区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法
阅读说明：本技术 区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法 (Terminal sialylated isomeric glycopeptide marker for distinguishing liver cancer from normal person and screening method thereof ) 是由 魏黎明 封晓晓 陆豪杰 于 2021-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学技术领域,具体为一种区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法。本发明在特定色谱保留时间下,在质谱碰撞池中选择其母离子进行碎裂,随后全部碎片离子进入离子淌度池进行分离分析,最终进行质谱检测；通过末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B-3～(+)碎片([NeuAcα2-3/α2-6Galβ1-4GlcNAc]～(+),m/z 657.24)淌度到达时间分布面积进行比较,对得到的α2,6和α2,3异构体B-3～(+)碎片相对比值进行分析,确定6个具有一定区分能力或联合区分能力的候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物。本发明有助于改变肝癌诊断的现状,对肝癌的诊断具有重要的临床价值。(The invention belongs to the technical field of biomedicine, and particularly relates to a terminal sialylated isomerized glycopeptide marker for distinguishing liver cancer from normal people and a screening method thereof. In the invention, under specific chromatographic retention time, parent ions are selected in a mass spectrum collision pool for fragmentation, and then all fragment ions enter an ion mobility pool for separation and analysis, and most preferably, the fragment ions are separated and analyzedFinally, performing mass spectrum detection; by terminal sialic acid alpha 2,6 and alpha 2,3 isomers B 3 + Fragment ([ NeuAc alpha 2-3/alpha 2-6Gal beta 1-4 GlcNAc)] + M/z 657.24) comparison of the areas of the distribution of the time of arrival of the mobilities, and comparison of the resulting alpha 2,6 and alpha 2,3 isomers B 3 + And analyzing the fragment relative ratio to determine 6 candidate terminal sialylated isomeric glycopeptide biomarkers with certain distinguishing capacity or combined distinguishing capacity. The invention is helpful to change the current situation of liver cancer diagnosis and has important clinical value for liver cancer diagnosis.)
技术领域
本发明属于生物医学
技术领域
，具体涉及区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法。背景技术
糖基化是生物体中广泛存在的一种复杂的翻译后修饰(PTM)，对蛋白质的化学和生物学特性有着重要的影响。在人类糖蛋白上，唾液酸是一种酸性9碳糖家族；在唾液酸转移酶作用下，唾液酸通过α2,3或α2,6键连接到半乳糖(Gal)残基上。血清蛋白的唾液酸化修饰在生物过程中具有重要的意义，包括免疫细胞追踪、微生物附着、凝血和炎症稳态，因此，唾液酸连接异构体的研究对于更好地理解糖基化的作用具有非常重要的意义。
肝细胞癌是我国高发恶性肿瘤之一，位居肿瘤死亡率的第二位。早诊断、早治疗是提高肝癌患者生存率的关键。目前临床上主要采用甲胎蛋白（Alpha fetoprotein, AFP）结合影像学及病理学检查进行肝癌的早期诊断，但其敏感性和特异性均不足。随着分子生物学研究的深入，新的肝癌标志物不断被发现，推动了肝癌的早期诊断，特别是一些糖蛋白及其特异修饰糖链结构等。
触珠蛋白(Hp)是一种高度唾液酸化的糖蛋白，据报道在各种类型的癌症中具有异常的N-糖基化，如肝细胞癌(HCC)。在之前的研究中，我们发现肝病患者血清触珠蛋白β链上的总N-聚糖和位点特异性唾液酸化N-聚糖与健康人相比存在明显的差异，说明Hp的聚糖在肝癌的发生过程中有着一定的作用。但是，针对Hp的N-糖肽末端唾液酸化连接异构没有被深入研究和探索。
因此，本领域技术人员针对现有技术不足，提供一类末端唾液酸化异构糖肽生物标志物，用于肝癌或者肝病人群的筛查，实现肝癌的早期干预治疗，降低肝癌病死率。
发明内容
本发明的目的是针对肝癌早期诊断标志物敏感性和特异性的不足，提供一种区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物及其筛查方法，以改变肝癌诊断的现状。
本发明提供的末端唾液酸化异构糖肽生物标志物，用于区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽;共有6个，分别为：
MVSHH184N#LTTGATLINE-H6N5S1；
MVSHHN#LTTGATLINE-H5N4F1S2；
MVSHHN#LTTGATLINE-H6N5S3；
NLFL207N#HSE-H5N4F1S2；
NLFL207N#HSE-H6N5S3；
VVLHP241N#YSQVD-H6N5F1S3 ；
（HexNAc : N; Hex : H; Fuc : F; NeuAc : S）。
各标志物可以单独区分，更可以组合区分。
本发明还提供肝癌和正常人候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查方法，具体步骤为：
（1）采用上述糖肽生物标志物在特定色谱保留时间下，在质谱碰撞池中选择其母离子进行碎裂；
（2）然后，全部碎片离子进入离子淌度池进行分离分析，最终进行质谱检测；
（3）通过末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B3 +碎片（[NeuAcα2-3/α2-6Galβ1-4GlcNAc]+,m/z 657.24）淌度到达时间分布面积进行比较，对得到的α2,6和α2,3异构体B3 +碎片相对比值进行分析，确定所述候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物。
本发明提供的肝癌和正常人候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查方法，具体操作流程为：
（1）纯化血清触珠蛋白：血清样本在10000～15000*g离心10～15分钟，随后使用HiTrap柱子进行纯化。结合柱上的Hp用洗脱缓冲液(pH 3.0, 100 mM Glycine, 0.5 MNaCl)洗脱，后丙酮沉淀浓缩。
（2）Hp蛋白酶解：对于正常人和肝癌患者纯化的血清Hp，取一定体积浓度为1mg/mL的触珠蛋白，按1：20的体积比加入浓度为200～300mM二硫苏糖醇（DTT）溶液， 56～60 ℃下反应0.5～1h，进行蛋白质的变性和还原处理。随后按1：20的体积比加入400～600mM的碘乙酰胺溶液（IAA），室温下避光反应0.5～1h进行蛋白质的烷基化处理。最后按着蛋白与胰蛋白酶50：1加入一定质量的胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，在37 ℃酶解过夜，加入一定量Glu-C消化继续酶解12～16h（按着蛋白：Glu-C= 50：1）。最终加入10～20μL甲酸溶液进行酶解反应的终止。
（3）HILIC富集N-糖肽：首先用200～500μL平衡液（80～75% ACN/0.1% TFA）平衡HILIC柱3～4次；再溶于平衡液的触珠蛋白酶解肽段上样3～4次后，用平衡液洗涤富集糖肽的HILIC柱3～4次；最后，用300～500μL 0.1% TFA的洗脱液洗脱富集在HILIC上的N-糖肽2～4次，合并洗脱液后真空离心干燥待用。
（4）LC-MS/MS分析：在线 LC 采用 Waters 公司 M-Class nano-LC 系统：A 相为0.1 % FA 水溶液；B 相为 0.1 % FA 的ACN 溶液。完整N-糖肽采用 on-column 上样，上样流速为 0.2～0.3 μL/min，上样 4～5 min；随后进入分析柱分离，色谱柱采用15～25 cmC18 柱 (nanoE MZ PST CSH130 C18 1.7μ 75 μm x 150 mm)：采用60～90分钟的梯度，从1～2%的B相开始，40～60分钟后从35～40%的B相开始，5～10分钟后增加到80～85%的B相，然后调整到1～2% B相。
（5）N-糖肽数据检索：采用ByonicTM软件(version 2.16.11, Protein Metrics,San Carlos, CA)检索触珠蛋白序列(P00738)的原始数据文件，设定母离子和子离子的质量误差分别为10～20 ppm和0.03～0.05 Da。零缺失的切割位点被胰蛋白酶、V8蛋白酶消化。固定修饰为氨基甲酰化(C)，变量修饰为氧化(M)和去酰胺化(N)。结果在1～1.2% FDR下进行过滤，Byonic评分>150的置信阈值下进行手工验证。检索出的高可信N-糖肽用于本发明中的末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查。
（6）末端唾液酸化异构糖肽生物标志物筛查中N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量分析：选用LC-MS/MS一致的色谱条件。如图1所示，在特定保留时间下，触珠蛋白的各完整N-糖肽根据其m/z在四极杆中被分别选择并进行碰撞诱导解离（CID），母离子所产生的全部碎片在离子淌度池（IM）中进行淌度分离，最终进入质谱检测器中检测并收集信号。喷雾电压为 2.0～2.5 kV，锥孔电压为25～35 V，加热毛细管至 80～120 ℃，数据采用非数据依赖性模式/数据依赖性采集。淌度行波速度为 750～1100 m/s，波高最大设定在35～40 V，N2漂移气体流速为90～100 ml/min。糖肽的 CID能量采用从 15～50 V的梯度能量。数据采集一级扫描范围 100～2000 m/z，分辨率 20K，HDMS/MS扫描模式。LocksprayMass为 LE (556.2771 Da) 数据采集软件为 MassLynx 4.1。
（7）利用MassLyn 4.1 软件对各完整N-糖肽的α2,6和α2,3异构体B3 +碎片（[NeuAcα2-3/α2-6Galβ1-4GlcNAc]+, m/z 657.24）进行淌度到达时间分布的提取（ATDs）；并根据其α2,6和α2,3异构体B3+碎片的分布时间的峰面积相对比例，实现正常人和肝癌患者血清Hp中完整N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接的相对定量综合表征。
本发明实现了在正常人和肝癌患者血清Hp中候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的确定。
本发明的有益效果为：本发明为肝癌的血清诊断提供了一类候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物。这些潜在的末端唾液酸化异构糖肽生物标志物可以独立或联合使用，即可以避免单个标志物的误判缺陷，又可以提升临床诊断能力，有助于改变肝癌的诊断现状，对肝癌的早发现、早治疗具有重要的临床价值。
附图说明
图1为肝癌血清Hp候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物筛查与检测流程图。
图2为6个血清Hp候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物t检验(双尾)结果汇总。
图3为6个血清Hp候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物联合诊断ROC曲线图。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。但以下内容不应理解为是对本发明的权利要求书请求保护范围的限制。
实施例1
采用本发明含有的候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物筛查方法和流程检测了27例肝癌患者和27例健康对照血清中Hp蛋白，通过N-糖肽末端唾液酸连接异构相对定量的比对和分析，最终确定了6个具有一定区分能力或组合区分能力的候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物。
实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯。
（一）实验所需试剂
（1）血清Hp蛋白提取：血清样本在12000*g离心十分钟，随后使用HiTrap柱子纯化。
（2）测序级胰蛋白酶和V8蛋白酶购自Promega (WI，美国)。
（二）实验操作步骤
（1）纯化血清触珠蛋白：血清样本分别在12000*g离心十分钟，随后使用HiTrap柱子进行纯化。结合柱上的Hp用洗脱缓冲液(pH 3.0, 100 mM Glycine, 0.5 M NaCl)洗脱，后丙酮沉淀浓缩。
（2）Hp蛋白酶解：对于正常人和肝癌患者纯化的血清Hp，取190μl浓度1mg/mL的触珠蛋白，加入10μl浓度为200mM二硫苏糖醇（DTT）溶液， 56 ℃下反应1h，进行蛋白质的变性和还原处理。随后加入10ul 400mM的碘乙酰胺溶液（IAA），室温下避光反应30 min进行蛋白质的烷基化处理。最后加入4μg胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，在37 ℃酶解12小时后，加入4μg Glu-C消化继续酶解12 h。最终加入10μL甲酸溶液进行酶解反应的终止。
（3）HILIC富集N-糖肽：首先用500μL平衡液（80% ACN/0.1% TFA）平衡HILIC柱3次；再溶于平衡液的触珠蛋白酶解肽段上样3次后，用平衡液洗涤富集糖肽的HILIC柱3次；最后，用300μL 0.1% TFA的洗脱液洗脱富集在HILIC上的N-糖肽2次，合并洗脱液后真空离心干燥待用。
（4）LC-MS/MS分析：在线 LC 采用 Waters 公司 M-Class nano-LC 系统：A 相为0.1 % FA 水溶液；B 相为 0.1 % TFA 的ACN 溶液。完整N-糖肽采用 on-column 上样，上样流速为 0.3 μL/min，上样 4 min；随后进入分析柱分离，色谱柱采用15 cm C18 柱(nanoE MZ PST CSH130 C18 1.7μ 75 μm x 150 mm)：采用60分钟的梯度，从1%的B相开始，40分钟后从35%的B相开始，5分钟后增加到80%的B相，然后调整到1% B相。
（5）N-糖肽数据检索：采用ByonicTM软件(version 2.16.11, Protein Metrics,San Carlos, CA)检索触珠蛋白序列(P00738)的原始数据文件，设定母离子和子离子的质量误差分别为20 ppm和0.05 Da。零缺失的切割位点被胰蛋白酶、V8蛋白酶消化。固定修饰为氨基甲酰化(C)，变量修饰为氧化(M)和去酰胺化(N)。结果在1% FDR下进行过滤，Byonic评分>150的置信阈值下进行手工验证。检索出的高可信N-糖肽用于本发明中的末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查。
（6）末端唾液酸化异构糖肽生物标志物筛查中N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3连接异构相对定量分析：选用LC-MS/MS一致的色谱条件。如图1所示，在特定保留时间下，触珠蛋白的各完整N-糖肽根据其m/z在四极杆中被分别选择并进行碰撞诱导解离（CID），母离子所产生的全部碎片在离子淌度池（IM）中进行淌度分离，最终进入质谱检测器中检测并收集信号。喷雾电压为 2.2 kV，锥孔电压为30 V，加热毛细管为 100 ℃，数据采用非数据依赖性模式/数据依赖性采集。淌度行波速度为 950 m/s，波高最大设定在 40 V，N2漂移气体流速为90 ml/min。糖肽的 CID能量采用从 15～50 V的梯度能量。数据采集一级扫描范围 100～2000 m/z，分辨率 20K，HDMS/MS扫描模式。Lockspray Mass为 LE (556.2771 Da) 数据采集软件为 MassLynx 4.1。
（7）利用MassLyn 4.1 软件对各完整N-糖肽的α2,6和α2,3异构体B3 +碎片（[NeuAcα2-3/α2-6Galβ1-4GlcNAc]+, m/z 657.24）进行淌度到达时间分布的提取（ATDs）；并根据其α2,6和α2,3异构体B3+碎片的分布时间的峰面积相对比例，实现正常人和肝癌患者血清Hp中完整N-糖肽末端唾液酸α2,6和α2,3异构连接的相对定量综合表征。本发明实现了在正常人和肝癌患者血清Hp中筛查其中归属Hp的42条N-糖肽唾液酸化比例（α2,3比α2,6连接唾液酸），采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对正常人和肝细胞肝癌患者进行分类, VIP值为> 1的变量被认为与群体差异有关。
（8）采用本发明中候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物筛查方法针对27例肝癌患者和27例健康对照血清中Hp蛋白中6个候选末端唾液酸化异构糖肽进行检测分析，如图2所示，6个具有一定区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽在27例正常人血清样本和27例肝细胞肝癌患者血清样本中t检验（双尾）结果汇总。图3给出了6个候选末端唾液酸化异构糖肽的联合ROC曲线图。6个候选末端唾液酸化异构糖肽分别为：
MVSHH184N#LTTGATLINE-H6N5S1；
MVSHHN#LTTGATLINE- H5N4F1S2；
MVSHHN#LTTGATLINE- H6N5S3；
NLFL207N#HSE-H5N4F1S2；
NLFL207N#HSE-H6N5S3；
VVLHP241N#YSQVD-H6N5F1S3。
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