一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质及其制备方法和用法
阅读说明：本技术 一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质及其制备方法和用法 (Nutrient medium for stimulating growth of nematode-trapping fungi on trunk and preparation method and application thereof ) 是由 杨晓燕 肖文 佘容 李飞腾 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质及其制备方法和用法,包括营养基质S或营养基质E包括,其中：营养基质S包括：灭菌土壤0.001-100重量份；以及培养基1-1000重量份；营养基质E包括：灭菌土壤浸出液0.001-100重量份；以及培养基1-1000重量份。本发明营养基质具有刺激树干上原有捕食线虫真菌生长的功能。(The invention discloses a nutrient substrate for stimulating the growth of nematode-trapping fungi on a trunk, a preparation method and a use method thereof, wherein the nutrient substrate comprises a nutrient substrate S or a nutrient substrate E, wherein: the nutrient medium S comprises: 0.001-100 parts by weight of sterilized soil; and 1-1000 parts by weight of a culture medium; the nutrient substrate E comprises: 0.001-100 parts by weight of sterilized soil extract; and 1-1000 parts by weight of culture medium. The nutrient medium has the function of stimulating the growth of the original nematode-trapping fungi on the trunk.)
技术领域
本发明涉及一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质、一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的制备方法及一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的用法。
背景技术
线虫病对世界范围内的农林畜牧产业都造成了严重的经济损失，尤其是松材线虫，会造成具有毁灭性的松树萎蔫病。目前针对线虫寄生病的防治方法主要有：物理防治、化学防治、农业防治和生物防治，目前还未发现针对松树萎蔫病的有效药物。而针对线虫病的物理防治法效率低，化学防治法虽效果较好但对环境及人体的负面影响较大，而农业防治不仅效果不甚理想，而且其中育种的时间周期也较长，随着越来越多生防菌株的发现，越来越多的学者将目光聚集在了绿色的生物防治上。
现在广泛使用的生物防治手段主要有：利用线虫的天敌(真菌、细菌、放线菌等)制备生防制剂；提取特定菌株的次级代谢产物用于生物防治；利用基因工程的手段进行生物防治等。其中松树萎蔫病的生物防治手段主要是针对其中间宿主——松墨天牛，而并非从源头——松材线虫，进行防治。虽然已有大量的生物防治研究，但较多生物防治的研究都还停留在实验室阶段，未扩展到田间试验或野外试验，而已经商品化的生物防治剂的效果不甚理想，并且目前的防治手段都重“治”不重“防”。
发明内容
基于上述问题，一方面，本发明提供一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质，该刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质具有刺激树干上原有捕食线虫真菌生长的功能。
技术方案是：一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质，该营养基质包括营养基质S或营养基质E，其中：
营养基质S包括：灭菌土壤0.001-100重量份以及培养基1-1000重量份；
营养基质E包括：灭菌土壤浸出液0.001-100重量份以及培养基1-1000重量份。。
进一步地，所述培养基为液体培养基；优选地，液体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
进一步地，所述灭菌土壤由云南松树林下的土壤经高压蒸汽灭菌。
进一步地，所述灭菌土壤1-50重量份，培养基100-200重量份。
进一步地，所述灭菌土壤浸出液1-50重量份，培养基100-200重量份。
进一步地，所述灭菌土壤浸出液由灭菌土壤以下方法制成：
已灭菌土壤加入到水中，搅拌混匀，静置；
将静置后的上清液过滤，该滤液为灭菌土壤浸出液。
本发明还提供一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的制备方法。
一种上述的刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的制备方法，包括以下步骤：
将培养基装入容器中，加入灭菌土壤或灭菌土壤浸出液；
高压灭菌，冷却；
得到所述的刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质。
进一步地，所述高压灭菌为121℃，30min。
本发明还提供一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的用法。
一种上述的刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的用法，所述刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的施用方法为：营养基质S使用方法为使用刷子均匀涂抹至树干；营养基质E使用方法为喷雾喷涂至树干。
进一步地，所述刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质的施用量为200mL/棵树。
发明原理及有益效果：
大部分有关生物防治的研究一直着眼于寻找新的生防菌株，而忽视了原生生境中本来就存在的数量较少或无法培养的微生物，他们可能是生物防治的关键物种，只是由于数量不多，无法发挥作用。有研究表明，生态因素在生物控制能力活跃的微生物的性能和活性中起非常重要的作用，并且从生态学角度来看，这种向环境中添加菌种的方式，一方面会因为环境差异导致生防菌株的竞争力不如本土物种好，从而导致该菌种无法发挥其潜力，最终达不到理想的生物防治效果；另一方面，人为添加的生物改变了原有的生态系统，可能会破坏原有生态系统的平衡，由此造成不良影响。本申请基于生态学理论，将眼光从培养生防菌移至刺激原有生境的关键物种生长，用微生物生长的大环境—土壤，来制作制剂，刺激环境中已有但数量很少而无法发挥功能的微生物生长。
捕食线虫真菌作为一类营养菌丝特化形成捕食器官以捕食线虫的真菌，具有作为线虫病生防菌株的潜力。因此我们选用捕食线虫真菌，这种广泛生活在土壤中或腐木上，未曾从健康的树干上分离出的类群作为研究对象，采用云南松作为研究环境，探究是否能够通过刺激云南松树干上捕食线虫真菌的生长而达到预防松材线虫的目的。
附图说明
图1为本发明营养基质S组和营养基质E组捕食线虫真菌总检出率随时间的变化趋势；
图2为本发明营养基质E组捕食线虫真菌检出率时空变化规律；
图3为本发明营养基质S组捕食线虫真菌时空变化规律；
图4为本发明空白对照实验中云南松树干上捕食线虫真菌垂直分布格局。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步说明。
本发明提供的实施例仅为进一步解释本发明，不应解释为对本发明的任何限制。
本领域技术人员应当清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
本发明中，检出率计算公式为：
本发明数据分析中，使用Excel2019软件对数据进行整理以及初步分析，使用SPSS20.0软件，在检验水准为0.05的情况下，采用Pearson卡方检验对数据进行统计学分析。
本发明中，样品采集方法为：
使用无菌小刀分段采集每棵云南松树树皮(树干距地面0-5cm，5-10cm，10-20cm，20-40cm，40-80cm，80-120cm，120-200cm)。采集的树皮收集于1个5号采样袋(100mm×150mm)中，并在采样袋上记录该树木的编号和高度。每个分段采集完毕，都需要充分灼烧小刀，待小刀稍冷却，再采集下一个分段样品。最后将同一棵树的7个分段样品集中放入1个7号采样袋(200mm×140mm)中，记录采样时间和树木编号，然后再进行下一棵云南松树皮的采集。
本发明中，捕食线虫真菌的分离方法为：
采用诱饵平板法对样品进行处理。撒样前，隔着采样袋将树皮掰至大小适宜的小块，采用五点撒样法于直径90mm的CMA中撒样。撒样时每个点之间需要留有一定的空隙，且样品距培养皿外缘需空出1cm左右以便观察和纯化。每个高度的一袋样品撒一个培养皿。在每个撒完样的培养皿中加入约5000条全齿复活线虫做为诱饵，室温培养4周。随后采用单孢挑离法对捕食线虫真菌进行纯化。
本发明中，捕食线虫真菌的鉴定方法为：
①形态学鉴定
使用无菌手术刀在玉米培养基中央挖成2cm×2cm的观察室，使用无菌牙签挑取捕食线虫真菌纯培养物菌块置于观察室角落并与玉米培养基相接触，置于26.5℃恒温培养箱中培养一周，待观察室长满菌丝后，采用粘片法于微分干涉显微镜下进行拍照；拍照后在观察室内加入1-2滴全齿复活线虫幼虫悬液(约20-30条全齿复活线虫)，24h后在体视镜下观察，确定捕食器官的类型，结合分生孢子形态、着生方式以及捕食器官类型对捕食线虫真菌进行形态学鉴定。
②分子学鉴定
对形态学鉴定不出的菌株，采用试剂盒法提取捕食线虫真菌的DNA并进行电泳检测，对所提的DNA进行多基因片段测序，对其进行分子鉴定。
实施例1
在人员走动少的山上选择一块10×10m的云南松样地，在实验样地中采集云南松树林下的土壤2kg，过10目的筛子，去除腐叶及枯枝，将其带回实验室。将土壤进行2次高压蒸汽灭菌备用(121℃，30min，2次灭菌的时间间隔至少8h)。
实施例2土壤浸出液的制备
称取10g实施例1中的已经过2次高压蒸汽灭菌的土壤于烧杯中，加入10mL蒸馏水，用玻璃棒混匀后静置1h。将滤纸对折2次于漏斗中，将漏斗置于20mL量筒上，将静置后的上清液，采用玻棒引流的方式倒入漏斗，直至量筒中的液面上升至10mL。
实施例3
按表1中营养基质类型E的比例，取实施例2量筒中的土壤浸出液倒入已装好马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)的锥形瓶中(即土壤浸出液5mL，PDB100mL)，高压灭菌1次(121℃，30min)。待其冷却后，得到基于生态理论的营养基质E，将营养基质E装进事先备好的400mL无菌喷雾壶中备用。
实施例4
按表1中营养基质类型S的比例，取实施例1的已经过2次灭菌处理的土壤放入已装好马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)的锥形瓶中(即土壤5g，PDB100mL)，高压灭菌1次(121℃，30min)。待其冷却后，得到基于生态理论的营养基质S，将营养基质S装进事先备好的400mL无菌喷雾壶中备用。
表1
实施例5
于实验样地中选择6棵云南松作为效果监测的实验对象，分别取实施例3的已装入无菌喷雾壶中的营养基质E和实施例4的已装入无菌喷雾壶中的营养基质S，6棵云南松均分为2组，分别为营养基质E组和营养基质S组。
在云南松主树干距地面的0-200cm施用喷壶喷洒对应的2种营养基质(营养基质E组喷洒营养基质E，营养基质S组刷涂营养基质S)，使整个范围内的云南松主树干完全湿润，每棵树的营养基质施用量约为200mL。
施用营养基质E和S后1周、2周、3周、4周，按照本发明的样品采集方法采集云南松树皮样品，按照本发明的捕食线虫真菌的分离方法和捕食线虫真菌的鉴定方法，对云南松树皮样品进行捕食线虫真菌的分离纯化和鉴定，结果如下：
①总检出情况
施用营养基质E和S后，云南松树干上0-200cm范围内均有捕食线虫真菌分布并且检出物种增加。检出的物种均为Dactylellina属，分别为以下4种：掘氏单顶孢(Dactylellina drechsleri)、椭圆单顶孢(Dactylellina ellipspspora)、细颈单顶孢(Dactylellina parvicolla)和宽松环单顶孢(Dactylellina lysipaga)。
②捕食线虫真菌在时间尺度上的变化规律
营养基质E组云南松树干上捕食线虫真菌的总检出率随时间的推移呈现先降低后增高，最终呈现上升的趋势(如图1)。第4周的捕食线虫真菌总检出率为44.76％，明显高于第1周(29.52％)。营养基质S组云南松树干上捕食线虫真菌的总检出率均随时间的推移呈现与E相同的规律(如图1)。第4周的捕食线虫真菌总检出率为62.86％，明显高于第1周(48.57％)。
施用2种不同的营养基质后，营养基质S组的捕食线虫真菌总检出率始终高于营养基质E组的总检出率(图2)。第1周、2周、3周和4周，2组捕食线虫真菌总检出率的Pearson卡方检验结果分别为：χ2＝83.886，P<0.001；χ2＝41.429，P<0.001；χ2＝119.573，P<0.001；χ2＝32.640，P<0.001。营养基质E组和营养基质S组云南松树干上每周捕食线虫真菌的总检出率均存在统计学差异(如下表2)。
表2营养基质E组和营养基质S组每周捕食线虫真菌总检出率差异
③捕食线虫真菌在空间尺度上的变化规律
将云南松树干细分为上、中和下三段。将0-20cm为下段，中段为20-80cm，上段为80-200cm。
营养基质E组云南松树干上不同分段的捕食线虫真菌检出率，随时间变化的趋势不同。第1周，云南松树干下段(0-20cm)的捕食线虫真菌对营养基质E组的响应最为迅速，检出率为35.56％，其次为上段(80-200cm)的捕食线虫真菌，检出率为33.33％，响应较慢的是中段(20-80cm)的捕食线虫真菌，检出率为16.67％。随着时间的推移，云南松树干下段(0-20cm)和上段(80-200cm)的捕食线虫真菌检出率呈现先降低后递增，总体呈现一个上升的趋势。云南松树干中段(20-80cm)的捕食线虫真菌检出率呈现波动式上升的趋势。云南松下段(0-20cm)第4周的捕食线虫真菌检出率升高到44.44％，仅次于中段(20-80cm)的捕食线虫真菌检出率(66.67％)。而上段(80-200cm)的捕食线虫真菌检出率仅为23.33％，并未超过第1周的检出率(33.33％)(如图3)。
营养基质E组捕食线虫真菌上段(80-200cm)、中段(20-80cm)和下段(0-20cm)3个分段检出率的Pearson卡方检验结果分别为：χ2 总＝115.569，P<0.001；χ2 上中＝80.597，P<0.001；χ2 上下＝39.868，P<0.001；χ2 中下＝62.592，P<0.001。随着时间的变化，营养基质E组捕食线虫真菌3个分段的检出率均存在统计学差异(下表3)。
表3营养基质E组不同时间段捕食线虫真菌3个分段的检出率差异
营养基质S组云南松树干上不同分段的捕食线虫真菌检出率随时间变化的趋势也不甚相同。第1周，云南松树干下段(0-20cm)的捕食线虫真菌对营养基质S的响应最为迅速，检出率为55.56％，其次为中段(20-80cm)的捕食线虫真菌，检出率为50％，最后是上段(80-200cm)的捕食线虫真菌，检出率为36.67％。随着云南松树干分段的增高，捕食线虫真菌检出率呈现逐渐下降的趋势。随着时间的推移，云南松树干下段(0-20cm)、中段(20-80cm)和上段(80-200cm)捕食线虫真菌的检出率均呈现先降低后递增的趋势。下段(0-20cm)第4周捕食线虫真菌的检出率为53.33％，与第1周的检出率相差不大；中段(20-80cm)捕食线虫真菌的检出率为80.00％，明显高于第1周的检出率，并且高于同时段上段(80-200cm)和下段(0-20cm)捕食线虫真菌的检出率；上段(80-200cm)捕食线虫真菌的检出率为60.00％，明显高于第1周，并且较第4周云南松下段(0-20cm)的检出率略高(如图4)。
营养基质S组捕食线虫真菌上段(80-200cm)、中段(20-80cm)和下段(0-20cm)3个分段检出率的Pearson卡方检验结果分别为：χ2 总＝39.349，P<0.001；χ2 上中＝0.455，P＝0.929；χ2 上下＝25.522，P<0.001；χ2 中下＝30.511，P<0.001。随着时间的变化，S组捕食线虫真菌上段(80-200cm)和下段(0-20cm)，中段(20-80cm)和下段(0-20cm)的检出率均存在统计学差异，但是上段(80-200cm)和中段(0-20cm)的检出率无统计学差异(下表4)。
表4营养基质S组不同时间段捕食线虫真菌3个分段的检出率差异
第1周、2周、3周和4周，营养基质E组和营养基质S组捕食线虫真菌分段检出率的Pearson卡方检验结果分别为：χ2＝15.740，P<0.001；χ2＝29.454，P<0.001；χ2＝6.259，P＝0.044；χ2＝15.919，P<0.001。E组和S组云南松树干上每周捕食线虫真菌的分段检出率均存在统计学差异(下表5)。
表5营养基质E组和营养基质S组不同时间段捕食线虫真菌分段检出率的差异
对比实施例1(与实施例5空白对照)
在实验样地中选择3棵云南松作为空白对照的对象，并将其编号为k1，k2，k3。
按照本发明的样品采集方法采集云南松树皮样品，捕食线虫真菌的分离方法和捕食线虫真菌的鉴定方法，对云南松树皮样品进行捕食线虫真菌的分离纯化和鉴定。
本实施例在没有施用营养基质的情况下，云南松树干上确实存在捕食线虫真菌，但是仅在1棵松树靠近土壤部分的树干(0-5cm)上检出捕食线虫真菌(Monacrasporium.sp)，由于后期污染导致未能获得纯培养，无法鉴定到种(如图4)。
由实施例5的结果与对比实施例1的结果可知：营养基质E和营养基质S均具有刺激树干上原有捕食线虫真菌生长的功能，在1个月内，营养基质E和营养基质S的刺激作用可持续存在。相较于营养基质E，营养基质S的刺激效果更好。上段的喷洒强度弱于其它段的喷洒强度。从生态学角度研制的能够刺激原生环境中生防菌株生长的营养基质的生防效果更好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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