具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白的制备

1、人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)突变表达载体构建

(1)通过SWISS-MODEL在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过Z-DOCK方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化。

(2)重组质粒pUC57-hG-CSF的制备：

通过NCBI Genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体pUC57中，获得大肠杆菌重组克隆载体pUC57-hG-CSF。

(3)设计定点突变引物，其序列如下：

SiteⅠ

Forward：5'-GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATT C-3'；

Reverse：5'-GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC-3'；

Site Ⅱ

Forward：5'-GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG-3'；

Reverse：5'-CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC-3'。

(4)如图1所示，以重组质粒pUC57-hG-CSF为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，以增强人粒细胞集落刺激因子/RTBD1融合蛋白的稳定性与抗病毒活性，并将突变后的序列命名为hG-CSF-Mut。将突变后的hG-CSF-Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列(RTBD1序列，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:4所示)通过柔性linker连接起来形成hG-CSF-Mut/RTBD1序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，并插入至pMD18T载体，经测序后，将测序正确的产物命名为：pMD18T-hG-CSF-Mut/RTBD1质粒，作为hG-CSF突变表达载体，以便下游基因工程操作。其中，所采用的柔性linker为(Gly₄Ser)₃连接肽。

2、大肠杆菌重组表达载体构建

分别对上述测序正确的pMD18T-hG-CSF-Mut/RTBD1质粒和pET30a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收。利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表1所示。

表1

将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞。转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan⁺抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR。将PCR鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。

3、重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白表达

将上述测序正确的阳性菌BL21(DE3)/pET30a-hG-CSF-Mut/RTBD1按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀rhG-CSF-Mut/RTBD1。

4、重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白纯化与复性

使用两步纯化法将菌体沉淀rhG-CSF-Mut/RTBD1进行纯化。其纯化方法以先进行离子交换层析、后进行金属鳌合层析的顺序进行，具体操作步骤如下：

(1)离子交换层析：使用蛋白纯化A液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，pH 6.0)平衡Q柱，将rhG-CSF/RTBD1包涵体以蛋白纯化A液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析。

(2)金属鳌合层析：使用蛋白纯化B液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，0.5mol/L NaClpH 6.0)对装载Ni²⁺Chelating Sepharose进行平衡。将离子交换层析纯化的rhG-CSF-Mut/RTBD1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化C液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)和蛋白纯化D液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，0.5mol/LNaCl，500mmol/L Imidazole，pH 8.0)进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对chelating Sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液。将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析。

(3)rhG-CSF-Mut/RTBD1蛋白复性：将经两步纯化的rhG-CSF-Mut/RTBD1蛋白溶液使用蛋白复性A液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/LDTT，pH 8.0)进行稀释，稀释至rhG-CSF-Mut/RTBD1浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液(50mmol/LTris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，pH 8.0)。调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致。蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48～72h，以满足对尿素的彻底去除以及rhG-CSF-Mut/RTBD1蛋白的缓慢而充分的折叠。蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液(50mmol/L Tris，pH 8.0)去除复性过程中残留的蔗糖及甘油等成分，并将rhG-CSF-Mut/RTBD1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1～1.5mg/mL，得到rhG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白。

实施例2重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白的药效学试验

1、构建白细胞减少症小鼠模型

选取18只小鼠，腹腔注射环磷酰胺2mg/只·天，连续注射三日。第四日取小鼠全血作血常规检测，检测白细胞数目(WBC)。本次试验中采用的模型成功标准为：白细胞数目低于参考范围最低值0.8×10⁹/L。符合以上条件的小鼠，认定白细胞减少症小鼠模型制备成功。正常组与模型对照组于造模后次日皮下给予生理盐水，给药组于造模后次日将0.2μgrhG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白皮下给予小鼠颈背部。

表2重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白治疗白细胞减少症动物分组情况

2、血常规检测

使用血常规分析仪，检测小鼠血液内白细胞数目，结果如表3所示。

表3各组白细胞数目(n＝6)

结果可知，与模型对照组相比较白细胞数量显著增加，并恢复至正常小鼠参考范围内(0.8×10⁹～6.8×10⁹/L)，证明本发明的rhG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白成功治疗白细胞减少症。

本发明公开了一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

序列表

<110> 长春萤火虫生物科技有限公司

<120> 一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工(nucleotide)

<400> 1

atgcaccacc accaccacca cacccctctg ggccctgcaa gtagtctgcc gcagagtttt 60

ctgctgaaat gctgggaaca ggttcgtaaa attcagggta ggggcgcagc cctgcaggaa 120

aaactgtgtg caacctataa actgtgtcat ccggaagaac tggtgctgct gggccatagc 180

ctgggtattc cgtgggcccc gctgagcagc tgtccgtcac aggcactgca gctggccggt 240

tgtctgagtc agctgcatag cggcctgttt ctgtatcagg gcctgctgca ggcactggaa 300

ggtattagtc cggaactggg tccgaccctg gataccctgc agctggatgt tgccgatttt 360

gcaaccacca tttggcagca gatggaagaa ctgggtatgg ccccggccct gcagccgaca 420

cagggtgcaa tgccggcctt tgcaagtgca tttcagcgcc gtgccggcgg tgtgctggtt 480

gcaagccatc tgcagagttt tcttgaagtt agctatcgcg ttctgcgtca tctggcccag 540

ccgggcggtg gtggtagcgg tggtggtggt tcaggtggcg gtggtagcgc agatgtgtgt 600

atggatccgg aaccgattgt gcgcattgtg ggccgtaatg gtctgtgtgt ggatgtgcgt 660

gatggccgct ttcataatgg taatgccatt cagctgtggc cgtgtaaaag taataccgat 720

gccaatcagc tgtggaccct gaaacgcgat aataccattc gcagcaatgg taaatgtctg 780

accacctatg gttatagtcc gggtgtgtat gttatgatct atgattgcaa taccgccgca 840

accgatgcaa cccgctggca gatttgggat aatggcacca ttattaatcc gcgcagtagc 900

ctggttctgg ccgccaccag cggcaatagc ggtaccaccc tgaccgttca gaccaatatc 960

tatgcagtga gtcagggctg gctgccgacc aat 993

<210> 2

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工(Amino acids)

<400> 2

Met His His His His His His Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu

1 5 10 15

Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Trp Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln

20 25 30

Gly Arg Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu

35 40 45

Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro

50 55 60

Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly

65 70 75 80

Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu

85 90 95

Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr

100 105 110

Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met

115 120 125

Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met

130 135 140

Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val

145 150 155 160

Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg

165 170 175

His Leu Ala Gln Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

180 185 190

Gly Gly Gly Ser Ala Asp Val Cys Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg

195 200 205

Ile Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe

210 215 220

His Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp

225 230 235 240

Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn

245 250 255

Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met

260 265 270

Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile

275 280 285

Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala

290 295 300

Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile

305 310 315 320

Tyr Ala Val Ser Gln Gly Trp Leu Pro Thr Asn

325 330

<210> 3

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工(nucleotide)

<400> 3

gcagatgtgt gtatggatcc ggaaccgatt gtgcgcattg tgggccgtaa tggtctgtgt 60

gtggatgtgc gtgatggccg ctttcataat ggtaatgcca ttcagctgtg gccgtgtaaa 120

agtaataccg atgccaatca gctgtggacc ctgaaacgcg ataataccat tcgcagcaat 180

ggtaaatgtc tgaccaccta tggttatagt ccgggtgtgt atgttatgat ctatgattgc 240

aataccgccg caaccgatgc aacccgctgg cagatttggg ataatggcac cattattaat 300

ccgcgcagta gcctggttct ggccgccacc agcggcaata gcggtaccac cctgaccgtt 360

cagaccaata tctatgcagt gagtcagggc tggctgccga ccaat 405

<210> 4

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工(Amino acids)

<400> 4

Ala Asp Val Cys Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg

1 5 10 15

Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu

35 40 45

Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu

50 55 60

Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys

65 70 75 80

Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly

85 90 95

Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly

100 105 110

Asn Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser

115 120 125

Gln Gly Trp Leu Pro Thr Asn

130 135