHVKNSVVYTGTHDNNTIVGWFFREASPKARREALEYMGRRSAKDIHWAFIRLAYFSVADVAVVPMQDFMGLGPEARINRPGTRGGNWVWRMTELPGRALARRIRRLARLYGR
实施例2：酶的性质
(1)酶的最适反应温度
在不同温度下(50℃-90℃)测定4αGTase歧化活力以确定最适温度。4-α-糖基转移酶的最适反应温度为50～80℃。
表1 4αGTase最适反应温度
(2)酶的最适反应pH
用不同pH值(3.0-10.0)的缓冲液代替4αGTase歧化测定方法中的缓冲液，在75℃下测定4αGTase活力，考察酶的最适pH。最适反应pH为5.0～8.0。
表2 4αGTase最适pH的测定
(3)酶的温度稳定性
在不同温度(50℃-90℃)保温，每1h将部分酶液取出，迅速冷却，测定残留总酶活。结果表明：温度在65℃-80℃之间，该酶的相对酶活均保持在90％以上。
表3温度稳定性测定
实施例3：淀粉种类对淀粉基凝胶性能的影响
(1)将质量浓度6％的淀粉溶于缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。
(2)将温度降至70℃，pH调至6.0，添加4-α-糖基转移酶，反应1-12h，然后灭酶，干燥，研磨得到改性淀粉；
(3)对得到的改性淀粉进行溶解，并在70～90℃加热搅拌，凝固后即得改性淀粉凝胶。所述淀粉主要包括马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、豌豆淀粉和大米淀粉，结果见表4。
表4淀粉种类对改性淀粉性能的影响
淀粉种类
马铃薯淀粉
玉米淀粉
木薯淀粉
小麦淀粉
豌豆淀粉
大米淀粉
转化率(％)
92.61
32.56
88.79
21.08
54.24
58.13
热可逆性能
有
无
无
无
无
无
实施例4：4-α-糖基转移酶的添加量对淀粉基凝胶性能的影响
(1)分别将质量浓度6％的木薯淀粉溶于pH7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。
(2)将温度分别降至70℃，pH调至6.0，添加4-α-糖基转移酶，反应8h，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉；
(3)对得到的改性淀粉进行溶解，并在70～90℃加热搅拌，凝固后即得改性淀粉凝胶。4-α-糖基转移酶添加量分别为4-α-糖基转移酶/淀粉0.5～10U/g，结果见表5。
表5 4-α-糖基转移酶添加量对改性淀粉性能的影响
4-α-糖基转移酶添加量(U/g)
0.5
1
2
4
6
8
10
转化率(％)
40.68
60.81
84.36
92.61
92.79
92.98
93.15
凝胶强度(Pa)
6457.7
5483.9
4089.1
2933.5
2819.3
2762.2
2670.8
热可逆性能
无
无
无
有
有
有
有
实施例5：4-α-糖基转移酶的作用时间对淀粉基凝胶性能的影响
(1)分别将质量浓度6％的木薯淀粉溶于pH7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。
(2)将温度分别降至70℃，pH调至6.0，添加4-α-糖基转移酶，反应8h，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉；
(3)对得到的改性淀粉进行溶解，并在70～90℃加热搅拌，凝固后即得改性淀粉凝胶。4-α-糖基转移酶作用时间分别为0.5-12h，结果见表6。
表6 4-α-糖基转移酶作用时间对改性淀粉性能的影响
4-α-糖基转移酶作用时间(h)
0.5
1
2
4
6
8
12
转化率(％)
54.48
63.12
74.54
92.21
93.51
93.62
93.88
凝胶强度(Pa)
6155.6
5384.8
3987.3
2927.1
2812.6
2818.2
2790
热可逆性能
有
有
有
有
有
有
有
另外，通过拟合4-α-糖基转移酶作用时间和凝胶强度得到4-α-糖基转移酶作用时间-凝胶强度关系曲线，为y＝-898.39x+6298.3，R2＝0.9343。其中，y为凝胶强度，x为改性时间；凝胶强度为3000-8000Pa。根据调整4-α-糖基转移酶作用时间可得到不同凝胶强度的淀粉基凝胶，适用范围更广。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种酶法制备凝胶强度可控的热可逆淀粉基凝胶的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Met Leu Arg Gly Ala Gly Ile Leu Leu Pro Leu Phe Ser Leu Pro Gly
1 5 10 15
Pro His Gly Ile Gly Asp Met Gly Pro Ala Ala Tyr Arg Phe Val Glu
20 25 30
Phe Leu Arg Asp Ala Gly Gln Thr Tyr Trp Gln Leu Leu Pro Leu Asn
35 40 45
Pro Val Leu Pro Glu Tyr Asp Asn Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Ser Ser
50 55 60
Phe Ala Gly Glu Pro Ala Tyr Ile Ser Leu Glu Leu Leu Ala Glu Gln
65 70 75 80
Gly Val Leu Arg Arg Ser Ala Ser Ala Glu Phe Gly Ala Gly Arg Ala
85 90 95
Asp Tyr Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Lys Val Lys Ile Ile Ala Glu Ala
100 105 110
Glu Arg Pro Lys Asp Leu Asp Glu Phe Val Gly Arg Asn Glu Trp Leu
115 120 125
Glu Asp Tyr Ala Leu Tyr Ser Ala Leu Arg Glu Tyr Phe Gly Arg Pro
130 135 140
Trp Val Glu Trp Pro Arg Glu Leu Arg Asp Arg Asp Pro Ala Ala Leu
145 150 155 160
Arg Gln Trp Arg Glu Lys Leu Arg Arg Arg Ile Glu Leu Glu Tyr Leu
165 170 175
Leu Gln Tyr Phe Phe Trp Thr Gln Trp Arg Glu Leu Lys Arg His Ala
180 185 190
Asn Ser Leu Gly Ile Phe Leu Ile Gly Asp Leu Pro Ile Tyr Leu Ser
195 200 205
Leu Asp Ser Ala Asp Val Trp Ala His Arg Glu Leu Phe Lys Leu Asp
210 215 220
Ala Glu Gly Arg Pro Leu Tyr Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe
225 230 235 240
Ser Pro Thr Gly Gln Leu Trp Gly Asn Pro Val Tyr Asp Trp Asp Ala
245 250 255
Met Arg Lys Glu Gly Phe Arg Trp Trp Leu Asp Arg Leu Arg Tyr Thr
260 265 270
Leu Ser Val Phe Asp Tyr Val Arg Leu Asp His Phe Arg Gly Tyr Ala
275 280 285
Ala Tyr Trp Glu Val Pro Ala Gly Glu Lys Thr Ala Val Asn Gly Arg
290 295 300
Trp Val Pro Ala Pro Gly Gly Glu Leu Leu Glu Arg Ala Arg Asp Glu
305 310 315 320
Leu Gly Gly Leu Lys Ile Ile Ala Glu Asp Leu Gly Tyr Ile Thr Pro
325 330 335
Asp Val Val Glu Leu Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Arg Val
340 345 350
Leu Gln Phe Ala Trp Asp Gly Asn Pro Ala Asn Glu His Lys Pro His
355 360 365
Asn His Val Lys Asn Ser Val Val Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asn
370 375 380
Thr Ile Val Gly Trp Phe Phe Arg Glu Ala Ser Pro Lys Ala Arg Arg
385 390 395 400
Glu Ala Leu Glu Tyr Met Gly Arg Arg Ser Ala Lys Asp Ile His Trp
405 410 415
Ala Phe Ile Arg Leu Ala Tyr Phe Ser Val Ala Asp Val Ala Val Val
420 425 430
Pro Met Gln Asp Phe Met Gly Leu Gly Pro Glu Ala Arg Ile Asn Arg
435 440 445
Pro Gly Thr Arg Gly Gly Asn Trp Val Trp Arg Met Thr Glu Leu Pro
450 455 460
Gly Arg Ala Leu Ala Arg Arg Ile Arg Arg Leu Ala Arg Leu Tyr Gly
465 470 475 480
Arg
<210> 2
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgctgaggg gggcggggat ccttctgcct ctgttctccc tcccgggccc ccacgggatc 60
ggcgacatgg ggcccgccgc gtaccgattc gtggagttct tgagggatgc cggccagacg 120
tattggcagc tgttgcccct aaaccccgtg ttgccggagt acgacaactc gccctacagc 180
tccacctcgt ccttcgccgg ggagccggcg tacataagcc tggagctcct ggcggagcaa 240
ggcgtgttga ggagatccgc ctcggcggaa ttcggggcgg gccgcgccga ttacgaagcc 300
gcgcgggcct acaaggtcaa gataatcgcc gaggcggaga ggccgaagga cctcgacgag 360
ttcgtgggga ggaacgagtg gcttgaggac tacgccctct actcggcgtt gagggagtac 420
ttcggacggc cttgggtgga gtggccgagg gagctgaggg atagagatcc ggcggccttg 480
aggcagtggc gcgagaagtt gcggaggagg atagagcttg agtacctcct ccagtacttc 540
ttctggacgc agtggcgcga gctgaagcgg cacgccaact cgctgggcat cttcctcata 600
ggcgacctcc cgatatacct gagcctcgac agcgccgacg tgtgggccca cagagagctg 660
ttcaagctcg acgcggaggg ccggccccta tacgtggcgg gggtgccgcc cgactacttc 720
tcgcccaccg gccagctgtg gggcaacccc gtctacgatt gggacgccat gaggaaggag 780
gggtttaggt ggtggctcga cagactgagg tacacgctct cggtcttcga ctacgtcagg 840
ctcgaccact tccgcggcta tgccgcctac tgggaggtgc cggccggcga gaagactgct 900
gtgaacggcc gctgggtccc cgctccgggc ggggagctcc tggaaagggc gagggatgag 960
ctgggcgggc tcaagataat cgcggaggat ctcggctaca taacgcccga cgtggtggag 1020
ctgagagacc gcttcgggtt gccgggcatg agggtgctgc agttcgcctg ggatggcaac 1080
ccggcgaacg agcacaagcc ccataaccac gtcaagaact cggtcgtcta cacgggcacc 1140
cacgacaaca acacgatagt gggctggttc ttccgcgagg cgtcccccaa ggcgaggagg 1200
gaggcgttgg agtacatggg cagacgctcc gccaaggata tacactgggc cttcataagg 1260
ctggcgtact tctcggtggc cgacgtggcc gtcgtgccta tgcaggactt catggggctt 1320
gggccagaag cgcgtataaa taggccggga actagaggcg gaaactgggt ctggaggatg 1380
acagagctcc ccgggcgggc gttggccagg cggataaggc ggctggcccg gctctacggc 1440
cgttga 1446