阅读说明：本技术 一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法 (Analysis method for diversity of intestinal flora in acute lung injury ) 是由 李志军 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法,涉及急性肺损伤肠道菌群多样性的分析技术领域,具体为一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法,包括以下步骤：S1、收集样本；S2、样本DNA抽提；S3、PCR扩增；S4、数据信息分析：S401、有效序列统计；S402、有效序列长度分布统计；S403、OUT聚类及物种信息标注；S404、多样性指数；S405、宏基因组测序分析。该急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法通过对急性肺损伤肠道菌群多样性能够有效的得到病患的详细具体数值,与标准数据值对比,能够有效的判断出病患肺部的详细情况,以及可开具详细表格备案,从而能够有效的根据病患肺部情况针对性治疗。(The invention discloses an analysis method of acute lung injury intestinal flora diversity, which relates to the technical field of analysis of acute lung injury intestinal flora diversity, in particular to an analysis method of acute lung injury intestinal flora diversity, and comprises the following steps: s1, collecting a sample; s2, extracting sample DNA; s3, PCR amplification; s4, analyzing data information: s401, counting effective sequences; s402, counting the length distribution of the effective sequences; s403, OUT clustering and species information labeling; s404, diversity index; s405, metagenome sequencing analysis. According to the analysis method for the diversity of the intestinal flora with acute lung injury, the detailed specific numerical values of the patient can be effectively obtained through the diversity of the intestinal flora with acute lung injury, the detailed conditions of the lung of the patient can be effectively judged by comparing the detailed numerical values with the standard data values, and a detailed table can be developed for record, so that the targeted treatment can be effectively carried out according to the lung conditions of the patient.)

一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法

技术领域

本发明涉及急性肺损伤肠道菌群多样性的分析技术领域，具体为一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法。

背景技术

急性肺损伤是各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。以肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调为病理生理特征，临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，肺部影像学上表现为非均一性的渗出性病变，其发展至严重阶段(氧合指数<200)被称为急性呼吸窘迫综合征。

肠道微生态环境中生存着细菌、真菌、病毒、原虫等100万亿的微生物，其中有100余种都为细菌，统称为肠道菌群。它们具有合成维生素、蛋白质、免疫激活、抗肿瘤以及解毒和清理肠道内环境的作用。一般情况下，肠道菌群与人体和外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作用，但是这种平衡在某些情况下，可被打破，形成肠道菌群失调，表现为肠道菌群在种类、数量、比例、定位和生物学特性上的变化。

现有的肠道菌群多样性的分析不具备针对性，容易产生数据误差，从而导致对病患急性肺损伤的判断精度下降的缺点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，解决了上述背景技术中提出现有的肠道菌群多样性的分析不具备针对性，容易产生数据误差，从而导致对病患急性肺损伤的判断精度下降的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，包括以下步骤：

S1、收集样本：将急性肺损伤病人的粪便排泄至干净的容器中，以及用棉签粘取少量放置入含有无菌生理盐水的试管内部，盖上盖子密封，将试管放置入医用冷柜内，冷藏24小时，使得菌群稳定，不发生改变；

S2、样本DNA抽提：将步骤S1、收集样本中的试管送达至样本提取处，提取DNA模板；

S3、PCR扩增：提取步骤S2、样本DNA抽提中细菌基因组DNA模板，PCR产物包含待测区域、测序引物、特异性引物、区分样本的Barcode和测序仪，利用特异性引物扩增16srDNA的V4区域，样本扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和特异性，应在相应片段大小位置出现一条清晰且明显的主条带，在其它位置不应有任何明显杂带，并进行精确定量和纯化回收，根据仪器的使用说明，进行标本的测序，产出数据。

S4、数据信息分析：

S401、有效序列统计；

S402、有效序列长度分布统计；

S403、OUT聚类及物种信息标注；

S404、多样性指数；

S405、宏基因组测序分析。

可选的，所述步骤S1、收集样本中，无菌生理盐水为80-100ml。

可选的，所述步骤S2、样本DNA抽提中，挑取单菌落到5-10mL盛有LB和MRS液体培养基的PA瓶中，在30℃条件下，活化3-4h，若培养液稍浑浊，则取1-2mL加入灭菌离心管中，以及12000r/min条件下离心1-3min，除去上清液，再加入1-2mLSTE悬浮菌体，重复上述步骤，12000r/min离心1-3min，除去上清液，以及向收集的菌体中加人100-240μLTE，沸水煮5-15min，立即冰浴5-15min，离心2-7min取上清液即为DNA模板，将基因组DNA放于-20℃，保存备用。

可选的，所述步骤S3、PCR扩增中，扩增子序列16rDNA分析流程:第一步，原始扩增子测序数据；第二步，数据质控和筛选；第三步，扩增子数据库对比；第四步，分别OUT分类、物种分布和系统发生树构建；第五步，将步骤第四步中OUT分类和物种分布进行生物种类和丰度估计；第六步，提取多样本，将样本间群落结构对比；第七步，微生物生物分布与环境关联分析。

可选的，所述步骤S404、多样性指数中，测得所有细菌种类、数量和比例，用于确定该样本人体菌群健康等级情况；将获得数据与标准数据库比对，确定该样本与健康人群、疾病人群的相似性，最终评估该样本受检者的健康情况，并进行后处理预估或者就医处理。

可选的，所述步骤S405、宏基因组测序分析中，通过宏基因组测序的方法，将肠道微生物与疾病进行关联分析以揭示疾病与健康个体间的微生物差异；鉴定特定环境中的特定微生物发现耐受菌种及相关基因；可以研究物种的分类，研究与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物群落内部、微生物与环境、微生物与宿主之间的关系。

本发明提供了一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，具备以下有益效果：

该急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，通过对急性肺损伤肠道菌群多样性能够有效的得到病患的详细具体数值，与标准数据值对比，能够有效的判断出病患肺部的详细情况，以及可开具详细表格备案，从而能够有效的根据病患肺部情况针对性治疗，以及判断治疗对于病患肺部的影响，而该病患肺部备案与每次出具的肺部数据表格对比，从而能够有效的判断病患肺部的恢复情况，能够有效的提高病患肺部的治疗的效果，同时能够开展会诊，能够有效的提高治疗成功率。

具体实施方式

下面，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明提供一种技术方案：一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，包括以下步骤：

S1、收集样本：将急性肺损伤病人的粪便排泄至干净的容器中，以及用棉签粘取少量放置入含有无菌生理盐水的试管内部，盖上盖子密封，将试管放置入医用冷柜内，冷藏24小时，使得菌群稳定，不发生改变；

S2、样本DNA抽提：将步骤S1、收集样本中的试管送达至样本提取处，提取DNA模板；

S3、PCR扩增：提取步骤S2、样本DNA抽提中细菌基因组DNA模板，PCR产物包含待测区域、测序引物、特异性引物、区分样本的Barcode和测序仪，利用特异性引物扩增16srDNA的V4区域，样本扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和特异性，应在相应片段大小位置出现一条清晰且明显的主条带，在其它位置不应有任何明显杂带，并进行精确定量和纯化回收，根据仪器的使用说明，进行标本的测序，产出数据。

S4、数据信息分析：

S401、有效序列统计；

S402、有效序列长度分布统计；

S403、OUT聚类及物种信息标注；

S404、多样性指数；

S405、宏基因组测序分析。

本分发明中：步骤S1、收集样本中，无菌生理盐水为80-100ml。

本分发明中：步骤S2、样本DNA抽提中，挑取单菌落到5-10mL盛有LB和MRS液体培养基的PA瓶中，在30℃条件下，活化3-4h，若培养液稍浑浊，则取1-2mL加入灭菌离心管中，以及12000r/min条件下离心1-3min，除去上清液，再加入1-2mLSTE悬浮菌体，重复上述步骤，12000r/min离心1-3min，除去上清液，以及向收集的菌体中加人100-240μLTE，沸水煮5-15min，立即冰浴5-15min，离心2-7min取上清液即为DNA模板，将基因组DNA放于-20℃，保存备用。

本分发明中：步骤S3、PCR扩增中，扩增子序列16rDNA分析流程:第一步，原始扩增子测序数据；第二步，数据质控和筛选；第三步，扩增子数据库对比；第四步，分别OUT分类、物种分布和系统发生树构建；第五步，将步骤第四步中OUT分类和物种分布进行生物种类和丰度估计；第六步，提取多样本，将样本间群落结构对比；第七步，微生物生物分布与环境关联分析。

本分发明中：步骤S404、多样性指数中，测得所有细菌种类、数量和比例，用于确定该样本人体菌群健康等级情况；将获得数据与标准数据库比对，确定该样本与健康人群、疾病人群的相似性，最终评估该样本受检者的健康情况，并进行后处理预估或者就医处理。

本分发明中：步骤S405、宏基因组测序分析中，通过宏基因组测序的方法，将肠道微生物与疾病进行关联分析以揭示疾病与健康个体间的微生物差异；鉴定特定环境中的特定微生物发现耐受菌种及相关基因；可以研究物种的分类，研究与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物群落内部、微生物与环境、微生物与宿主之间的关系。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。