一种硫化氢供体、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种硫化氢供体、制备方法及其应用 (Hydrogen sulfide donor, preparation method and application thereof ) 是由 张健健 赵鑫悦 宁璐璐 杨小峰 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种硫化氢供体、制备方法及其应用,属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种硫化氢供体,该硫化氢供体具有如下通式(Ι)所述的结构,其中,R为-NCS、-OOCCH＝CH-2、中的一种。本发明提供的硫化氢供体,不仅具有单一释放路径、释放效率高等优点,还可通过近红外荧光响应实现对硫化氢释放的可视化。(The invention relates to a hydrogen sulfide donor, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of molecular biology. The invention provides a hydrogen sulfide donor, which has a structure shown in the following general formula (I), wherein R is-NCS, -OOCCH ═ CH 2 、 One kind of (1). The hydrogen sulfide donor provided by the invention has the advantages of single release path, high release efficiency and the like, and can realize the visualization of hydrogen sulfide release through near-infrared fluorescence response.)
技术领域
本发明涉及分子生物学
技术领域
，更具体的涉及一种硫化氢供体、制备方法及其应用。背景技术
硫化氢(H2S)供体是一种重要的内源性信号分子，具有抗炎、抗凋亡活性等细胞保护作用，在生命活动中扮演着重要的角色。例如，诱导血管扩张、抑制细胞凋亡、调节线粒体呼吸、激活抗氧化剂和抑制炎症。H2S供体作为硫化氢的外来性来源，能够调节细胞内H2S水平，对由炎症引起的疾病的治疗有巨大的影响，开发和研究小分子H2S供体对于理解炎症的潜在机制和优化治疗干预至关重要。因此，构建可靠的H2S供体对研究其在生物体系中的功能具有重要的意义。
H2S供体虽然在开发和研究方面取得了重大进展，但是现有但现有的硫化氢供体存在释放效率低、副产物种类多等缺陷。另外，现有的检测方法，如亚甲基蓝比色法(MB)已被普遍用于测定H2S水平，但强酸条件可能会触发酸不稳定的H2S供体释放H2S。此外，MB的方法对生物样品具有破坏性，不适合对体内H2S的可视化。基于单溴二胺(monobromobimane,MBB)的方法可以在生理pH值下进行，但是这种方法需要使用反相色谱与荧光检测器来定量测定硫化物，这对生物样品也具有破坏性。同样，H2S选择性电极法只适用于均相溶液，不适用于非均相生物样品。现有方法的灵敏度不足和不方便难以实现对生物系统中释放的H2S的可视化和精确检验。因此，本发明提供一种硫化氢供体，不仅具有单一释放路径、释放效率高等优点，还可通过近红外荧光响应实现对硫化氢释放的可视化。
发明内容
荧光法因其优异的灵敏度、高的时间和空间分辨率、非侵入性和实时成像而受到特别关注。其中，近红外荧光探针有助于实现原位、实时、动态可视化示踪，达到准确定量及时空分布检测。因此，设计一种可通过伴随近红外荧光变化来观察H2S释放的可靠的激活型H2S供体是非常必要的，且具有巨大的应用潜力。理想的H2S供体需要在释放H2S的同时伴随着近红外荧光变化，用普通的荧光成像技术就可在生物体系中观察H2S的产生，以实现对生物体系中H2S释放的可视化。
本发明提供一种硫化氢供体，所述硫化氢供体的化学结构式如通式(Ι)所示：
其中，R为-NCS、-OOCCH＝CH2，中的一种。
本发明还提供了一种硫化氢供体的制备方法，包括以下步骤：
S1，式(Ⅱ)所示化合物和式(Ⅲ)所示化合物为原料，将式(Ⅱ)所示化合物溶于无水二氯甲烷中，滴加式(Ⅲ)所示化合物到式(Ⅱ)所示化合物中，在氮气保护下室温反应得到中间产物式(Ⅳ)所示化合物；
以式(Ⅴ)所示化合物和式(Ⅲ)所示化合物为原料，将式(Ⅴ)所示化合物溶于无水四氢呋喃中，向式(Ⅴ)所示化合物中加入氢氧化钾水溶液中，充分搅拌后，再滴加式(Ⅲ)所示化合物到式(Ⅴ)所示化合物中，在氮气保护下室温反应得到中间产物式(Ⅵ)所示化合物；
S2，将中间产物式(Ⅳ)所示化合物和中间产物式(Ⅵ)所述化合物添加到无水二氯甲烷中，搅拌溶解后，加入4-二甲氨基吡啶，充分反应得到硫化氢供体；其中R为-NCS；
所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)的结构式如下所示：
优选的，S1中，式(Ⅱ)和式(Ⅲ)的添加摩尔比为1:2，式(Ⅴ)和式(Ⅲ)的添加摩尔比为1:8；S2中，式(Ⅳ)、式(Ⅵ)和4-二甲氨基吡啶的添加摩尔比为1:1:2。
本发明还提供了另一种硫化氢供体的制备方法，包括以下步骤：
S1，将对羟基苯甲醇式(A)溶于丙酮中，加碳酸钾水溶液充分搅拌，滴加丙烯酰氯式(B)到反应液中，在室温下反应得到中间产物式(C)所示化合物；
以式(Ⅴ)所示化合物和式(Ⅲ)所示化合物为原料，将式(Ⅴ)所示化合物溶于无水四氢呋喃中，向式(Ⅴ)所示化合物中加入氢氧化钾水溶液中，充分搅拌后，再滴加式(Ⅲ)所示化合物到式(Ⅴ)所示化合物中，在氮气保护下室温反应得到中间产物式(Ⅵ)所示化合物；
S2，将中间产物式(C)所示化合物和中间产物式(Ⅵ)所述化合物添加到无水二氯甲烷中，搅拌溶解后，加入4-二甲氨基吡啶，充分反应得到硫化氢供体；其中R为-OOCCH＝CH2；
所述式(A)、式(B)、式(C)的结构式如下所示：
优选的，S1中，式(A)和式(B)的添加摩尔比为1:1，式(Ⅴ)和式(Ⅲ)的添加摩尔比为1:8；S2中，式(C)、式(Ⅵ)和4-二甲氨基吡啶的添加摩尔比为1:1:2。
本发明还提供了另一种硫化氢供体的制备方法，包括以下步骤：
S1，将式(Ⅴ)所示化合物溶于无水四氢呋喃中，加入氢氧化钾水溶液搅拌后，滴加式(Ⅲ)所示化合物，室温搅拌，进行点板监测，反应完成后，去除溶剂和剩余式(Ⅲ)所示化合物，经过柱层析纯化得到中间产物式(Ⅵ)所示化合物；
S2，在氮气保护下以4-二甲氨基吡啶为催化剂，将式(D)所示化合物和中间产物式(Ⅵ)所示化合物添加到无水二氯甲烷中，得到硫化氢供体；其中R为
所述式(D)的结构式如下所示：
优选的，S1中，式(Ⅴ)和式(Ⅲ)的添加摩尔比为1:8；S2中，式(Ⅵ)和4-二甲氨基吡啶的的添加摩尔比为1:1:2。
本发明还提供了硫化氢供体在抗炎及硫化氢释放的可视化的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明合成的硫化氢供体具有单一释放路径、释放效率高等优点，且可通过近红外荧光响应实现对硫化氢释放的可视化。其中的R基团可被替换成不同的识别基团，可被不同的生物小分子激活从而释放硫化氢并伴随荧光响应。该结构将荧光小分子与硫化氢供体的结合，通过近红外荧光响应实现对硫化氢释放的可视化，细胞成像实验进一步证明硫化氢供体在生物应用上的适用性。
附图说明
图1为硫化氢供体Pro-S2的制备工艺流程图；
图2为实施例1中生物硫醇激活Pro-S2释放H2S伴随荧光响应的反应机理图；
图3为实施例1中Pro-S2的1H-NMR谱图；
图4为实施例1中亚甲蓝(MB)与不同浓度的硫化氢的(a)反应吸收光谱图和(b)反应吸光度；
图5为实施例1中Pro-S2与不同浓度的GSH反应的(a)荧光光谱图与(b)666nm处荧光强度随GSH浓度变化；
图6为实施例1中亚甲基蓝与Pro-S2(25μM)、GSH(250μM)反应体系的吸收光谱；(b)亚甲基蓝与Pro-S2(25μM)、GSH(250μM)、CA(25μg/mL)反应体系的吸收光谱；(c)亚甲基蓝与Pro-S2、GSH、CA反应体系的吸光度随时间变化；λabs＝667nm；
图7为Pro-S2的细胞成像研究；
图8为荧光探针C-7AZ对H2S的响应机理；
图9为硫化氢供体Pro-S3的制备工艺流程图；
图10为实施例2中Pro-S3与半胱氨酸的反应机理图
图11为实施例2中Pro-S3的1H-NMR谱图；
图12为实施例3中Pro-S4的制备工艺流程图；
图13为实施例3中Pro-S4与过氧化氢的反应机理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所涉及试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买到。
实施例1
本实施例为本发明所述的硫化氢供体，该硫化物供体编号为Pro-S2，其结构式如式(Ι)所示：
具体制备工艺流程如图1所示，具体制备过程为：称取123mg(即1mmol)对氨基苯甲醇(即化合物式(Ⅱ))，溶于无水二氯甲烷中，缓慢滴加150μL(即2mmol)硫光气，氮气保护下室温搅拌0.5h。氮气吹干溶剂及剩余硫光气，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为Petroleum ether/EtOAc＝5/1，得到白色固体式(Ⅳ)。
称取290mg(1mmol)化合物式(Ⅴ)溶于5mL无水四氢呋喃中，加入0.5mL氢氧化钾水溶液，即称取56mg(即1mmol)氢氧化钾得到氢氧化钾水溶液，充分搅拌后，逐滴滴加760μL(即8mmol)硫光气至体系中，室温下搅拌1h。点板监测反应完成后。氮气吹干溶剂及剩余硫光气，经柱层析纯化得到黄色固体化合物式(Ⅵ)。
称取36mg(即0.22mmol)化合物式(Ⅳ)和80mg(即0.22mmol)化合物式(Ⅵ)溶于5mL无水二氯甲烷中，搅拌溶解，加53mg(即0.44mmol)4-二甲氨基吡啶(即DMAP),室温条件下反应10min，直接经硅胶柱层析纯化，得到橙黄色固体，即硫化氢供体，记为Pro-S2。
所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)的结构式如下所示：
实施例1中基于COS供体构建了一种生物硫醇(Cys/Hcy/GSH)激活型近红外荧光H2S供体，该供体以二氰基异氟尔酮近红外荧光染料，即化合物式(Ⅴ)为荧光母体，通过硫光气连接化合物式(Ⅴ)和4-异硫氰酸酯基苯甲醇，使得化合物式(Ⅴ)中的羟基被保护，推拉电子体系减弱，荧光淬灭。在生物硫醇的激活下，巯基(-SH)进攻异硫氰酸酯后发生分子内的1，6-消除，产生COS，并被生物体内广泛存在的碳酸酐酶催化水解，释放H2S，生物硫醇激活硫化氢供体释放H2S伴随荧光响应的反应机理如图2所示，
采用核磁共振光谱对实施例1的硫化氢供体进行表征，如图3所示，结果如下：1HNMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.55(d，J＝8.8Hz,2H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H)，7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，7.16(d，J＝8.8Hz，2H)，7.02(q,J＝16.0Hz,2H),6.85(s,1H)，5.54(s,2H)，2.61(s,2H),2.46(s,2H),1.08(s,6H)；HRMS(ESI):calcd for C28H23N3O2S2[M-H]– m/z 496.1148,found 496.1425。
下面以本发明实施例1提供的Pro-S2为例，对其性能进行具体验证。
采用亚甲蓝法(Methylene Blue Assay,MB Assay)来检测硫化氢的生成的标准曲线，如图4所示。MB溶液由10μL(即20mM)醋酸锌、15μL(即30mM)三氯化铁、15μL(即20mM)N,N-二甲基对苯二胺组成，其中，醋酸锌溶于水中，三氯化铁溶解于1.2M HCl中，N,N-二甲基对苯二胺溶于7.2MHCl。将不同浓度的H2S分别加入MB溶液中，从图4可以看出，随着H2S的浓度增加，667nm处吸收强度逐渐升高，体系吸收强度与H2S浓度在0-25μM范围内成呈线性相关，且满足y＝0.01703+0.00635×[H2S]。
在测试条件下Pro-S2的水溶液几乎无荧光，当向其中分别加入0-250μM的GSH后，在530nm激发下，666nm处的荧光均显著增强，Stokes位移为140nm。供体Pro-S2对GSH的荧光响应情况如图5所示，在体系中加入不同浓度的GSH后，随着GSH浓度的增加，在666nm处的荧光强度逐渐增强(图5a)，荧光强度升高出约45倍，溶液荧光强度与GSH浓度在0到50μM范围内成线性相关(图5b)，检出限为28nM(DL＝3σ/k,S/N＝3)；上述实验表明，GSH能激活Pro-S2释放硫化氢同时伴随着荧光响应，以实现对硫化氢释放的可视化。
为了进一步计算生物硫醇激活Pro-S2生成的H2S的释放率，将GSH分别加到含有碳酸酐酶(即CA酶)的Pro-S2溶液中，在37℃下水浴，用亚甲蓝法(即MB assay)测水浴不同时间后体系产生的H2S含量，如图6所示，图6a为亚甲基蓝与所与25μM的Pro-S2、250μM的GSH反应体系的吸收光谱；图6b为亚甲基蓝与25μM的Pro-S2、250μM的GSH、25μg/mL的CA反应体系的吸收光谱；图6c为亚甲基蓝与Pro-S2、GSH、CA反应体系的吸光度随时间变化，其中λabs＝667nm；加入CA酶后生成H2S的含量随水浴时间的增加而增多，水浴两小时后逐渐趋于平缓(图6b)，而不加CA酶的体系中，667nm处吸收强度几乎没有增加(图6a)，说明GSH的确能激活Pro-S2产生氧硫化碳(即COS)。根据图6中的MB与H2S含量满足的线性方程计算可得，25μM的Pro-S2在GSH的激活下能产生18.22μM的H2S，释放率72.9％；
选用H2S探针C-7AZ来验证细胞中H2S的释放(反应机理见图8)。C-7AZ和Pro-S2所对应激发波长分别为405nm和514nm，如图7所示，图7中第一列代表细胞与10μM的Pro-S2孵育30min；第二列代表细胞与3μM的C-7AZ孵育30min；第三列代表细胞与10μM的Pro-S2及3μM的C-7AZ共同孵育30min；第四列代表1mM的NEM预处理过的细胞与10μM的Pro-S2及3μM的C-7AZ孵育30分钟；第五列代表1mM的NEM预处理过的细胞与100μM的GSH及10μM的Pro-S2及3μM的C-7AZ孵育30min。仅用C-7AZ处理的HeLa细胞产生不明显的蓝色荧光，可能是内源性H2S造成的，结果见图7第二列。而当Pro-S2和C-7AZ一起加到HeLa细胞中后，红色通道(λex＝514nm)和蓝色通道(λex＝405nm)均可见明显的荧光信号，说明Pro-S2可以在细胞环境中与内源性生物硫醇反应并生成H2S，结果见图7第三列。相反，把Pro-S2和C-7AZ加到NEM(即生物硫醇清除剂)预处理过的细胞在红色和蓝色通道中只显示出微不足道的荧光信号，结果见图7第四列。随后，将上述NEM预处理的细胞依次加入GSH+Pro-S2+C-7AZ，红色通道和蓝色通道均有较强的荧光，结果见图7第五列。上述实验表明生物硫醇能激活Pro-S2使其不仅能释放硫化氢而且能实现H2S释放的可视化，Pro-S2是一个能在复杂的生物系统被生物硫醇激活的有效的硫化氢供体。
实施例2
本实施例为本发明所述的硫化氢供体，该硫化物供体编号为Pro-S3，其结构式如下所示：
具体制备工艺流程如图9所示，具体制备过程为：将对羟基苯甲醇式(A)溶于丙酮中，加碳酸钾水溶液充分搅拌，滴加丙烯酰氯式(B)到反应液中，在室温下反应得到中间产物式(C)所示化合物；
称取290mg(即1mmol)化合物式(Ⅴ)溶于5mL无水四氢呋喃中，加入0.5mL氢氧化钾水溶液，即称取56mg(即1mmol)氢氧化钾得到氢氧化钾水溶液，充分搅拌后，逐滴滴加760μL(即8mmol)硫光气至体系中，室温下搅拌1h。点板监测反应完成后。氮气吹干溶剂及剩余硫光气，经柱层析纯化得到黄色固体化合物式(Ⅵ)。
称取40mg(即0.22mmol)化合物式(C)和80mg(即0.22mmol)化合物式(Ⅵ)溶于5mL无水二氯甲烷中，搅拌溶解，加53mg(即0.44mmol)4-二甲氨基吡啶(即DMAP)，室温条件下反应10min，直接经硅胶柱层析纯化，得到黄色固体，即硫化氢供体，记为Pro-S3。其中R为-OOCCH＝CH2。
所述式(A)、式(B)、式(C)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)的结构式如下所示：
图10为实施例2中Pro-S3与半胱氨酸反应机理图，半胱氨酸中巯基具有亲核性，与Pro-S3中丙烯酸酯发生迈克加成反应，生成中间体Mid 2，随后氨基继续发生亲核加成反应，脱去一分子苯醌及七元环羧基，最后生成近红外荧光染料化合物式(Ⅴ)及氧硫化碳COS，氧硫化碳能被生物体内普遍存在的碳酸酐酶催化生成硫化氢。
采用核磁共振光谱对实施例2的硫化氢供体进行表征，如图11所示，结果如下：1HNMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.55(d,J＝8.8Hz,2H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.14(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(q,J＝16.4Hz,2H),6.85(s,1H),6.61(d,J＝15.6Hz,1H)，6.34(dd，J＝10.4Hz，1H)，6.03(d，J＝10.4Hz，1H),5.56(s,2H),2.61(s,2H)，2.46(s,2H),1.08(s,6H)；
实施例3
本实施例为本发明所述的硫化氢供体，该硫化物供体编号为Pro-S4，其结构式如下所示：
称取290mg(即1mmol)化合物式(Ⅴ)溶于5mL无水四氢呋喃中，加入0.5mL氢氧化钾水溶液，即称取56mg(即1mmol)氢氧化钾得到氢氧化钾水溶液，充分搅拌后，逐滴滴加760μL(即8mmol)硫光气至体系中，室温下搅拌1h。点板监测反应完成后。氮气吹干溶剂及剩余硫光气，经柱层析纯化得到黄色固体化合物式(Ⅵ)。
取51mg(即0.22mmol)化合物式(D)和80mg(即0.22mmol)化合物式(Ⅵ)溶于5mL无水二氯甲烷中，搅拌溶解，加53mg(即0.44mmol)4-二甲氨基吡啶(即DMAP)，室温条件下反应10min，直接经硅胶柱层析纯化，得到黄色固体，即硫化氢供体，记为Pro-S4。其中R为
所述式(Ⅴ)、式(Ⅵ)和式(D)的结构式如下所示：
实施例3中Pro-S4与过氧化氢的反应机理如图13所示，过氧化氢将硼酸酯结构氧化成羟基，随后发生1,6消除反应生成TCOO及氧硫化碳。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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