一种yh66_10325基因改造的产l-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用

文档序号：842703 发布日期：2021-04-02 浏览：19次 >En<

阅读说明：本技术 一种yh66_10325基因改造的产l-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用 (YH66_10325 gene modified recombinant strain producing L-isoleucine and construction method and application thereof ) 是由郭小炜赵春光孟刚魏爱英杨立鹏田斌马风勇周晓群苏厚波于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于YH66-10325基因的产L-异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。本发明通过对YH66-10325基因的敲除,发现该基因编码的产物对L-异亮氨酸生产能力产生影响,通过在编码序列引入点突变,或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株,所述点突变是使YH66-10325基因序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A),使编码的相应氨基酸序列第309位丙氨酸变为苏氨酸。所获得的菌株与未改造的菌株相比,有利于生产高浓度的L-异亮氨酸。(The invention discloses a YH66_10325 gene-based recombinant strain for producing L-isoleucine, and a construction method and application thereof. The present invention discovers that the product coded by the gene has influence on the L-isoleucine production capacity by knocking out the YH66_10325 gene, and obtains a recombinant strain by introducing a point mutation into the coding sequence, or increasing the copy number or overexpression of the gene, wherein the point mutation is that the 925 th base of the YH66_10325 gene sequence is mutated from guanine (G) to adenine (A), and the 309 th alanine of the coded corresponding amino acid sequence is changed into threonine. The obtained strain is advantageous for producing L-isoleucine at a high concentration as compared with an unmodified strain.)

一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。L-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，L-异亮氨酸的产量还不高，高产菌株的选育成为L-异亮氨酸产量提高的重要环节。

生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，因此大多数研究者倾向于研究谷氨酸棒杆菌及其亚种，如谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等。优良菌种的选育依然是高产L-异亮氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L-异亮氨酸突变株。

虽然已筛选到一些可以提高L-异亮氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L-异亮氨酸的突变株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。为了实现上述目的，本发明的发明人研究发现，具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)中YH66_10325基因(GenBank：AKF27920.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L-异亮氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-异亮氨酸能力更强。

本发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码 SEQID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因YH66_10325编码的蛋白。

所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-异亮氨酸生产能力。

在本发明中，术语“具有L-异亮氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-异亮氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-异亮氨酸的细菌。具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-异亮氨酸的细菌。

术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。

在本发明中，除非另有说明，术语“L-异亮氨酸”是指游离形式的L-异亮氨酸、其盐或其混合物。

所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。

可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。

可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。

在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。

在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。

在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。

在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。

在本发明的一个

具体实施方式

中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第309位丙氨酸被不同的氨基酸所取代。

根据本发明，优选第309位丙氨酸变为苏氨酸所取代。

根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第309位丙氨酸变为苏氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第925位碱基发生突变而形成的。

根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。

在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、 T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(YH66_10325)的启动子。

如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。

在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。

如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。

根据本发明，所述细菌可以是属于棒杆菌属的微生物，例如嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等。

在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌ATCC15168。

在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YPILE001,已于2020年08月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏机构简称： CGMCC，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。

根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述序列的第309位丙氨酸被不同的氨基酸所取代。

根据本发明，优选第309位丙氨酸变为苏氨酸所取代。。

根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第309位丙氨酸变为苏氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

根据本发明，优选所述编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第925位碱基发生突变而形成的。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用PCR定点突变法和/或同源重组。

根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第925位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

根据本发明，所述氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。

在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pK18mobsacB质粒。

在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pXMJ19质粒。

具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过NEBuider重组系统构建成重组载体。

根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为ATCC 15168。

本发明的第三个方面，提供上述多核苷酸序列、由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列、包括所述多核苷酸序列的重组载体、含有所述多核苷酸序列的重组菌株在生产L- 异亮氨酸中的应用。

本发明的第四个方面，还提供一种生成L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。

根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：

改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型YH66_10325基因的多核苷酸序列，使其第925位碱基发生突变，得到包含突变YH66_10325编码基因的重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第925位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述包含突变YH66_10325编码基因的多核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型YH66_10325基因的核苷酸序列，使其第925位碱基发生突变，得到突变的YH66_10325基因多核苷酸序列；

(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变YH66_10325编码基因的重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的YH66_10325基因构建：根据未修饰菌株的基因组序列，合成两对扩增YH66_10325基因片段的引物P1和P2及P3和 P4，通过PCR定点突变法在野生型YH66_10325基因SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的YH66_10325基因核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为YH66_10325^G925A。

在本发明的一个实施方式中，所述未修饰菌株基因组可以来源于ATCC15168菌株，其基因组序列GenBank：CP011309.1可以从NCBI网站获取。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCTGAAGGCAGCT CAATGC 3'(SEQID NO:5)

P2:5'GGTGGCTTCTCCTTCGAAGGCACATCTCCTCGTCAC 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'GTGACGAGGAGATGTGCCTTCGAAGGAGAAGCCACC 3'(SEQ ID NO: 7)

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTCTGTAGATG ACGTGATC 3'(SEQID NO:8)

在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min， 94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的YH66_10325^G925A和pK18mobsacB质粒，通过NEBuider重组系统组装，获得重组质粒。

根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒转化至宿主菌株，得到重组菌株。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 15168。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株为谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。

本发明的第五个方面，还提供一种生成L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。

根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：

扩增YH66_10325的上下游同源臂片段、YH66_10325基因编码区及其启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入YH66_10325或YH66_10325^G925A基因，以实现所述菌株过表达YH66_10325或YH66_10325^G925A基因。

在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTGTGTGCCAGG ATGTCGGC 3'(SEQID NO:11)

P8:5'CATCAAAGGAACTGTTCTAATTAATAGGTGGGCGCGAGC 3'(SEQ ID NO:12)

在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：

P11:5'GATGCGGTTCTGGCTCATGGAGTATGGTGGCCTTAC 3'(SEQ ID NO: 15)

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACCACGCCG TCAAGGTAATC 3'(SEQ ID NO:16)

在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：

P9:5'GCTCGCGCCCACCTATTAATTAGAACAGTTCCTTTGATG 3'(SEQ ID NO:13)

P10:5'GTAAGGCCACCATACTCCATGAGCCAGAACCGCATC 3'(SEQ ID N O:14)

在本发明的一个实施方式中，再以前述P7/P12为引物，以扩增的上游同源臂片段、下游同源臂片段、基因编码区及其启动子区序列片段的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。

在本发明的一个实施方式中，所采用的PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10μM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、 72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒PK18mobsacB和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。

在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入YH66_10325或YH66_10325^G925A基因。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 15168。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。

本发明的第六个方面，还提供一种生产L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。

根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：

扩增YH66_10325基因编码区及启动子区序列，或YH66_10325^G925A基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达YH66_10325或YH66_10325^G925A基因。

在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTAGAACAGTTC CTTTGATG 3'(SEQ ID NO:21)

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACATGAGCCAGAACC GCATC 3'(SEQ IDNO:22)。

在本发明的一个实施方式中，所述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各 2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10μM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒pXMJ19和带有自身启动子的YH66_10325或YH66_10325^G925A片段组装，获得过表达质粒。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 15168。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。

本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产L-异亮氨酸中，也可以和其他产L-异亮氨酸的细菌混合发酵生产L-异亮氨酸。

本发明的另一个方面提供了生产L-异亮氨酸的方法，该方法包括培养所述细菌；并且从培养物中获得L-异亮氨酸。

可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行细菌的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-异亮氨酸，即用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。

本发明的有益效果

本发明通过对YH66_10325基因的敲除，发现该基因编码的产物对L-异亮氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L-异亮氨酸。

生物保藏说明

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏机构简称：CGMCC，保藏日期为2020年08月17日，生物保藏编号为CGMCC No. 20437，菌株命名：YPILE001。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等，基础培养基组成如下：

表1固体培养基的组成

成分	配方
		葡萄糖	5g/L
多聚蛋白胨	10g/L
		牛肉膏	10g/L
酵母粉	5g/L
		氯化钠	55g/L
琼脂粉	20g/L
		pH(NaOH调节)	7.0
培养条件	31℃

实施例1构建包含点突变的YH66_10325基因编码区的转化载体pK18-YH66_10325^G925A

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，设计并合成两对扩增YH66_10325基因(GenBank：AKF27920.1)编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株ATCC15168和由ATCC15168右边获得的高产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，YH66_10325基因的核苷酸序列第925位鸟嘌呤 (G)变为腺嘌呤(A)(SEQ IDNO：2：YH66_10325^G925A)，对应编码蛋白的氨基酸序列第309位丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)(SEQID NO：4：YH66_10325^A309T)。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCTGAAGGCAGC TCAATGC 3'(SEQID NO:5)

P2:5'GGTGGCTTCTCCTTCGAAGGCACATCTCCTCGTCAC 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'GTGACGAGGAGATGTGCCTTCGAAGGAGAAGCCACC 3'(SEQ ID NO: 7)

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTCTGTAGATG ACGTGATC 3'(SEQID NO:8)

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。

PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM) 4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别约770bp和848bp，含有YH 66_10325基因编码区的DNA片段(YH66_10325^G925A-Up和YH66_10325^G925A-Down)。

将YH66_10325^G925A-Up和YH66_10325^G925A-Down经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后；再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增出长约1628bp的 YH66_10325^G925A-Up-Down片段。

PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μ L，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

此DNA片段导致ATCC15168的诱变菌株谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中YH66_10325基因编码区的第925位的鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤 (A)，最终导致编码蛋白的第309位氨基酸由丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)。

将pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用XbaI酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化 YH66_10325^G925A-Up-Down和线性化的pK18mobsacB质粒，再通过NEBuider重组系统组装，获得载体pK18-YH66_10325^G925A，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体p K18-YH66_10325^G925A送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(C-T)的载体pK18-YH66 _10325^G925A保存备用。

实施例2构建包含点突变的YH66_10325^G925A的工程菌株

构建方法：将等位替换质粒pK18-YH66_10325^G925A通过电击转化入高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中；对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出大小约1628bp条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养；对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P5:5'TGCGATCTGGGAATGCAG 3'(SEQ ID NO:9)

P6:5'CGCATCGATGCCATCAAC 3'(SEQ ID NO:10)

上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒 pK18-YH66_10325^G925A扩增片段为阳性对照，ATCC15168扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过比对碱基序列确定是否替换成功；并将来自高产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)替换成功的突变株命名为YPI013。

表2 sscp电泳的PAGE的制备

实施例3构建基因组上过表达YH66_10325或YH66_10325^G925A基因的工程菌株

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及YH66_10325基因编码区及启动子区序列的引物，以同源重组的方式在菌株谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No. 20437)中引入YH66_10325或YH66_10325^G925A基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTGTGTGCCAGGA TGTCGGC3'

P8:5'CATCAAAGGAACTGTTCTAATTAATAGGTGGGCGCGAGC3'

P9:5'GCTCGCGCCCACCTATTAATTAGAACAGTTCCTTTGATG3'

P10:5'GTAAGGCCACCATACTCCATGAGCCAGAACCGCATC 3'

P11:5'GATGCGGTTCTGGCTCATGGAGTATGGTGGCCTTAC3'

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACCACGCCG TCAAGGTAATC 3'

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC15168或YPI013为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10， P11/P12，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段约864bp，YH66_10325或YH66_10325^G925A基因片段约1232bp及下游同源臂片段约785bp，再以P7/P12为引物，用以上扩增的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的约2881bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB相连接，获得整合质粒 pk18mobsacB-YH66_10325或pk18mobsacB-YH66_10325^G925A，质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将2个整合质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1056bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。阳性菌株经15％蔗糖筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小约845bp的菌为YH66_10325或YH66_10325^G925A基因整合到菌株谷氨酸棒杆菌 YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)基因组上的菌株，其被命名为YPI-014 (不含突变点)和YPI-015(含突变点)。

P13:5'GATTGATCCGGTGAACGCC 3'

P14:5'GGCCCTGAGAACGTCATTG 3'

P15:5'TTGATGTTTGCATCAAGTAG 3'

P16:5'TTGTGAGGTTTGCGTGCCAAG 3'

实施例4构建质粒上过表达YH66_10325或YH66_10325^G925A基因的工程菌株

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，设计并合成一对扩增YH66_10325基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTAGAACAGTTC CTTTGATG 3'

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACATGAGCCAGAACCG CATC 3'

构建方法：以ATCC15168或YPI013为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得YH66_10325或YH66_10325^G925A基因片段约1278bp，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1278bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经EcoRI酶切、回收的穿梭质粒pXMJ19相连接，获得过表达质粒 pXMJ19-YH66_10325或pXMJ19-YH66_10325^G925A。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。

PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对培养产生的单菌落通过M13R(-48)和P18引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约920bp的片段的为转入菌株，其被命名为YPI-016(不含点突变)和YPI-017(含点突变)。

实施例5构建基因组上缺失YH66_10325基因的工程菌株

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，合成两对扩增YH66_10325基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：

P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAACTCCTTGCTAA GGATGG 3'

P20:5'CTTTTAGATTGGATTTTCAGCTAGACAACGAGGGTTGCTAG 3'

P21:5'CTAGCAACCCTCGTTGTCTAGCTGAAAATCCAATCTAAAAG 3'

P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAGCGAGAAAT GCTGGGTCTG 3'

以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P19/P20及P21/P22，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段868bp及下游同源臂片段780bp。再用引物P19/P22进行OVER PCR 得到整个同源臂片段1648bp。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式 DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1648bp的DNA片段，并通过NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。

将敲除质粒电转化入谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行PCR鉴定：

P23:5'GCGCTGACTATGCAGATTC 3'

P24:5'AAACTCGACC TTCACGTC 3'

上述PCR扩增出大小约1648bp及约2819bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2819bp条带的菌株为出发菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1648bp条带的菌株为YH66_10325基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPI-018。

实施例6L-异亮氨酸发酵实验

将实施例2-5构建的菌株和原始谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCCNo.20437)在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3 所示的培养基和表4所示发酵控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

表3发酵培养基配方

表4发酵控制工艺

表5 L-异亮氨酸发酵实验结果

结果如表5所示，在产异亮氨酸的工程菌谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对YH66_10325基因编码区进行点突变YH66_10325^G925A都有助于L-异亮氨酸产量的提高；过表达YH66_10325、YH66_10325^G925A有助提高L-异亮氨酸的产量，而对YH66_10325基因敲除，不利于L-异亮氨酸的积累。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> 一种YH66_10325基因改造的产L-异亮氨酸重组菌株及其构建方法与应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

atgagccaga accgcatcag gaccactcac gttggttcct tgccccgtac cccagagcta 60

cttgatgcaa acatcaagcg ttctaacggt gagattgggg aggaggaatt cttccagatt 120

ctgcagtctt ctgtagatga cgtgatcaag cgccaggttg acctgggtat cgacatcctt 180

aacgagggcg aatacggcca cgtcacctcc ggtgcagttg acttcggtgc atggtggaac 240

tactccttca cccgcctggg cggactgacc atgaccgata ccgaccgttg ggcaagccag 300

gaagcagtgc gttccacccc tggcaacatc aagctgacca gcttctctga tcgtcgcgac 360

cgcgcattgt tcagcgaagc atacgaggat ccagtatctg gcatcttcac cggccgcgct 420

tctgtgggca acccagagtt caccggacct attacctaca ttggccagga agaaactcag 480

acggatgttg atctgctgaa gaagggcatg aacgcagcgg gagctaccga cggcttcgtt 540

gcagcactat ccccaggatc tgcagctcga ttgaccaaca agttctacga cactgatgaa 600

gaagtcgtcg cagcatgtgc cgatgcgctt tcccaggaat acaagatcat caccgatgca 660

ggtctgaccg ttcagctcga cgcaccggac ttggcagaag catgggatca gatcaaccca 720

gagccaagcg tgaaggatta cttggactgg atcggtacac gcatcgatgc catcaacagt 780

gcagtgaagg gccttccaaa ggaacagacc cgcctgcaca tctgctgggg ctcttggcac 840

ggaccacacg tcactgacat cccattcggt gacatcattg gtgagatcct gcgcgcagag 900

gtcggtggct tctccttcga aggcgcatct cctcgtcacg cacacgagtg gcgtgtatgg 960

gaagaaaaca agcttcctga aggatctgtt atctaccctg gtgttgtgtc tcactccatc 1020

aacgctgtgg agcacccacg cctggttgct gatcgtatcg ttcagttcgc caagcttgtt 1080

ggccctgaga acgtcattgc gtccactgac tgtggtctgg gcggacgtct gcattcccag 1140

atcgcatggg caaagctgga gtccctagta gagggcgctc gcattgcatc aaaggaactg 1200

ttctaa 1206

<210> 2

<211> 1206

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 2