具体实施方式

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在 B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的含量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间含量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的体积、核苷酸的数量、转速、时间可以是μL、mL、bp、kbp、rpm、s、min、h等基因工程技术领域公知的计量单位。

下面结合具体实施例，对本申请提供的IRES序列、IRES序列的应用以及多顺反子表达载体进行示例性的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请的方案，并不用于限定本申请。

本申请提供的IRES序列是基于SARS-Cov-2中的ORF8基因片段得到的。其中，SARS-Cov-2中的ORF8基因片段如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

5’-ATGAAATTTCTTGTTTTCTTAGGAATCATCACAACTGTAGCTGCAT TTCACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGTACTCAACATCAACCATATGTA GTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCTAAATGGTATATTAGAGT AGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAATTGTGCGTGGATGAGGCT GGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTATACAGTTTC CTGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAGTCTTG TAGTGCGTTGTTCGTTCTATGAAGACTTTTTAGAGTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAA-3’。

SARS-Cov-2也可以称为新型冠状病毒，是一种具有外膜的正链单股RNA 病毒。冠状病毒隶属于网巢病毒目冠状病毒科冠状病毒属，而冠状病毒属又可细分为4个属，分别为α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属。其中，SARS-Cov-2属于β冠状病毒属。SARS-Cov-2呈球形或椭圆形，病毒颗粒的直径一般在60～200nm之间，平均直径为100nm。SARS-Cov-2的遗传物质是目前为止所有RNA病毒中含量最大的。SARS-Cov-2可以感染人、鼠、猪、猫、犬和禽类脊椎动物，是目前发现的第7种可以感染人类的冠状病毒，具有高传播力、潜伏期长，突变率高等特点。

通过对SARS-Cov-2的ORF8基因片段的克隆和实验，可以确定ORF8基因片段具备IRES功能，即能够基于ORF8基因片段来获得IRES序列，并将该 IRES序列应用于目的基因的表达过程。

在本申请实施例中，IRES序列可以是ORF8基因片段原本的全长序列，即IRES序列如SEQ ID NO.1所示。也可以是ORF8基因片段经过延长、裁切、重组和/或突变之后得到的序列。

示例性的，在对ORF8基因片段进行裁切时，可以在ORF8基因片段末端裁切一部分区段的序列，进而得到IRES序列。

在对ORF8基因片段进行延长时，可以在ORF8基因片段末端拼接一部分序列。例如，可以通过ORF8基因片段在SARS-Cov-2中的上游区段和/或下游区段来延长ORF8基因片段，得到IRES序列。即IRES序列包括：ORF8基因片段，以及，ORF8基因片段在SARS-Cov-2中的上游区段和/或下游区段。

例如，如SEQ ID NO.2所示，本申请提供的IRES序列可以包括ORF8基因片段、120bp的上游区段和14bp的下游区段。

SEQ ID NO.2：

5’-ATTGACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCTATTCCTTGTTTT AATTATGCTTATTATCTTTTGGTTCTCACTTGAACTGCAAGATCATAATGA AACTTGTCACGCCTAAACGAACATGAAATTTCTTGTTTTCTTAGGAATCA TCACAACTGTAGCTGCATTTCACCAAGAATGTAGTTTACAGTCATGTACT CAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCT AAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAAT TGTGCGTGGATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATC GGTAATTATACAGTTTCCTGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCT AAATTGGGTAGTCTTGTAGTGCGTTGTTCGTTCTATGAAGACTTTTTAGA GTATCATGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACGAACAAACTAA A-3’。

值得说明的是，对ORF8基因片段裁切或者延长的长度，在能够保证ORF8 基因片段的IRES功能的情况下，可以基于实际需求进行设计，本申请不做限制。

可选的，除上述裁切和延长的改造方式外，还可以通过重组和/或突变的方式对ORF8基因片段进行改造，得到IRES序列。例如，以增强ORF8基因片段的IRES功能为目的，对ORF8基因片段进行重组和/或突变，得到得到IRES 序列。当然，在能够保证ORF8基因片段的IRES功能的情况下，对ORF8基因片段的重组和/或突变的具体方式也可以基于实际需求来设计，对此本申请不做限制。

可以理解的是，在对ORF8基因片段进行改造时，也可以先裁切或者延长该ORF8基因片段，在进行重组和/或突变。例如，对SEQ ID NO.2进行重组和 /或突变，得到IRES序列。

基于实际需求，本申请提供的IRES序列可以直接从SARS-Cov-2中分离得到，也可以人工合成。

本申请提供的IRES序列可以应用于目的基因的表达。基于该IRES序列，可以构建多顺反子表达载体，能够实现多目的基因的同步表达。

多顺反子表达载体是指能够同步表达两个或两个以上目的基因的载体。其中，包含两个目的基因的多顺反子表达载体通常也称为双顺反子表达载体。

本申请提供一种多顺反子表达载体，包括本申请提供的IRES序列，该IRES 序列位于该多顺反子表达载体中目的基因的起始密码子上游。

下面以双荧光蛋白表达载体为例，对本申请提供的多顺反子表达载体、多顺反子表达载体的构建以及IRES序列在目的基因表达上的应用进行示例性的说明。

如图1所示，为本申请提供的双荧光蛋白表达载体，包括人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein， GFP)、IRES序列和红色荧光蛋白(mCherry)和牛生长激素(Bovine growth hormone，BGH)加尾信号。其中，IRES序列位于GFP的终止密码子和mCherry 的起始密码子之间。GFP的终止密码子为TAA密码子，的起始密码子为ATG 密码子。

示例性的，假设本申请提供的IRES序列为SEQ ID NO.2所示序列，目的载体为以pcDNA3.1(+/-)载体为基础构建的pcDNA3.1-EGFP载体。该双荧光蛋白表达载体的构建过程可以如下：

步骤1，制备目的载体。

采用限制性核酸内切酶(Xba I)对pcDNA3.1-EGFP载体质粒进行单酶切，在37℃的环境下孵育3h。然后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收线性化的载体框架，得到目的载体。示例性的，该pcDNA3.1-EGFP在酶切前后的电泳图可以如图2中的(b)所示，酶切后得到的目的载体的大小约为6kb。

步骤2，制备目的片段。

目的片段包括IRES序列片段和目的基因mCherry片段。

其中，制备IRES序列片段时，以携带SEQ ID NO.2所示序列的质粒为模板进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增。PCR程序为：首先在95℃条件下预热30s。然后执行30个扩增循环，每个循环的反应条件是：先在95℃条件下将变性15s，然后在50℃条件下退火15s，最后在72℃条件下延伸1min。循环结束后，在72℃条件下延伸5min，得到IRES序列的扩增产物。 IRES序列的扩增产物的正向引物和反向引物的5’端增加有pcDNA3.1-EGFP载体和下游mCherry片段的同源序列，得到IRES序列片段。示例性的，IRES序列片段的电泳图可以如图2中的(a)所示，IRES序列片段的大小约为541bp。

制备mCherry片段时，以携带mCherry基因的质粒为模板进行PCR扩增。 PCR程序为：首先在95℃条件下预热30s。然后执行33个扩增循环，每个循环的反应条件是：先在95℃条件下将变性15s，然后在50℃条件下退火15s，最后在72℃条件下延伸1min。循环结束后，在72℃条件下延伸5min，得到mCherry 的扩增产物。mCherry的扩增产物的反向引物的5’端增加有pcDNA3.1-EGFP 载体的同源序列，得到mCherry片段。示例性的，mCherry片段的电泳图可以如图2中的(a)所示，mCherry片段的大小约为732bp。

步骤3，目的片段和目的载体的连接。

在一个示例中，采用诺唯赞生物科技的重组试剂盒(货号：C115)将目的片段和目的载体在50℃的条件下孵育15min，进行同源重组连接，得到同源重组产物。然后将同源重组产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞上。转化步骤可以如下所示：

S1，冰上解冻50μL的DH5α感受态细胞。

S2，在解冻后的DH5α感受态细胞加入5μL的同源重组产物，混匀后得到混合产物。

S3，将混合产物冰浴30min，然后在42℃条件下热激90s。热激结束后再冰浴5min。然后加入1mL无抗LB(Luria-Bertani)培养基，在37℃，220rpm 的条件下复苏培养1h，得到复苏培养物。培养期间，将含有抗生素的LB平板放置室温条件下备用。

S4，取200μL的复苏培养物涂于含有抗生素的LB平板上，在37℃条件下倒置培养约12h。然后从培养出来的菌落中挑选样本进行测序，获得测序结果正确的克隆序列。其中，挑选出来的样本可以基于实验需要选择送往基因测序公司，由基因测序公司来验证培养的克隆序列的正确性。

步骤4，制备质粒，获得双荧光蛋白表达载体。

获得正确的克隆序列后，可以采用无内毒素的质粒提取试剂盒进行质粒制备，得到含有IRES序列的双荧光蛋白表达载体。例如，可以选择美基生物低内毒素质粒小体中量试剂盒(货号：P1112-02)制备质粒，具体操作可以按照该试剂盒的说明书进行。

值得说明的是，在上述构建双荧光蛋白表达载体的过程中，所使用的目的载体、内切酶、重组试剂盒以及质粒提取试剂盒均为示例性的列举方案。目前市面上可供选择的产品较多，具体可以基于实际实验需求进行选择，对此，本申请不做限制。

构建得到双荧光蛋白表达载体后，即可进一步对双荧光蛋白表达载体的基因表达功能进行验证。

在一个实施例中，可以设置三个实验组，包括空白对照组(Mock)、阴性对照组(Vector)和阳性对照组(IRES)。

其中，空白对照组(Mock)为未转染表达载体的对照组，阴性对照组为转染了无IRES序列的双荧光蛋白表达载体的对照组，阳性对照组为转染了含有 IRES序列的双荧光蛋白表达载体(即上述本申请提供的双荧光蛋白表达载体) 实验组。

其中，无IRES序列的双荧光蛋白表达载体可以如图3所示，包括GFP、 IRES序列、mCherry和BGH加尾信号。其中，GFP的终止密码子和mCherry 的起始密码子之间没有插入IRES序列。无IRES序列的双荧光蛋白表达载体在构过程中无需制备IRES序列片段，且在制备mCherry片段时，需在mCherry 的扩增产物的反向引物和正向引物的5’端均增加目的载体的同源序列，便于 mCherry片段与目的载体进行同源重组连接。其余过程与含有IRES序列的双荧光蛋白表达载体过程类似。

在进行功能验证时，首先需要对阴性对照组和阳性对照组进行细胞转染，以使得GFP和mCherry的表达可通过荧光现象被观测到。在对表达载体进行进行细胞转染的过程中，首先选择合适的孔板、培养瓶或者培养皿提前24h接种细胞。例如，选择12孔的HEK-293T细胞铺板。当接合率到达约80％时进行细胞转染。

示例性的，可以使用电转化进行细胞转染，也可以采用商业化转染试剂进行细胞转染。例如，电转化可以采用Celetrix电转仪，商业化转染试剂可以选择碧云天的Lipo8000^TM试剂(货号：C0533FT)，或者赛默飞世尔的Lipofectamine 3000试剂(货号：L3000015)等。如果采用商业化转染试剂进行细胞转染，试剂用量可以参考商业化转染试剂的说明书中描述的针对12孔板的试剂用量进行。

对阴性对照组和阳性对照组进行细胞转染后，经过48小时即可进行荧光观察。如图4所示，正常情况下，空白对照组中由于没有转染包含GFP和mCherry 的载体，因此，空白对照组中无法观测到绿色荧光和红色荧光。

阴性对照组中，由于GFP与CMV启动子连接，CMV启动子提供的3’UTR 会引导核糖体进入启动翻译，从而使得GFP表达，可以观测到绿色荧光。之后核糖体翻译到GFP的终止密码子，并脱离mRNA，使得GFP的下游基因mCherry 无法翻译，进而无法观测到红色荧光。那么，正常情况下，阴性对照组中GFP 和mCherry的表达结果叠加(merged)后，最终可以观测到绿色荧光。

阳性对照组中，由于GFP的终止密码子与mCherry的起始密码子之间存在 IRES序列，即使核糖体经过GFP的终止密码子后脱离mRNA，IRES序列也能在再次招募核糖体进入IRES序列的下游基因mCherry，并启动翻译，从而使得 mCherry表达，可以观测到红色荧光。那么，正常情况下，阳性对照组中GFP 和mCherry的表达结果叠加(merged)后，最终可以观测到绿色荧光和红色荧光的混合光。

经过观测，显微镜标尺在50μm的情况下，三组实验组的荧光表达情况如图4中merged列所示，均为正常显示结果，即如下表1所示的实验结果：

表1

经过实验验证，本申请提供的IRES序列具备高效的非帽子结构依赖性的起始翻译能力，能够应用于目的基因的表达过程，并提高目的基因的表达效率。

此外，由于该IRES序列是基于SARS-Cov-2中的ORF8基因片段得到的，因此，该IRES序列还可以作为药物靶点来筛选抗SARS-Cov-2的药物。比如，采用如图1所示的双荧光蛋白表达载体，将其转染细胞后加入待筛选的药物分子，然后分析红色荧光强度与绿色荧光强度的比值，即可快速了解相应药物分子对IRES功能的抑制作用。该IRES在SARS-Cov-2中至少在病毒入侵初期负责核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)的翻译，而核衣壳蛋白是SARS-Cov-2的核心结构蛋白之一。通过这种方式有望筛选到有效的IRES抑制剂，其通过抑制SARS-Cov-2的核衣壳蛋白的翻译进而抑制SARS-Cov-2的功能。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> IRES序列、IRES序列的应用和多顺反子表达载体

<120> 中国科学院深圳先进技术研究院

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> SARS-Cov-2

<400> 1

atgaaatttc ttgttttctt aggaatcatc acaactgtag ctgcatttca ccaagaatgt 60

agtttacagt catgtactca acatcaacca tatgtagttg atgacccgtg tcctattcac 120

ttctattcta aatggtatat tagagtagga gctagaaaat cagcaccttt aattgaattg 180

tgcgtggatg aggctggttc taaatcaccc attcagtaca tcgatatcgg taattataca 240

gtttcctgtt taccttttac aattaattgc caggaaccta aattgggtag tcttgtagtg 300

cgttgttcgt tctatgaaga ctttttagag tatcatgacg ttcgtgttgt tttagatttc 360

atctaa 366

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> SARS-Cov-2

<400> 2

attgacttct atttgtgctt tttagccttt ctgctattcc ttgttttaat tatgcttatt 60

atcttttggt tctcacttga actgcaagat cataatgaaa cttgtcacgc ctaaacgaac 120

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tgcgtggatg aggctggttc taaatcaccc attcagtaca tcgatatcgg taattataca 360

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cgttgttcgt tctatgaaga ctttttagag tatcatgacg ttcgtgttgt tttagatttc 480

atctaaacga acaaactaaa 500