美国白蛾Rop基因dsRNA及其细菌表达液和应用
阅读说明：本技术 美国白蛾Rop基因dsRNA及其细菌表达液和应用 (Spodoptera cunea Rop gene dsRNA as well as bacterial expression solution and application thereof ) 是由 张真 张珣 张苏芳 樊智智 孔祥波 刘福 方加兴 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种美国白蛾Rop基因dsRNA及其细菌表达液和应用,该Rop基因dsRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用重组质粒在大肠杆菌HT115中表达大量所需的外源目的dsRNA,持续饲喂IPTG诱导表达靶标dsRNA的大肠杆菌HT115菌液后,对美国白蛾具有高致死能力,且对其生长发育有显著的抑制作用,采用本发明的细菌表达液防治美国白蛾的方法可实施性强、操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高,且具有环境友好等诸多优点,有很好的应用前景。(The invention discloses a fall webworm Rop gene dsRNA, bacterial expression liquid thereof and application thereof, wherein the nucleotide sequence of the Rop gene dsRNA fragment is shown as SEQ ID NO. 2. The method for preventing and treating fall webworm by using the bacterial expression liquid has the advantages of strong feasibility, convenient operation, good effectiveness and sensitivity, high insecticidal efficiency, environmental friendliness and the like, and has good application prospect.)
技术领域
本申请涉及分子生物学
技术领域
，具体而言，涉及一种美国白蛾Rop基因dsRNA及其细菌表达液和应用。背景技术
美国白蛾(Hyphantria cunea)属于鳞翅目灯蛾科，是我国极度危险性的外来入侵林业害虫，其寄主植物十分广泛，可以取食几乎所有种类的栽培树木、花卉和农作物，幼虫以群居形式取食叶片，食量大，适应性极强。成虫繁殖能力强，平均每头雌虫产卵800-900粒，最高可达2000余粒。同时成虫扩散能力也极强，雄虫可在12小时内平均飞行超过7千米，最高可超过23千米。这些特性导致美国白蛾极易暴发成灾，美国白蛾自1979年在我国首次发现以来，已经对我国农林业生态系统造成了巨大的经济损失和严重的生态威胁，一旦侵入新适生地，就很难被彻底消灭，严重威胁了我国生态安全。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)进入细胞引发的一种转录后基因沉默机制，通过沉默特异性致死基因有效导致害虫死亡。虽然RNAi技术作为害虫防治的新手段应用前景广阔，但是，众多研究发现不同种昆虫的RNAi效率差异明显，通常鞘翅目、直翅目等昆虫的RNAi效率较高，而鳞翅目昆虫的RNAi效率却很低(Wang,et al.“Variation in RNAi efficacy among insect species isattributable to dsRNA degradation in vivo”.Insect Biochemistry and MolecularBiology,77,1-9,2016；Terenius,et al.,“RNA interference in Lepidoptera:Anoverview of successful and unsuccessful studies and implications forexperimental design”.Journal of Insect Physiology.57(2),231-245,2011)，严重影响了RNAi技术在鳞翅目害虫防治中的应用。在影响RNAi效率的众多因素中，其中一个已知因素是dsRNA的稳定性，维持RNAi的有效性必须避免dsRNA被降解，如双链RNA降解酶(dsRNAdegrading enzyme，dsRNase)就是一类dsRNA专属降解酶，目前已在Bombyx mori、Spodoptera litura等鳞翅目昆虫的不同组织中检测到了dsRNase基因的表达(Liu,etal.,“Bombyx mori DNA/RNA non-specific nuclease:Expression of isoforms ininsect culture cells,subcellular localization and functional assays”.Journalof Insect Physiology.58(8),1166-1176,2012；Penga,et al.,“Identification andcharacterization of multiple dsRNases from a lepidopteran insect,the tobaccocutworm,Spodoptera litura(Lepidoptera:Noctuidae)”.Pesticide Biochemistry andPhysiology.162,86-95,2020)。研究发现，dsRNase在鳞翅目昆虫中的活性高于其他类群昆虫(Kun Yan Zhu and Subba Reddy Palli,“Mechanisms,applications,and challengesof insect RNA interference”.Annual Review of Entomology,65,293-311,2020)，dsRNase的降解可能是限制鳞翅目昆虫RNAi效率的一个主要因素。因此，RNAi在鳞翅目昆虫中较难实现，高效的RNAi靶基因在鳞翅目害虫的防治中也少有报道。
作为重要的检疫型害虫，美国白蛾的防治目前仍以化学防治为主，造成对生态环境的负面影响，虽也有利用寄生天敌和性诱剂等生物防治措施，但总体存在效率低、成本高等问题，国内外目前还没有美国白蛾高效杀虫活性的RNAi靶标基因的报道。专利申请CN111944824 A虽然公开了一种美国白蛾速激肽受体基因及dsRNA在美国白蛾防治中的应用，但此申请中采用注射法摄入dsRNA，在实际林间防治中无法实现大规模应用，并且该专利申请中速激肽受体基因及dsRNA仅能降低美国白蛾幼虫取食量和耐饥饿能力，弱化美国白蛾生命力，未达到致死效果，防治效果一般。闫晓平(“美国白蛾几丁质脱乙酰酶HcCDAs的生化特性分析及功能研究”,河北农业大学(学位论文),2018.)通过注射美国白蛾几丁质脱乙酰酶基因的dsRNA于美国白蛾5龄幼虫，能达到80％以上的幼虫死亡率，但注射剂量为10ug，剂量过高，在实际害虫防治中无法实现。王越(“基于RNA干扰的美国白蛾基因功能研究及转录组分析”,中国林业科学研究院(学位论文)，2018)构建了美国白蛾几丁质酶基因dsRNA的HT115菌株表达体系，但饲喂该重组细菌后，未产生畸形表型及化蛹率和死亡率的变化，仅导致幼虫体重的显著降低，防治效果不理想。
Rop蛋白参与细胞内的囊泡运输，如果蝇的Rop是酵母Sec.1蛋白的同源物，对囊泡运输和膜融合至关重要(Fujita,Y.et al.,“Phosphorylation of Munc-18/n-Sec1/rbSec1 by protein kinase C-Its implication in regulating the interaction ofMunc-18/n-Sec1/rbSec1 with syntaxin”.Journal of Biological Chemistry,271(13):7265-7268,1996)。Rop基因对保持细胞活性有重要的调控作用，可能间接影响昆虫的发育、生长、生殖、代谢等生理过程。目前，有关通过抑制昆虫Rop基因转录水平来防治重大检疫害虫美国白蛾未见报道。
发明内容
为克服现有鳞翅目害虫美国白蛾防治技术的缺陷和不足，本发明提供一种美国白蛾Rop基因dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种表达前述dsRNA的细菌表达液，该细菌表达液的制备方法包括：
(1)以美国白蛾cDNA为模板，用dsHcRop引物进行PCR扩增，获得所述dsRNA片段，所述dsHcRop引物序列如SEQ ID NO.10和11所示；
(2)将所述dsRNA片段连接到线性质粒上，构建重组载体；
(3)将含有dsRNA片段的重组表达载体导入到细菌感受态细胞中培养；
(4)通过IPTG诱导dsRNA产生，培养收集菌液。
进一步的，所述质粒为线性化的L4440，所述细菌为大肠杆菌HT115。
本发明还提供一种前述的dsRNA或细菌表达液在防治美国白蛾中的应用。
进一步的，通过饲喂或喷洒表达Rop基因的dsRNA的细菌表达液实现对美国白蛾的防治。
通过饲喂混合了表达Rop基因dsRNA的细菌表达液的人工饲料实现对美国白蛾的防治，具体为：将制备好的人工喂养饲料，每30g切成约0.5x0.5x0.5cm大小块状，喷洒表达Rop基因dsRNA的浓度为107CFU/mL的HT115菌液5mL，常温风干1h后，进行饲喂。
或者，直接向植株上喷洒表达Rop基因dsRNA的细菌表达液实现对美国白蛾的防治，所述细菌表达液为大肠杆菌HT115菌液。
本发明的有益效果包括：
本发明筛选获得了一个美国白蛾RNAi高效致死靶基因Rop基因，并基于该Rop基因开发了能够高效防治美国白蛾的技术，本发明采用重组质粒在大肠杆菌HT115中表达大量所需的外源目的dsRNA，持续饲喂IPTG诱导表达靶标dsRNA的大肠杆菌HT115菌液后，对美国白蛾具有高致死能力，且对其生长发育有显著的抑制作用，采用本发明的细菌表达液防治美国白蛾的方法可实施性强、操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。本发明与现有技术采用的试剂盒体外转录和化学合成方法相比，能够大大降低实验成本。
附图说明
图1为美国白蛾Rop基因电泳图；
图2为注射美国白蛾dsHcRop后8d至13d，正常生长幼虫(control)、注射dsGFP对照组(dsGFP)和注射dsHcRop处理组(dsHcRop)的幼虫死亡率；
图3为注射美国白蛾dsHcRop后13d，正常生长幼虫(control)、注射dsGFP对照组(dsGFP)和注射dsHcRop处理组(dsHcRop)在化蛹期的表型差异；
图4为注射美国白蛾Rop基因的dsRNA后48h，正常生长幼虫(control)、注射dsGFP对照组(dsGFP)和注射dsHcRop处理组(dsHcRop)幼虫中Rop基因的相对表达量；
图5为饲喂表达美国白蛾dsHcRop的大肠杆菌菌液后12d至18d，对照组幼虫(control)和饲喂dsHcRop菌液处理组(dsHcRop)幼虫的死亡率和化蛹率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、美国白蛾Rop基因全长克隆
(1)取美国白蛾幼虫，采用TRIzol法(Trizol Plus reagent，Ambion,Austin,TX,USA)提取美国白蛾的总RNA。
(2)使用反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription System kit(Promega,Madison,WI,USA)合成cDNA第一条链，反转录体系为：总RNA 1μg，Oligo(dT)15Primer(500μg/ml)0.5μL，GoScriptTM 5X Reaction Buffer 4μL，MgCl2(25mM)1μL，Random Primers(500μg/ml)0.5μL，PCR Nucleotide Mix 1μL，RecombinantRibonuclease Inhibitor 0.4μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1μL，Nuclease-Free Water补足20μL。反应条件为42℃、15min，70℃、15min。
(3)根据美国白蛾幼虫转录组序列在基因编码区序列的两侧设计引物。利用Primer5软件设计引物，得到正向引物和反向引物。
正向引物：ATGTATAATCCTGCTCTTGCC(序列表中编号：SEQ ID NO.4)
反向引物：TTAGGCGGTTAGAGAGCTCAA(序列表中编号：SEQ ID NO.5)
以反转录得到的cDNA第一链为模板，通过PCR扩增得到目标产物片段。PCR反应体系为：cDNA 2μL，Buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTP Mixture 8μL，Forward Primer 2μL，ReversePrimer2μL，Max DNA Polymerase 0.5μL，加ddH2O至100μL。反应条件为:94℃1min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
(4)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。采用DNA纯化试剂盒(天根)对目标产物进行纯化回收。回收后将产物连接pEASY-Blunt载体(TransGen,Beijing,China)，转入DH5α感受态细胞(TransGen,Beijing,China)中，涂于具有Amp抗性的筛选培养基上，挑取阳性单菌落于具有Amp抗性的液体LB培养基中，送至公司(Sangon Biotech,Co.,Ltd.,Beijing,China)进行测序。
(5)将测序结果通过NCBI数据库进行比对，得到美国白蛾Rop基因的序列片段,具体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。测序结果验证正确的质粒即具有SEQ ID NO.1序列的质粒。
实施例2、美国白蛾Rop基因dsRNA的合成
(1)将测序结果验证正确的质粒(具有SEQ ID NO.1序列的质粒)继续用带有T7启动子序列的dsRNA引物进行PCR扩增，扩增方法和体系参照上述实施例1的步骤(3)。对扩增产物进行回收纯化，回收纯化方法参照上述实施例1的步骤(4)。
所述PCR扩增引物为：
F:taatacgactcactataggGCACGCCCAACTCGACCCCT(序列表中编号：SEQ ID NO.6)
R:taatacgactcactataggCGCCGCCAACTACGAAAACA(序列表中编号：SEQ ID NO.7)
(2)上述步骤(1)所得的PCR扩增产物纯化回收后即为dsRNA体外转录的模板。
dsRNA体外合成使用T7 RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)，反应体系为：RiboMAXTM Express T7 2X Buffer 10μL，线性DNA模板约1μg，EnzymeMix，T7 Express 2μL，补足无核酸酶的水至20μL。轻轻混合并于37℃条件下孵育3h。
(3)将等体积的互补RNA反应液混合，然后于70℃条下孵育10分钟，并缓慢冷却至室温(约20min)，可实现双链RNA的退火。向199μL无核酸酶的水中添加1μL RNA酶以对随附的RNA酶溶液进行稀释(1:200)。分别加入1μL新鲜稀释的RNA酶溶液和1μL的RQ1 RNase-Free DNase，37℃条件下孵育30分钟，去除所有残存的单链RNA和DNA模板，只留下双链RNA。
(4)添加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和1体积的异丙醇，混匀并置于冰上5分钟。12000rpm，4℃离心10分钟，离心管底部可见白色沉淀。弃上清，用0.5mL的70％冷乙醇对沉淀进行洗涤，室温风干后用4体积的无核酸酶水溶解获得纯化的dsRNA，-80℃条件下储存备用。
(5)取1μL合成的dsRNA进行1％的琼脂糖凝胶电泳实验，电泳的电压条件为120伏，时间为15分钟，所用缓冲液需DEPC处理水配置，点样需使用RNAase-free枪头，dsRNA片段dsHcRop在350bp左右有一条单一清晰的条带(其具体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示)，可以用于后续实验。
实施例3、注射dsHcRop对幼虫的生长抑制
(1)选取生长正常、发育一致、大小相同的美国白蛾4龄幼虫，饥饿处理12h，注射前将4～5头幼虫置于培养皿中，在-20℃冰箱中冷冻麻醉2-3min，取出后置于冰盘上，在幼虫未恢复自主行动之前，用微量注射器往其腹部节间膜处注射6μg的实施例2所得dsHcRop。注射在体视镜下进行，观察注射液体是否完全进入虫体并无外漏现象，将注射成功并未造成明显机械损伤的幼虫放置于新的培养皿中待其自行恢复，2h后将因非实验因素死亡的幼虫取出，剩余幼虫按正常条件继续饲养，并做后续观察和取样处理。实验设2个对照组，分别为正常生长的幼虫(control)和注射外源dsGFP片段(外源dsGFP片段是从pGFP质粒中扩增的外源性片段，作为对照，大小678bp，所述dsGFP片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的幼虫(dsGFP)。每个处理注射30头幼虫，10头为一个生物学重复，注射后8天开始调查幼虫死亡率。
(2)实验结果如图2所示，正常生长的幼虫(control)和注射dsGFP的幼虫死亡率无差异，但处理后10d起，注射dsHcRop的幼虫死亡率显著高于对照组，分别是正常生长幼虫和注射dsGFP幼虫的2.3倍和1.8倍。化蛹期美国白蛾表型如图3所示，正常生长的幼虫(control)和注射dsGFP的幼虫均可以正常化蛹，但注射dsHcRop的幼虫出现畸形蛹。
实施例4、注射dsHcRop抑制美国白蛾体内Rop基因的表达
(1)在注射dsHcRop 48h后分别取样，每个处理组分别取3头幼虫(3个生物学重复)。提取收集美国白蛾的RNA，然后反转录成cDNA，实验方法同实施例1的步骤(1)和(2)。
(2)根据SEQ ID NO.1序列，利用Primer5软件设计RT-qPCR引物，进行Rop基因相对表达量检测。使用SuperReal PreMix Plus(SYBRGreen)试剂盒(天根)进行qPCR检测。反应体系为(20μL)：2X SuperReal PreMix Plus 10μL,正向引物(10μM)0.6μL,反向引物(10μM)0.6μL，cDNA模板1μL，Nuclease-Free Water补足20μL。反应条件为95℃、3min，95℃、30s，60℃、30s，40个循环，每个样本3个技术重复，反应在Bio-Rad(CFX96 Touch)仪器中进行。
所述RT-qPCR引物为：
F：GGAACAGATGCTGAAGGCGAGA(序列表中编号：SEQ ID NO.8)
R：CAGATTCTCCTCCGAAATGCCG(序列表中编号：SEQ ID NO.9)
(3)实验结果如图4所示，注射dsRNA 48h后，外源dsGFP注射处理与正常饲养的幼虫无显著差异，注射dsHcRop的幼虫中Rop基因的表达显著低于对照组，说明通过注射dsHcRop能够在美国白蛾体内引起强烈的RNAi效应，导致体内Rop基因的表达量明显降低，进而导致美国白蛾幼虫死亡或发育受到抑制。
实施例5、表达美国白蛾Rop基因dsRNA细菌表达菌液的制备
(1)在L4440质粒(Addgene公司)上选择两个酶切位点，分别为Bgl II(AGATCT)和PstI(CTGCAG)，以美国白蛾cDNA为模板，用带有相应酶切位点和保护碱基的dsHcRop引物进行PCR扩增，扩增方法和体系参照上述实施例1的步骤(3)。对扩增产物进行回收纯化，回收纯化方法参照上述实施例1的步骤(4)。
所述dsHcRop引物为：
F:GAAGATCTTCGCACGCCCAACTCGACCCCT(序列表中编号：SEQ ID NO.10)
R:AACTGCAGAACCAATGCATTGGCGCCGCCAACTACGAAAACA(序列表中编号：SEQ IDNO.11)
(2)根据两个酶切位点的序列利用BglII和PstI(Takara)将L4440载体线性化，酶切的反应体系详见说明书，酶切反应完成后，用DNA纯化回收试剂盒(天根)回收线性化的L4440载体。利用T4 DNA连接酶(TransGenBiotech)在4℃条件下过夜连接纯化的dsHcRop片段与线性化的L4440载体，构建重组载体。随后将含有dsHcRop的重组表达载体导入到HT115感受态细胞中，置于冰上放置30min，随后42℃热激1min，在冰上静置2min，然后加入不含氨苄的LB液体培养基500μL，在37℃，200rpm的条件下培养1h，之后用含有氨苄和四环素的LB平板过夜培养，验证阳性克隆，获得成功表达美国白蛾Rop基因dsRNA的细菌表达菌液。过夜摇培表达重组载体的HT115表达菌株，按1:100接种于含有氨苄(100μg/mL)和四环素(10μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇培3.5h至OD600达0.4-0.5)，加入IPTG(终浓度1mM)诱导dsRNA产生，相同条件继续培养5h收集菌液备用。采用TRIzol法(Trizol Plus reagent，USA)提取RNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳验证是否成功诱导dsRNA。
实施例6、饲喂表达dsHcRop的细菌菌液对美国白蛾的防治效果
(1)将制备好的人工喂养饲料，每30g切成约0.5x0.5x0.5cm大小块状，喷洒成功表达dsHcRop的HT115菌液5mL(浓度约107CFU/mL)，菌液制备方法同实施例5，室温风干1h后饲喂幼虫。
(2)选取生长正常、发育一致、大小相同的美国白蛾3龄幼虫，加入上述饲料进行正常喂养，以相同浓度的转入L4440空载体的HT115菌液为对照(control)。每个处理90头幼虫(30头为一个生物学重复，设3个生物学重复)，饲喂至幼虫化蛹。处理后12d起调查幼虫死亡率和化蛹率。
(3)实验结果如图5所示，连续饲喂表达dsHcRop的HT115菌液14d后，美国白蛾幼虫的死亡率达65％，是对照组的1.6倍，饲喂后18d幼虫化蛹率为35％，是对照组的0.6倍，说明连续饲喂表达dsHcRop的HT115菌液可以有效抑制美国白蛾幼虫的生长发育。
序列表
<110> 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所
<120> 美国白蛾Rop基因dsRNA及其细菌表达液和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1287
<212> DNA
<213> 美国白蛾(Hyphantria cunea)
<400> 1
atgtataatc ctgctcttgc ccaaactcgg aatggcaata tggaacgtat cgccgaacaa 60
attgccacgc tttgtgccac acttggagaa tatccttctg tgcgttatcg cagtgactgg 120
gaacggaatt tggacctggc tcagctcatc cagcaaaaac ttgatgccta caaggctgat 180
gaaccaacta tgggagaggg tccagagaag gcgcgatccc aacttctcgt tctagatcgc 240
ggattcgact gtgtatctcc attactgcat gaactgactc ttcaagctat ggcatatgat 300
cttctgccta ttgagaatga tgtttataag tatgatgttt ccggaaacat caaagaagtc 360
ttgttggatg agaatgatga actgtgggtg gatttacgtc atcaacacat tgcggtggtg 420
tccacatctg taacaaagaa cttgaagaaa tttacagaat ccaagcgcat gggtggaggc 480
gataagcagt ctatgcgtga cttgtcgcag atgatcaaaa agatgcccca gtatcagaag 540
gaactatcca aatacgctac acatctgcgc ttagccgagg attgtatgaa atcctaccaa 600
ggctatgtgg acaagctgtg caaggtggaa caggatttgg caatgggaac agatgctgaa 660
ggcgagaaaa tcaaagatca catgagaagt attgtaccag tgcttctaga ccaaactgtg 720
gtgaacttca acaagatgcg catcattgcg ttgtacatca tgtccaagaa cggcatttcg 780
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ctgttgaacc ttgccaacct cggtcttaac gtcgttattg atggtaatag gaagaagcaa 900
taccaaatca caaggaagga aagaattact gaacaaacct accaaatgtc cagatggacg 960
ccagttatca aggatattat ggaagatgcc attgaagata aactggatca acgtcattat 1020
ccgttcctgg ctggtcgcgc gcaaacgtca ggataccaag cacctactag cgtacgctac 1080
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ttcgtagttg gcggcgtatg cttctctgaa attcgctgcg cctacgaagt tactgctgca 1200
ctcaagaact gggaggtcat tgttggctca tcacacatac tgacgccaga gaacttcctc 1260
tcagacttga gctctctaac cgcctaa 1287
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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tactgaacaa acctaccaaa tgtccagatg gacgccagtt atcaaggata ttatggaaga 180
tgccattgaa gataaactgg atcaacgtca ttatccgttc ctggctggtc gcgcgcaaac 240
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<210> 3
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<212> DNA
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<400> 3
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tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 240
acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 300
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aactgcagaa ccaatgcatt ggcgccgcca actacgaaaa ca 42