血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物
阅读说明：本技术 血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物 (Blood sugar level increase inhibitor, diabetes inhibitor and food composition ) 是由 中岛绫香 铃木健吾 菅原达也 真锅祐树 于 2019-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物,其成为源自微藻类的类胡萝卜素混合物的新的使用方法。本发明涉及含有源自微藻类的类胡萝卜素混合物作为有效成分、类胡萝卜素混合物以硅藻黄质作为主成分的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物。例如,源自微藻类的类胡萝卜素混合物是源自眼虫藻的类胡萝卜素混合物,包含硅藻黄质作为主成分,并且包含玉米黄质和异黄素。另外,例如,通过将其与高GI食品一起摄取,可以用于抑制血糖值的上升。(The invention provides a blood sugar rise inhibitor, a diabetes inhibitor and a food composition, which are new using methods of carotenoid mixtures derived from microalgae. The present invention relates to a blood glucose level increase inhibitor, a diabetes inhibitor, and a food composition containing a carotenoid mixture derived from microalgae as an active ingredient, the carotenoid mixture containing diatoxanthin as a main component. For example, the carotenoid mixture derived from microalgae is a carotenoid mixture derived from euglena, contains diatoxanthin as a main component, and contains zeaxanthin and isoflavin. In addition, for example, it can be used to suppress an increase in blood glucose level by taking it together with a high GI food.)
技术领域
本发明涉及新的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物，特别是涉及以源自微藻类的类胡萝卜素混合物作为有效成分的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物。
背景技术
通常，通过胰岛素的作用在生物体内将血液中的葡萄糖浓度调节到一定范围内，糖尿病是该葡萄糖的调节机能无法正常发挥作用、血液中的葡萄糖浓度异常上升的疾病。
糖尿病大致分为1型糖尿病和2型糖尿病而存在，1型糖尿病是胰脏中的β细胞被破坏而无法从胰脏分泌胰岛素的疾病。
2型糖尿病被称作一种生活习惯病，是由于肥胖、过食、运动不足、压力等环境因素引起免疫系统异常、导致胰岛素的机能受阻，在中年以后的更高龄的肥胖者中容易发病、发展的疾病。
更具体地，据称这是由于甘油三酸酯在血液和器官中异常积累而导致胰岛素分泌异常和胰岛素抵抗的疾病。
在这种情况下，对于据称占糖尿病、尤其是日本人糖尿病患者的90％以上的2型糖尿病而言，尽管已经开发出许多治疗剂，但是，没有取得足够的临床结果、引起精神症状和对心脏的副作用等的情况很多。
因此，需要开发兼具安全性和有效性的以天然来源的物质作为有效成分的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂。
另一方面，类胡萝卜素作为天然色素有用、并具有抗氧化作用等的多种有效作用，因此在医药品、食品、化妆品等领域的利用价值日益提高。
作为使用类胡萝卜素的糖尿病抑制剂，例如，在专利文献1中，公开了以岩藻黄质作为主成分的类胡萝卜素混合物。具体地公开了，岩藻黄质是源自微藻类的提取物，显示出抗糖尿病特性，并且岩藻黄质与具有营养辅助价值的其他类胡萝卜素组合是令人期待的。
另外，非专利文献1中，公开了通过摄取源自微藻类的虾青素来预防生活习惯病的效果。具体而言，报道了，通过向高脂肪饮食喂养的小鼠给与虾青素，提示该小鼠内脏脂肪量、空腹时血糖值和胰岛素值得到改善。
在上述类胡萝卜素中，作为除岩藻黄质和虾青素以外的代表性类胡萝卜素，存在于浮游植物、褐藻类、硅藻类等微藻类中所含的硅藻黄质(Diathoxanthin，CAS登记号：31063-73-7)。
硅藻黄质是叶黄素类的一种，是具有在高分子中具备三键的独特结构的类胡萝卜素。
针对硅藻黄质，虽然预期它与其他类胡萝卜素一样也具有抗氧化作用，但是由于较难大量获得且价格昂贵，因此对其机能性尚不甚了解。
因此，需要阐明以作为除岩藻黄质和虾青素以外的类胡萝卜素的硅藻黄质作为主成分的类胡萝卜素混合物的机能、表现机能性的机理，以及开发这些物质的利用方法等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2018-512432号公报
非专利文献1：Yinhua Ni et al.,“Astaxanthin prevents and reverses diet-induced insulin resistance and steatohepatitis in mice：A comparison withvitamin E”,Scientific Reports,5：17192(2015)
发明内容
发明要解决的问题
鉴于上述问题而完成了本发明，并且本发明的目的在于提供新的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物。
本发明的其他目的在于提供血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物，其成为以硅藻黄质作为主成分的源自微藻类的类胡萝卜素混合物的新的使用方法。
解决问题的技术手段
本发明人等经过深入研究、结果发现：以叶黄素、特别是硅藻黄质作为主成分的源自微藻类的类胡萝卜素混合物具有抑制血糖值上升的作用。
因此，根据本发明，通过含有源自微藻类的类胡萝卜素混合物作为有效成分、上述类胡萝卜素混合物以叶黄素(岩藻黄质、虾青素除外)作为主成分的血糖值上升抑制剂，解决了上述问题。
此时，上述叶黄素可以是硅藻黄质，上述微藻类也可以是眼虫藻。
此外，上述类胡萝卜素混合物可以以硅藻黄质作为主成分，并且可以包含选自玉米黄质和异黄素中一种以上的合物，并且还可以包含5.0％～80.0％的硅藻黄质。
此外，上述类胡萝卜素混合物可以包含10.0％～80.0％的硅藻黄质，2.0％～20.0％的玉米黄质和0.1％～6.0％的异黄素。
另外，通过与高GI食品一起摄取，可以用于抑制摄取高GI食品后的血糖值的上升。另外，通过经口摄取至少连续6周，可以用于抑制血糖值的上升。
如上所述，通过与高GI食品一起摄取本发明的类胡萝卜素混合物，可以在摄取高GI食品的情况下，有效地抑制血糖值上升。
在此，“高GI食品”是指GI(Glycemic Index：血糖指数)高的食品，“GI”是碳水化合物摄取后的血糖值上升速度的指标。
GI越高，摄取食品后血糖值越急剧上升，当该血糖值急剧上升时，胰脏急剧分泌大量胰岛素。该胰岛素将血糖转换成能量，另一方面，多余的糖质存储在脂肪组织中。因此，从包括糖尿病的生活习惯病等的观点出发，应尽可能避免高GI食品。
另外，上述问题也通过以下的糖尿病抑制剂解决：含有源自微藻类的类胡萝卜素混合物作为有效成分，上述类胡萝卜素混合物以叶黄素(岩藻黄质、虾青素除外)作为主成分。
此外，上述问题也通过以下的用于抑制血糖值上升或用于抑制糖尿病的食品组合物解决：含有源自微藻类的类胡萝卜素混合物作为有效成分，上述类胡萝卜素混合物以叶黄素(岩藻黄质、虾青素除外)作为主成分。
此外，上述问题也通过以下制造方法解决：
该方法用于制造以叶黄素(岩藻黄质、虾青素除外)作为主成分、用于抑制血糖值上升或用于抑制糖尿病的类胡萝卜素混合物，该方法包括：
培养具有生产上述类胡萝卜素混合物的能力的微藻类的培养工序，和
从通过上述培养工序获得的微藻类取得上述类胡萝卜素混合物的取得工序。
发明的效果
根据本发明，能够提供新的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物。
此外，能够提供血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂和食品组合物，其成为以硅藻黄质作为主成分的源自微藻类的类胡萝卜素混合物的新的使用方法。
附图说明
图1是源自眼虫藻的类胡萝卜素混合物的HPLC定量分析的色谱图(之1)。
图2是源自眼虫藻的类胡萝卜素混合物的HPLC定量分析的色谱图(之2)。
图3显示了类胡萝卜素混合物中中性脂质的TLC分析结果。
图4显示了类胡萝卜素混合物中极性脂质的TLC分析结果。
图5是比较将各组饲料给与小鼠6周时体重变化的图。
图6是比较将各组饲料给与小鼠6周后肝脏重量变化的图。
图7是比较将各组饲料给与小鼠6周后的血中的总胆固醇值的图。
图8是比较将各组饲料施用给小鼠6周后的血中的葡萄糖值的图。
具体实施方式
针对本发明的实施方式，参照图1至图8进行说明。
本实施方式涉及血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂、和食品组合物，其以源自微藻类的类胡萝卜素混合物作为有效成分，上述类胡萝卜素混合物以叶黄素(岩藻黄质、虾青素除外)作为主成分。
另外，本发明涉及制造方法的发明，其制造将以叶黄素作为主成分的类胡萝卜素混合物作为有效成分的血糖值上升抑制剂，该制造方法包括：培养具有生产类胡萝卜素混合物能力的微藻类的培养工序，和
从获得的微藻类取得类胡萝卜素混合物的类胡萝卜素混合物的取得工序。
<源自微藻类的类胡萝卜素混合物>
“微藻类”是数μm至数十μm左右大小的单细胞或多细胞体的植物，其主要通过在水中进行光合作用而生活。
作为微藻类，可以举出，蓝藻、绿藻、裸藻(眼虫藻)、轮藻、火焰藻、黄藻、褐藻、红藻、硅藻、圆石藻、沟鞭藻、真眼点藻、金藻、蓝绿藻或共球藻。
在该实施方式中，期望使用裸藻(眼虫藻)，但是没有特别限制。
“眼虫藻”包括在动物学、植物学分类中归类为眼虫藻属(Euglena)的所有微生物、其变种、其突变体。
此处，眼虫藻属(Eugulena)的微生物是指：在动物学中，属于眼虫目(Euglenida)的眼虫目(Euglenoidina)的微生物，该眼虫目属于原生动物门(Protozoa)的鞭毛虫纲(Mastigophorea)、植物鞭毛虫亚纲(Phytomastigophorea)。另一方面，在植物学中，它属于裸藻目(Eaglenales)，该裸藻目属于裸藻植物门(Euglenophyta)的裸藻类纲(Euglenophyceae)。
作为眼虫藻属的微生物(眼虫藻细胞)，可以使用纤细眼虫(E.gracilis)，尤其是纤细眼虫(E.gracilis)Z株、纤细眼虫(E.gracilis)NIES-49株等。另外，也可以使用纤细眼虫(E.gracilis)Z株的突变株SM-ZK株(叶绿体缺失株)、变种的纤细洛藻(var.bacillaris)、源自这些种的叶绿体突变株等的基因突变株的β-1,3-葡聚糖酶，也可以使用Euglena intermediate、Euglena piride、其他眼虫藻类。
眼虫藻属广泛分布在池塘和沼泽等的淡水中，可以从这些分离使用，或者，也可以使用已经分离的任何的眼虫藻属。
在本实施方式中，作为纤细眼虫，优选使用纤细眼虫(E.gracilis)，特别优选使用纤细眼虫(E.gracilis)Z株或NIES-49株，但是没有特别限定。
针对“眼虫藻细胞的培养”，可以使用培养液进行。碳源作为营养源添加到培养液中，碳源包括无机碳源(CO2，NaHCO3，Na2CO3等)和有机碳源(葡萄糖等)。作为本实施方式中使用的培养液，优选使用不包含葡萄糖等的有机碳源作为营养源的独立营养培养基，但不限于此。例如，可以使用添加有氮源、磷源、矿物质等的营养盐类的培养液，例如Cramer-Myers培养基、改良的Cramer-Myers培养基((NH4)2HPO4 1.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/l、CaCl2·2H2O 0.02g/l、Fe2(SO2)3·7H2O 3mg/l、MnCl2·4H2O 1.8mg/l、CoSO4·7H2O 1.5mg/l、ZnSO4·7H2O 0.4mg/l、Na2MoO4·2H2O 0.2mg/l、CuSO4·5H2O 0.02g/l，盐酸硫胺(维生素B1)0.1mg/l，氰基钴胺(维生素B12)(pH3.5))。予以说明，(NH4)2HPO4也可以变换为(NH4)2SO4或NH3水溶液。
培养液的pH优选是2以上，此外，其上限优选是6以下，更优选是4.5以下。通过将pH设置为酸性侧，光合微生物可以比其他微生物更有优势地生长，因此可以抑制污染。
眼虫藻细胞的培养也可以通过以下方式进行：直接利用太阳光的开池方式，将通过聚光装置聚光的太阳光通过光纤等输送、照射到培养槽中、由光合作用利用的聚光方式。
另外，眼虫藻细胞的培养可以使用例如分批供给法进行，但是也可以通过以下进行：烧瓶培养，使用发酵槽的培养，分批培养法，半分批培养法(流加培养法)，连续培养法(灌注培养法)，任何液体培养方法。
眼虫藻细胞的分离例如通过培养液的离心分离或简单沉降来进行。
“类胡萝卜素混合物”是一种混合物，其包含一种叶黄素作为主成分，此外，包含选自叶黄素中的其他化合物的一种以上的化合物作为副成分。
“叶黄素”是类胡萝卜素中包含羟基、羰基或环氧基形式的氧的色素的总称，具体而言，叶黄素中包含：环氧玉米黄质、虾青素、角黄素、枳橙黄质、β-隐黄质、硅甲藻黄素、硅藻黄质、甲藻黄素、毛茛黄素、岩藻黄质、黄体素、新叶黄素、紫杉紫素、玉红黄质、紫黄质和玉米黄质。
具体而言，本实施方式的类胡萝卜素混合物是包含硅藻黄质作为主成分、包含选自玉米黄质和异黄素中的一种以上化合物作为副成分的混合物，更优选是包含玉米黄质和异黄素两者作为副成分的混合物。
予以说明，类胡萝卜素混合物可以进一步包含除这些以外的类胡萝卜素(叶黄素)。
“硅藻黄质”是如下式(化学式1)所示的、具有在高分子中具有三键的结构的类胡萝卜素(Diathoxanthin，CAS登记号：31063-73-7，化学式C40H54O2，分子量：566.87)。
硅藻黄质包含在浮游植物、褐藻类、硅藻类等的微藻类中，在本实施方式中从眼虫藻取得。
[化学式1]
“玉米黄质”是具有由下式(化学式2)表示的结构的类胡萝卜素(Zeaxanthin，CAS登记号：144-68-3，化学式C40H54O2，分子量：568.89)，除了包含在食用蔬菜中以外，还包含在细菌类和螺旋藻属等的藻类中，是日常饮食生活中能够大量摄取的成分。
玉米黄质除了用于食品着色以外，还具有抗肥胖作用、抗癌作用，其衍生物具有抗氧化作用。
[化学式2]
“异黄素”是如下式(化学式3)所示的、具有在高分子中具有两个三键的结构的类胡萝卜素(Alloxanthin，CAS登记号：28380-31-6，化学式C40H52O2，分子量：564.85)，包含在隐藻类中。
[化学式3]
以使用检测波长为450nm的检测器的液相色谱法定量分析的色谱图中的峰面积的比率计，本实施方式的类胡萝卜素混合物可以包含：相对于类胡萝卜素混合物的总重量的100％的5.0％～80.0％硅藻黄质、1.0％～20.0％玉米黄质、0.1％～10.0％异黄素。
此外，优选包含硅藻黄质10.0％～80.0％，玉米黄质2.0％～20.0％，异黄素0.1％～6.0％。
<类胡萝卜素混合物的制造方法>
本实施方式的类胡萝卜素混合物通过进行以下工序的制造方法制造：在上述培养条件下培养眼虫藻的“培养工序”，分离眼虫藻的“分离工序”，将分离的眼虫藻粉碎的“粉碎工序”，将粉碎了的眼虫藻分散于提取溶剂的“分散工序”，从分散了的眼虫藻提取类胡萝卜素提取物的“提取工序”，从类胡萝卜素提取物取得包含硅藻黄质的类胡萝卜素级分(类胡萝卜素混合物)的“取得工序”。
首先，在培养工序(工序S1)中，在上述培养条件下培养眼虫藻。具体而言，在独立培养条件下培养眼虫藻。
接下来，在分离工序(工序S2)中，分离在上述培养工序中培养了的眼虫藻。具体而言，眼虫藻的分离通过培养液的离心分离或简单沉降、膜过滤等的已知的分离方法进行，但是没有特别限制。
将分离了的眼虫藻洗涤后，可以通过公知的干燥方法(真空冷冻干燥，喷雾干燥，加热真空干燥等)进行干燥，由此制备眼虫藻的藻体干燥物。
接下来，在粉碎工序(工序S3)中，通过公知的粉碎方法将在上述分离工序中经分离的眼虫藻进行粉碎。具体而言，可以举出，将提取溶剂添加至经分离的眼虫藻、通过超声波破碎机等进行破碎的方法，但是没有特别限定。
接下来，在分散工序(工序S4)中，将在上述粉碎工序中粉碎了的眼虫藻细胞分散在提取溶剂中，获得分散液。
具体而言，作为分散工序中使用的提取溶剂，可以使用乙腈等亲油性的极性溶剂。
接下来，在提取工序(工序S5)中，从在上述分散工序中分散在提取溶剂中的眼虫藻提取类胡萝卜素提取物。
提取条件没有特别限定，可以加热，施加超声波等外部刺激，振荡，促进类胡萝卜素的提取。
最后，在取得工序(工序S6)中，从在上述提取工序中获得的类胡萝卜素提取物中取得包含硅藻黄质的类胡萝卜素级分(类胡萝卜素混合物)。
作为分级方法，具体而言，可以举出，通过适当的分离手段(例如，反相或正相高效液相色谱分配提取，凝胶过滤法，硅胶色谱法等)，分级而获得硅藻黄质含量高的级分的方法。或者，可以举出，将包含硅藻黄质的类胡萝卜素提取物过滤，分离成提取液和残余物，将提取液浓缩，通过液相色谱法分级的方法。
<用途、用法和用量>
本实施方式的类胡萝卜素混合物可以通过给与糖尿病患者或除患有糖尿病的人以外的动物而用作糖尿病(特别是2型糖尿病)的治疗剂。
此外，也可以用作糖尿病预防剂(尤其是2型糖尿病预防剂)、糖尿病抑制剂(尤其是2型糖尿病抑制剂)，其以在糖尿病发病之前的人、潜在的糖尿病患者的人、空腹时高血糖的人、餐后高血糖的人、除这些人以外的其他动物作为对象。
此外，也可以用作以妊娠的人作为对象的妊娠糖尿病预防剂、妊娠糖尿病抑制剂。
此外，也可用作伴随糖尿病的并发症预防剂、并发症抑制剂、并发症治疗剂。
本实施方式的类胡萝卜素混合物可以用作血糖值上升抑制剂。
优选地，通过与食品(特别是GI食品)同时摄取，可以用作抑制血糖值上升的血糖值上升抑制剂。
此外，优选地，通过连续一定时期而经口摄取，可以用作抑制血糖值上升的血糖值上升抑制剂。
本实施方式的类胡萝卜素混合物可以用作用于抑制血糖值上升或用于抑制糖尿病的药物组合物、食品组合物等的组合物等。
在医药领域中，通过将能够有效发挥上述作用的量的类胡萝卜素混合物与药学上可接受的载体或添加剂进行配合，来提供具有上述作用的药物组合物。该药物组合物可以是药品，也可以是类药品。
该药物组合物可以内部或外部施用，可以通过内服剂、静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射和/或腹膜内注射等的注射剂、经粘膜施用剂、经皮施用剂等的制剂形式使用。
作为该药物组合物的剂型，可以举出，片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂或散剂等的固体制剂，以及液体剂、软膏剂和凝胶剂等的半固体制剂。
在食品领域中，可以通过将在生物体内能够发挥抑制血糖值上升作用或抑制糖尿病作用的有效量的类胡萝卜素混合物作为食品原料配合在各种食品中，来提供具有上述作用的食品组合物。
即，本发明可以提供在食品领域中被标示为具有血糖值上升抑制作用的食品组合物。作为该食品组合物，可以举出，普通食品、以及特定保健用食品、营养机能食品、标示机能性的食品、医院患者用食品、补充剂等。此外，也可以用作食品添加剂。
作为上述食品组合物，例如可以举出，调味料、畜肉加工品、农产加工品、饮料(清凉饮料、酒精饮料、碳酸饮料、乳饮料、果汁饮料、茶、咖啡、营养饮料等)、粉末饮料(果汁粉、汤粉等)、浓缩饮料、点心类(糖果(润喉糖)、曲奇、饼干、口香糖、软糖、巧克力等)、面包、谷物等。此外，在特定保健用食品、营养机能食品、标示机能性的食品等的情况下，也可以是胶囊、锭剂、糖浆、颗粒、粉末等形式。
予以说明，“特定保健用食品”是包含影响生理学机能等的保健机能成分的食品，经消费者厅长官批准可以标示为适合特定保健用途。
“营养机能食品”是用于补充营养成分(维生素，矿物质)的食品，标示营养成分的机能的食品。
“标示机能性的食品”是由经营者负责根据科学依据标示机能性的食品。在出售之前，有关安全性和机能性依据的信息等已通知消费者厅长官。
作为本实施方式的血糖值上升抑制剂、糖尿病抑制剂的用量，例如，针对人类或人类以外的动物，可以与食品(特别是GI食品)同时经口摄取，达到预定的摄取量。
实施例
<实施例1>
通过以下顺序制备源自眼虫藻的类胡萝卜素混合物。
1)将20L乙腈添加到20kg纤细眼虫藻粉末(由(株)Euglena制)中，通过超声波破碎机进行破碎，获得破碎的提取混合物。
2)将粉碎的提取物混合物过滤，分离为提取液和残余物。
3)使用旋转蒸发仪浓缩该提取液，通过中压液相色谱法进行分级。使用液相色谱法装置，使用ODS柱(GL Science公司制，InertSustain C18)作为柱，使用乙腈作为洗脱液，在270nm的检测波长下进行分级。
4)使用HPLC(高效液相色谱法)，从经分级的各级分中回收包含硅藻黄质的类胡萝卜素级分，通过蒸发仪进行浓缩。
通过上述方法，获得0.4g的红褐色粉末，其为包含硅藻黄质的类胡萝卜素级分。该粉末用作类胡萝卜素混合物。
<试验1：类胡萝卜素混合物的HPLC定量分析>
使用HPLC在以下条件下进行实施例1的类胡萝卜素混合物的定量分析。
将0.1g的类胡萝卜素混合物溶解在乙腈中，过滤而获得的物质作为测定样品溶液。
使用高效液相色谱装置，使用LC-6AD(岛津制作所制)作为泵，使用PDA检测器(SPD-M20A)作为检测器，使用ODS柱(东曹公司制，TSKgel ODS-80Ts)作为柱。
作为流动相，使用乙腈、甲醇和水的混合溶剂(以75∶15∶10的体积比混合而获得的混合溶剂)作为A液，使用乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂(以70∶30的体积比混合而获得的混合溶剂)作为B液。
在柱温40℃、流速1.0ml/min、检测波长450nm下进行测定。
作为试验1的试验结果，实施例1的色谱图如图1、图2所示(n＝2)。
通过紫外可见吸收光谱测定、质谱法、色谱法中的保留时间，推定除了硅藻黄质之外，还存在玉米黄质和异黄素。
在上述定量分析中，求出色谱图中对应于硅藻黄质、玉米黄质和异黄素的每个峰面积的比例(％)。
对于每个峰面积的比例(％)，求出相对于检测到的全部成分(全部推定为类胡萝卜素)的峰面积的合计100％的比例(％)。
图1的色谱图(实施例1-1)如下。
峰编号1：异黄素 0.4％
峰编号2：硅藻黄质 13.3％
峰编号3：玉米黄质 2.1％
图2的色谱图(实施例1-2)如下。
峰编号1：异黄素 5.6％
峰编号2：硅藻黄质 75.9％
峰编号3：玉米黄质 18.4％
在以下试验中，使用实施例1-1的类胡萝卜素混合物。
<试验2：类胡萝卜素混合物的TLC分析(中性脂质)>
使用TLC(薄层色谱法)，根据以下顺序进行实施例1的类胡萝卜素混合物中的中性脂质的TLC分析。
将类胡萝卜素混合物(0.01mg/ml，0.1mg/ml，1mg/ml)和标准品(油酸，三油酸甘油酯，棕榈酸胆固醇酯，胆固醇，硅藻黄质，玉米黄质)分别点样在硅胶板上。
使用己烷、二乙醚和乙酸的混合溶剂(以65∶35∶1的体积比混合而获得的混合溶剂)进行展开。
用数码相机拍照后，将硅胶板浸入硫酸铜显色溶液中，使用热板在180℃下加热5～10分钟，进行显色。
予以说明，关于类胡萝卜素混合物的质量，将其与已知量的硅藻黄质标准品进行比较来定量，将其确定为硅藻黄质的每1L液体培养基的质量(mg/ml)。
试验2的TLC分析结果示于图3。从每个样品中的硫酸铜显色前后的TLC分析结果，发现类胡萝卜素混合物没有混入中性脂质。
<试验3：类胡萝卜素混合物的TLC分析(极性脂质)>
使用TLC(薄层色谱)，通过以下顺序进行实施例1的类胡萝卜素混合物中的极性脂质的TLC分析。
将类胡萝卜素混合物(0.01mg/ml)和标准品(磷脂酰胆碱，单半乳糖二酰基甘油，双半乳糖二酰基甘油，硅藻黄质，玉米黄质)分别点样在硅胶板上。
使用氯仿、甲醇和水的混合溶剂(以64∶16∶2的体积比混合而获得的混合溶剂)进行展开。
用数码相机拍照后，将硅胶板浸入硫酸铜显色溶液中，使用热板在180℃下加热5～10分钟，进行显色。
试验3的TLC分析结果示于图4。从每个样品中的硫酸铜显色前后的TLC分析结果，发现类胡萝卜素混合物没有混入极性脂质。
实施例1的色谱图如图1所示。
<试验4：使用高脂肪饮食小鼠的类胡萝卜素混合物的影响>
当使小鼠经口摄取具有下表1所示饲料组成的类胡萝卜素混合物时，对“体重变化”、“肝脏重量”、“血中的总胆固醇量”和“血中葡萄糖量”进行测定，进行试验。
在本试验中，使用了18只C57BL/6J小鼠(6周龄的雄性，体重20g-23g)(n＝6)。饲养条件设定为室温24±2度，明暗周期12小时。
首先让小鼠自由摄取固体饲料和水，通过10天的预备饲养使其适应饲养环境。预备饲养完成后，按照下表1所示的饲料组成，分成1)AIN93G基本饮食组(以下称“对照组”)、2)基本饮食中配合了重量比为30％的脂质的“高脂肪饮食组”、3)配合了重量比为0.04％类胡萝卜素混合物的“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的共计三组，给与每组不同的饲料，以6周的自由摄取进行试验饲养。
[表1]
*合计的值通过四舍五入而成为1000.00。
将饲料中的类胡萝卜素混合物通过以下顺序溶解在大豆油中，进行配合。
将类胡萝卜素混合物与乙醇一起放入茄形烧瓶中并溶解。使叔丁基对苯二酚溶于加热至70℃的精制大豆油中，恢复至常温，然后与溶于乙醇的类胡萝卜素混合物充分混合。使用旋转蒸发仪蒸馏出乙醇，将附着在茄形烧瓶上的类胡萝卜素用乙醇重新溶解，重复实施，直到类胡萝卜素与精制大豆油完全混合。另外，通过氮气使精制大豆油鼓泡，完全除去乙醇，将饲料与类胡萝卜素混合物混合。
在饲养期间测定每天体重。在6周的试验期终止后，在异氟烷麻醉下，将过夜禁食的小鼠剖腹，采取肝脏并从下腔大静脉收集血液。
用生理盐水洗涤采取的肝脏后，测定肝脏重量。
此外，将采取的血液离心分离后(2000rpm，15分钟，4度)，采取所获得的血液，在80度下保存。然后，使用定量试剂盒(和光纯药工业公司制)定量血液中的总胆固醇值、葡萄糖值。
作为试验结果，分别比较了对照组、高脂肪饮食组和高脂肪饮食+类胡萝卜素组的“体重变化”、“肝脏重量”、“血中总胆固醇值”和“血中葡萄糖值”，从而获得的图在图5、图6、图7、图8中示出。另外，各自的数值示于下表2。
予以说明，单位“mg/dL”是指每1dL血液中的总胆固醇值(mg)、葡萄糖值(mg)。
[表2]
关于饲养期间中的体重，发现了“高脂肪饮食组”、“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的小鼠的体重几乎在整个期间有比“对照组”增加的倾向。另外，发现了“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的体重低于“高脂肪饮食组”的倾向。
此外，关于饲养期6周后的体重，确认了“高脂肪饮食组”、“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的小鼠的体重比“对照组”显著增加(P＜0.05)。另外，发现了“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的体重比“高脂肪饮食组”低的倾向。
关于饲养期6周后的肝脏重量，发现了“高脂肪饮食组”的小鼠的肝脏重量比“对照组”显著增加的倾向。另一方面，发现了“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的肝脏重量与“对照组”相比没有增加而为同等的倾向。
关于饲养期6周后的血中总胆固醇值，发现了“高脂肪饮食组”、“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的小鼠的血中总胆固醇值比“对照组”增加的倾向。另外，发现了“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的血中总胆固醇值比“高脂肪饮食组”降低的倾向。
关于饲养期6周后的血中葡萄糖值，发现了“高脂肪饮食组”的小鼠的血中葡萄糖值比“对照组”显著增加(P＜0.05)。另一方面，认定了“高脂肪饮食+类胡萝卜素组”的血中葡萄糖值与“对照组”相比没有增加而为同等(P＜0.05)。
由上述可知，通过饲养期中的体重变化、饲养期6周后的体重、肝脏重量和血中总胆固醇值的试验结果，表明了：通过使小鼠经口同时摄取高脂肪饮食(例如高GI食品)和实施例1的类胡萝卜素混合物，发挥了抑制摄取高脂肪饮食后的体重(特别是体脂肪)、肝脏重量(特别是肝脏脂肪)和血中胆固醇值的上升的作用。
另外，通过饲养期6周后的血中葡萄糖值的试验结果，发现了：通过使小鼠经口同时摄取高脂肪饮食与实施例1的类胡萝卜素混合物，发挥了抑制高脂肪饮食摄取后血糖值的上升的作用。
予以说明，“血糖值”是指血液中的葡萄糖浓度，是表示1dl血液中包含多少mg葡萄糖的值，相当于本试验中的血中葡萄糖值。
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