一种紫外杀菌增效剂及其联合紫外进行杀菌的方法
阅读说明：本技术 一种紫外杀菌增效剂及其联合紫外进行杀菌的方法 (Ultraviolet sterilization synergist and ultraviolet combined sterilization method thereof ) 是由 孙坚 何慧灵 崔泽华 刘雅红 廖晓萍 于 2020-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于紫外杀菌技术领域,公开了一种紫外杀菌增效剂及其联合紫外进行杀菌的方法。本研究基于A波段紫外线(UVA)和佛手柑精油杀菌效果微弱(单独作用时杀菌量在0.5log-1.5log),将其进行联合作用后具有明显的协同杀菌效果。本发明相较于传统的紫外杀菌技术,能够更高效地杀灭细菌并且减少紫外灯质量对于消毒效果的影响。(The invention belongs to the technical field of ultraviolet sterilization, and discloses an ultraviolet sterilization synergist and a method for sterilizing by combining ultraviolet sterilization synergist with ultraviolet. The research is based on that the Ultraviolet (UVA) of the A wave band and the bergamot essential oil have weak sterilization effect (the sterilization amount is 0.5log-1.5log when the bergamot essential oil acts alone), and the bergamot essential oil has obvious synergistic sterilization effect after combined action. Compared with the traditional ultraviolet sterilization technology, the ultraviolet sterilization device can kill bacteria more efficiently and reduce the influence of the quality of the ultraviolet lamp on the sterilization effect.)
技术领域
本发明涉及紫外杀菌技术领域，更具体地，涉及一种紫外杀菌增效剂及其联合紫外进行杀菌的方法。
背景技术
紫外线杀菌技术是一种无化学品残留，对环境影响小的方便的方法，常用于消毒气体，液体和固体表面。紫外线是一种电磁波谱中波长为400nm-10nm辐射的总称，不能引起人们的视觉。它是频率比蓝紫光高的不可见光，紫外线的分类有UVA、UVB、UVC和UVD。紫外灯杀菌由于其成本低、使用方便、不会产生耐药性等优点在各种场所都有使用。近年来，由于抗生素的大量使用，使得细菌耐药性越来越严重，伴随着多重耐药细菌的出现，导致在治疗病菌造成的感染时效果逐渐减弱，因此，研究非抗生素的杀菌技术在临床上应用越来越多，对紫外线杀菌效果的研究也越来越深入。
紫外杀菌技术的原理是利用适当波长的紫外线辐射，通过破坏生物体细胞内的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)分子结构，造成生长细胞和/或再生细胞死亡，达到杀菌的效果。紫外线杀菌技术是以现代防疫科学、医学、光动力学为基础，采用专门设计的高效、高强度、长寿命紫外线照射物体表面，直接杀灭物体表面的各种细菌、病毒、寄生虫、藻类等病原体。同时能够在不产生抗生素耐药性的情况下杀灭细菌，因此不会导致细的耐药性提高。不过，低能量的紫外本身不足以达到非常好的杀菌效果，杀菌时间长且不能完全杀灭细菌。
佛手柑精油是通过萃取和压榨佛手柑从果皮中提取的，佛手柑属于芸香科柑橘属，本身无毒无害，特点是清新淡雅，略带花香，是香水中最常使用的精油之一。其优势是容易获取，本身对细菌具有一定的抗菌作用。为了增强紫外杀菌效果，研究紫外线灭菌效果增效剂是必不可少的一步。但是目前报道的精油对紫外线杀菌增效作用仍然较少，亟需补充新的紫外杀菌增效剂，增加紫外线在多种场合下的杀菌效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供佛手柑精油作为紫外杀菌增效剂的应用。
本发明的第二个目的是提供一种利用佛手柑精油联合紫外进行杀菌的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
佛手柑精油作为紫外杀菌增效剂的应用。
本发明研究发现佛手柑精油与紫外联用，能够显著增强紫外杀菌能力，因此可以作为紫外杀菌的增效剂。
本发明还提供一种紫外杀菌增效剂，该杀菌增效剂包括佛手柑精油。
本发明还提供一种紫外联合佛手柑精油进行杀菌的方法，紫外的照射时间为30min，佛手柑精油的浓度为1％。
优选地，上述杀菌的方法中，紫外强度为2.4-3.0mW/cm2。
优选地，上述杀菌的方法中，进行紫外照射前需预热30min。
优选地，上述杀菌的方法包括以下步骤：
(1)将菌液与1％佛手柑精油进行混合置于六孔板中，设置紫外照射条件：波长范围300-460nm，功率18W，六孔板到紫外灯管的距离为8cm，紫外线强度为2.4-3.0mW/cm2；
(2)预热紫外箱20-40min，将六孔板放入紫外箱中照射25-35min。
更优选地，上述杀菌的方法步骤(1)中菌液的终浓度为106CFU/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种与紫外有了协同作用的增效剂，本研究基于A波段紫外线(UVA)和佛手柑精油杀菌效果微弱(单独作用时杀菌量在0.5log-1.5log)，将其进行联合作用后具有明显的协同杀菌效果。本发明相较于传统的紫外杀菌技术，能够更高效地杀灭细菌并且减少紫外灯质量对于消毒效果的影响。
附图说明
图1为实施例4对菌株的数量统计结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
所用的紫外灯为PHILIPS TL-D品牌；瓦数：18W；电压：220V；波长：(UVA)300-469nm；灯管管径：25mm；长度：60cm。所述佛手柑精油为Satya品牌(意大利)。
判定原则：如实验组降低的菌量在单独紫外处理和单独精油处理菌量下降的基础上再降低2个对数值，即表明精油与紫外具有协同杀菌作用。
实施例1不同紫外照射时间对ATCC 25922菌株的杀菌效果
1、实验材料：
(1)试验用紫外灯为PHILIPS TL-D品牌；瓦数：18W；电压：220V；波长：(UVA)300-469nm；灯管管径：25mm；长度：60cm。
(2)试验用培养基：将经高压灭菌的MH琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基(购买自广东环凯微生物科技有限公司)冷却至40℃，用移液枪取20mL至无菌培养皿中，自然晾干30min，制得MH琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基。
大肠杆菌标准菌株ATCC25922(实验室保藏)。
2、试验前的准备工作：
(1)将紫外线灯开启并持续照射30分钟预热；
(2)将大肠杆菌标准菌株ATCC25922于麦康凯培养基上，培养至合适大小。
3、紫外线杀菌效果评价实验：
(1)接种大肠杆菌ATCC 25922单菌落在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37度摇床中180转孵育4小时后取出离心管；
(2)将离心管放入离心机中，5000转离心8min后倒去上清液并加入等体积生理盐水重悬，并进行梯度稀释使最终菌量为106CFU/mL；
(3)将1mL菌液加入六孔板中；
(4)设置空白对照组和紫外照射处理组，其中紫外照处理组分为三组，分别照射15min、30min和60min。
(5)紫外照射结束后，吸取100μL菌液加入装有900μL 0.85％生理盐水的2mL离心管中进行梯度稀释，稀释后吸取25μL滴在MH琼脂培养基上，37度培养箱孵育16-18h，进行计数，实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。
结果如表1所示，随着照射时间的增加，紫外对细菌的抑菌效果增加，其中，紫外照射15min组中，细菌数量与空白对照组细菌数量区别不大，说明紫外照射时间短不能对ATCC25922产生明显的抑菌效果。紫外照射30min组中细菌数量开始下降，说明紫外开始对细菌有一定的抑菌效果。
表1紫外照射时间对ATCC 25922菌株的杀菌效果
实施例2测定不同浓度佛手柑精油对ATCC 25922菌株的MIC
1、实验材料：
(1)试验：将经高压灭菌的MH肉汤冷却备用。
(2)树脂天青：Macklin(麦克林)品牌，MW为251.17，纯度为90％；
大肠杆菌标准菌株ATCC25922(实验室保藏)。
2、试验前的准备工作：
(1)将佛手柑精油从冰箱取出并平衡至室温，吸取部分备用；
(2)将大肠杆菌标准菌株ATCC 25922于麦康凯琼脂培养基上，培养至合适大小。
(3)称取树脂天青粉末0.2512g在离心管中，加入10mL纯水进行溶解，树脂天青溶液浓度为10mM/L。
3、佛手柑精油杀菌效果评价实验：
(1)接种大肠杆菌ATCC 25922单菌落在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37度摇床中180转孵育4小时后取出离心管；
(2)使用MH肉汤将孵育后的大肠杆菌稀释到100倍，约为106CFU/mL，备用；
(3)取无菌96孔板，第1孔加180μL MH肉汤培养基，第2-11孔加入100μL MH肉汤培养基；
(4)在第1孔加入20μL原浓度精油，吹打均匀后，吸取100μL到第2孔，依次类推，第10孔吸取100μL弃去；
(5)第1到11孔加入稀释好的菌液100μL，第12孔加入200μL MH肉汤；
(6)重复步骤(3)到(5)，进行三次重复平行；
(7)将接种好的96孔板放入37度培养箱中孵育16-18h后，吸取10μL 10mM/L树脂天青加入孔中，树脂天青浓度为0.1mM/L，孵育2h后，读取结果。
结果如表2所示，佛手柑精油Mic值>1％，在低于Mic值的佛手柑精油浓度下，细菌没有被明显的抑制生长，出于对高浓度佛手柑精油使用成本高和实际应用时通常会被稀释到低浓度使用的考虑，最终选用1％佛手柑精油浓度作为紫外增效剂的使用浓度。
表2佛手柑精油对ATCC 25922菌株的MIC和实验选用浓度
实验菌株
佛手柑精油Mic
实验选用浓度
ATCC 25922
>1％
1％
实施例3佛手柑精油对ATCC 25922菌株作用30分钟后的杀菌效果：
1、实验材料：
(1)试验用培养基：将经高压灭菌的MH琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基(购买自广东环凯微生物科技有限公司)冷却至40℃，用移液枪取20mL至无菌培养皿中，自然晾干30min，制得MH琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基。
大肠杆菌标准菌株ATCC25922(实验室保藏)。
2、试验前的准备工作：
(1)将佛手柑精油从冰箱取出并平衡至室温，吸取部分备用；
(2)将大肠杆菌标准菌株ATCC 25922于麦康凯培养基上，培养至合适大小。
3、佛手柑精油杀菌效果评价实验：
(1)接种大肠杆菌ATCC 25922单菌落在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37度摇床中180转孵育4小时后取出离心管；
(2)将离心管放入离心机中，5000转离心8min后倒去上清液并加入等体积生理盐水重悬，并进行梯度稀释使最终菌量为106CFU/mL；
(3)将1mL菌液加入六孔板中，加入10μL原浓度佛手柑精油并混合均匀使精油终浓度为1％；
(4)设置对照，空白对照、1％佛手柑精油组处理30min；
(5)吸取100μL菌液加入装有900μL 0.85％生理盐水的2ml离心管中进行梯度稀释，稀释后吸取25μL滴在MH琼脂培养基上，37度培养箱孵育16-18h，进行计数，实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。
结果如表3所示，空白对照组细菌数量与佛手柑精油作用30min组细菌数量没有明显区分；说明1％佛手柑精油对ATCC 25922细菌处理30min之后没有发生细菌数量变化。表明1％佛手柑精油对ATCC 25922杀菌效果微弱，故最终选用1％浓度佛手柑精油与紫外联合使用30min作为最终条件。
表3佛手柑精油对ATCC 25922菌株的杀菌效果
实施例4紫外和紫外增效剂对大肠杆菌ATCC 25922的杀灭效果评价
1、实验材料：
(1)试验用紫外灯为PHILIPS TL-D品牌；瓦数：18W；电压：220V；波长：(UVA)300-469nm；灯管管径：25mm；长度：60cm。
(2)试验用培养基：将经高压灭菌的MH琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基(购买自广东环凯微生物科技有限公司)冷却至40℃，用移液枪取20mL至无菌培养皿中，自然晾干30min，制得MH琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基。
大肠杆菌标准菌株ATCC25922(实验室保藏)。
2、试验前的准备工作：
(1)将紫外线灯开启并持续照射30分钟预热；
(2)将佛手柑精油从冰箱取出并平衡至室温，吸取部分备用；
(3)将大肠杆菌标准菌株ATCC25922于麦康凯琼脂培养基上，培养至合适大小。
3、紫外线增效剂效果评价实验：
(1)接种大肠杆菌ATCC 25922单菌落在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37度摇床中180转孵育4小时后取出离心管；
(2)将离心管放入离心机中，5000转离心8min后倒去上清液并加入等体积生理盐水重悬，并进行梯度稀释使最终菌量为106CFU/mL；
(3)将1mL菌液加入六孔板中，加入10μL原浓度佛手柑精油并混合均匀；
(4)设置对照，空白对照、1％精油处理遮光后放入紫外照射箱，联合作用组和紫外照射处理组照射紫外30min；
(5)紫外照射结束后，吸取100μL菌液加入装有900μL 0.85％生理盐水的2ml离心管中进行梯度稀释，稀释后吸取25μL滴在MH琼脂培养基上，37度培养箱孵育16-18h，进行计数，实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。
在本实验中设置一个生长对照组，一个紫外对照组，一个精油对照组，一个紫外加精油测试组，按照实施例1的方法进行检测，结果如图1。
结果如表4和图1所示，空白对照组中细菌正常生长，说明该实验条件下大肠杆菌ATCC 25922能够正常生长；在紫外灯照射30min下，大肠杆菌ATCC 25922与空白对照组相比没有明显减少，说明紫外线对大肠杆菌ATCC 25922的抑制作用不明显；同样结果也显示了1％佛手柑精油对大肠杆菌ATCC 25922的抑制作用不明显；联合作用30min结果表明，紫外线和1％佛手柑精油的协同作用对大肠杆菌ATCC 25922的杀菌效果显著。
表4紫外和佛手柑精油联合对ATCC 25922菌株的杀菌效果
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
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