具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的适用于盐碱土壤的微生物肥料按照质量份数计，由贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，以及七水硫酸亚铁10份组成。

如图1所示，本发明实施例提供的适用于盐碱土壤的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：

S101，贝莱斯芽孢杆菌菌种活化；

S102，贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备；

S103，贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备；

S104，贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养；

S105，巨大芽孢杆菌菌粉的制备；

S106，微生物肥料的配制。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1

本发明公开了一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法。所述盐碱土壤适用微生物肥料是采用一株耐盐碱抗病促生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2和一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314及矿源腐植酸等原料制备而成的。所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22606，该菌株具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗作物病原菌等优良特性或有益作用，可用于生产微生物肥料，特别是适用于盐碱土壤的微生物肥料。所述的巨大芽孢杆菌ACCC04314，其原种购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为ACCC04314。

所述微生物肥料中包含2种菌株：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2菌株和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ACCC04314。

所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.22606；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年5月25日；参据的生物材料：BOB-2；建议的分类命名：贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis；本保藏中心于2021年5月25日收到，并登记入册，经检测为存活；根据请求，由2021年5月25日起保存三十年，在期满前收到提供生物材料样品的请求后再延续保存五年。所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2具有耐盐碱、促进作物生长、提高土壤酶活、拮抗病原菌、防治水稻纹枯病等优良特性或有益作用。

所述巨大芽孢杆菌ACCC04314，其原种购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为ACCC04314。

所述微生物肥料中还包括腐植酸和微量元素。所述微生物肥料中各组分的含量为：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，七水硫酸亚铁10份。

所述贝莱斯芽孢杆菌BOB-2经扩大培养后，接种于固体发酵培养基，于33-40℃培养36-48h，然后烘干、粉碎、与巨大芽孢杆菌菌粉、腐植酸等原料混合均匀，即为所述微生物肥料；所用固体发酵培养基的配方为：麸皮80％，水稻秸秆粉19％，Ca(OH)₂ 1％，MnSO₄0.1％，初始含水量50-60％。

所述微生物肥料的活菌含量优选为：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2(0.5～1.0)×10¹⁰cfu/g，巨大芽孢杆菌(1.0～2.0)×10⁹cfu/g。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的筛选

(1)耐盐碱菌株的分离

采集盐碱地土壤，称取10g土壤样品，置于经灭菌处理的装有90mL去离子水和10-20粒玻璃珠的250mL锥形瓶中，放置在摇床180r/min震荡30min。通过梯度稀释法，将土壤悬浊液稀释至10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7。用移液枪吸取不同稀释度的土壤悬浊液各0.1mL于LB培养基平板中，涂布均匀。放入37℃培养箱中，培养48-72h。挑取菌落形态特征存在差异的菌株划线培养于分离平板，通过反复划线分离纯化直至获得单菌落。所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠(NaCl)10g/L；琼脂20g/L，pH 7.5。

将所分离的菌株接种于LB盐碱培养基中，37℃恒温培养48-72h，观察并记录菌株的生长状况，选取生长状况相对较好的菌株进行后续试验。所述LB盐碱培养基配方为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠(NaCl)50g/L；琼脂20g/L，pH 9.0。

(2)耐盐碱促生菌株的筛选

对筛得的耐盐碱菌株在盐碱胁迫条件下进行发芽试验，进一步筛选促生效果较好的菌株。试验于铺有滤纸的培养皿中进行，以奶油小白菜种子为供试材料。试验采用的盐碱培养液的组成为：NaCl 25mmol/L，Na₂SO₄ 50mmol/L，NaHCO₃ 25mmol/L，pH 8.0。空白对照组添加7mL盐碱培养液，试验组分别添加7mL含有不同待筛菌的盐碱培养液(菌悬液，含菌量1×10⁷cfu/mL)。每一处理设置3个平行，每一平行放30粒种子，28℃光照培养箱培养3-7天。根据小白菜幼苗的生长状况筛选出促生效果相对较好的菌株。

(3)拮抗菌株的筛选

以水稻纹枯病致病菌立枯丝核菌为受试病原菌筛选拮抗菌株。在PDA培养基平板上培养立枯丝核菌，获得菌落。用打孔器取直径5mm的菌块，接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心2.0cm处等距离接种待筛菌株，以不接种待筛菌株的平板为对照，28℃培养10d，选取抑菌圈直径较大的菌株，保存备用。每个处理3次重复。所述PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。

通过上述多重筛选，综合考虑各菌株耐盐碱能力、促生长能力、病原菌拮抗能力，筛选出一株相对较好的菌株，编号为BOB-2。

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株的鉴定

(1)形态与生理生化鉴定

通过观察与镜检，所述BOB-2菌株的形态特征为：在LB培养基上于37℃培养48h，菌落直径约0.5-0.8mm，白色半透明，圆形，表面光滑，隆起，湿润，粘稠，有光泽，质地均匀，边缘整齐(见图2)；菌体呈短杆状(见图3)。

参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)测定BOB-2菌株生理生化特征。所述BOB-2菌株的生理生化特征为：有芽孢、革兰氏染色呈阳性、接触酶试验阳性、甲基红反应阴性、V-P试验阴性、丙二酸盐利用试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、淀粉水解试验阳性、运动性阴性、麦芽糖利用试验阳性、甘露醇利用试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、乳糖利用试验阳性。

(2)16S rDNA序列分析

将BOB-2菌株接种到LB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27：5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′和F27：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由青岛睿博兴科有限公司测序，所得序列如序列表SEQ No.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，用MEGA5.5软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图4所示。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BOB-2。

实施例4：微生物肥料的制备

(1)贝莱斯芽孢杆菌菌种活化

将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株转接入LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。

(2)贝莱斯芽孢杆菌三角瓶种子液制备

用接种环刮取活化后的贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌苔，接种于所述LB液体培养基中，于180r/min、37℃震荡培养24h。所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000mL，pH 7.5。

(3)贝莱斯芽孢杆菌液体发酵罐种子制备

将三角瓶种子以2％-5％的接种量转接入含LB液体培养基的液体发酵罐中，37℃培养24h。种子罐体积为10L，装液量为7L搅拌转速200r/min，通风量为7L/min。

(4)贝莱斯芽孢杆菌固态发酵培养

采用60cm×120cm的不锈钢浅盘进行培养。麸皮培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4-7cm。将贝莱斯芽孢杆菌BOB-2的种子液以2-5％的接种量转接入培养基，发酵培养36-48h。发酵过程中控制品温33-40℃，含水量45-60％，每2-5h翻动一次，以调节温度与供氧。所述麸皮培养基的配方为：麸皮80％，水稻秸秆粉19％，Ca(OH)₂ 1％，MnSO₄ 0.1％，初始含水量50-60％。发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g，用于微生物肥料的配制。

(5)巨大芽孢杆菌菌粉的制备

巨大芽孢杆菌的菌种活化、三角瓶种子液制备、液体发酵罐种子制备方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株。巨大芽孢杆菌的固态发酵培养方法同贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株，但发酵培养基的配方为：麸皮99％，Ca(OH)₂ 1％，MnSO₄0.1％，初始含水量50-60％。发酵结束后，培养物于40-45℃低温烘干，粉碎至80-100目，即为巨大芽孢杆菌菌粉，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g，用于微生物肥料的配制。

(6)微生物肥料的配制

所述微生物肥料的配方为：贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌粉100份，巨大芽孢杆菌菌粉20份，矿源腐植酸粉50份，七水硫酸锌10份，七水硫酸镁10份，七水硫酸亚铁10份。所述微生物肥料的配制方法：取组方量的上述各种原料，混合均匀，即为微生物肥料产品，其活菌含量优选为贝莱斯芽孢杆菌BOB-2菌株(0.5～1.0)×10¹⁰cfu/g，巨大芽孢杆菌(1.0～2.0)×10⁹cfu/g。所述矿源腐植酸粉购自山东创新腐植酸科技股份有限公司，总腐植酸含量≥50％(w/w)。

下面结合应用例对本发明的技术方案作进一步描述。

应用例1：微生物肥料对番茄的促生长作用

盆栽试验共设1个处理组(T)和1个对照组(CK)，每个处理25盆。处理组T每盆施用本发明所述微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)，对照组CK每盆施用预灭菌的微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)。试验用土取自东营市垦利区，为轻度盐碱土壤。微生物肥料作为底肥施用，即装盆时将微生物肥料与土壤混合均匀。取长势基本一致，生长状况良好的番茄幼苗移栽到盆中(花盆规格：上内径20cm、下内径14cm、高16cm，每盆装土3kg)，且仅定植1株。在盆栽试验第60天时，进行相关指标测定。株高和茎粗分别采取卷尺和游标卡尺测量；鲜重和干重均采用称重法测定。根际土壤酶活性的测定：脲酶测定采用苯酚钠比色法，过氧化氢酶测定采用高锰酸钾滴定法，磷酸酶测定采用磷酸苯二钠比色法，蔗糖酶测定采用DNS比色法。

试验结果如表1与表2所示。与对照组CK相比，处理组T的株高、茎粗、鲜重和干重均有不同程度的提高，分别提高了35.41％、26.70％、33.73％和30.18％。这说明，施加本发明所述的微生物肥料对番茄的生长具有显著的促进作用。与对照组CK相比，处理组T中的脲酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性分别提高了36.14％、25.00％和19.76％，这说明本发明所述微生物肥料可以提高番茄根际土壤酶活。

表1微生物肥料对番茄生长的影响

表2微生物肥料对番茄根际土壤酶活的影响

应用例2：微生物肥料对水稻纹枯病的防治作用

盆栽试验共设1个处理组(T)和1个对照组(CK)，每个处理25盆。处理组T每盆施用本发明所述微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)，对照组CK每盆施用预灭菌的微生物肥料0.1％(肥料干重/土壤干重)。试验用土取自东营市垦利区，为轻度盐碱土壤。微生物肥料作为底肥施用，即装盆时将微生物肥料与土壤混合均匀。每盆种植两株水稻，缓苗5日后，每盆灌根30mL立枯丝核菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)。病原菌灌根10天、20天、30天后，观察症状并统计病害严重度和防效。

纹枯病分级标准：0级：全株无病；1级：第4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第1片叶)；3级：第3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死。病情指数＝∑[(各级病叶数×各级代表值)/(9×总株数)]×100。防效＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100％。

盆栽试验结果如表3所示，接种病原菌10天后，处理组T的防效为83.33％；20天后，防效为59.78％；30天后，防效为44.78％。这说明本发明所述微生物肥料对水稻纹枯病具有较好的防治作用。

表3微生物肥料对水稻纹枯病的防治作用

应用例3：对大田水稻的促生作用

大田示范应用区位于山东省东营市垦利开发区，示范面积60亩，为轻度盐碱地。实验设两个处理，每个处理30亩。对照处理CK：习惯施肥，亩施尿素30kg、氯化钾15kg、钙镁磷肥30kg。实验处理T：亩施用本发明生物肥料40kg、配施尿素27kg、氯化钾13.5kg、钙镁磷肥27kg。钙镁磷肥一次性作基肥施用，生物肥料60％作基肥施用，40％作为分蘖肥施用，尿素和氯化钾40％作基肥施用，60％作分蘖肥施用。试验期间病虫防治和水分管理按常规方法进行。试验品种为水稻盐丰47，2020年5月25日统一播种，11月5日收割测产。实验结果：对照处理CK平均亩产820Kg，实验处理T平均亩产918Kg，增产11.95％；对照处理CK土壤有机质含量1.52g/g土壤(干基)，实验处理T土壤有机质含量1.68g/g土壤(干基)，提升10.53％。这说明施用本发明生物肥产品具有改良土壤和增加水稻产量的作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 东营市垦利区万隆农林经贸有限公司

<120> 一种适用于盐碱土壤的微生物肥料及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggatgcgg cgtgctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120

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