具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种用于提高透明质酸产量的遗传重组质粒，所述遗传重组质粒是将glnA基因插入基因表达载体pSET4S::repA::Ppgk即pLH275的多克隆位点处，构建成功pSET4S::repA::Ppgk::GlnA即pLH860；

其中，所述基因表达载体pSET4S::repA::Ppgk的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

较优地，所述glnA基因的长度为1382bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，该glnA基因始于起始密码子ATG上游15bp，结束于终止密码子TAA下游20bp。

较优地，所述glnA基因来源于兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920基因组。

一种含有如上所述的用于提高透明质酸产量的遗传重组质粒的工程菌。

较优地，所述工程菌的构建方法为：

将用于提高透明质酸产量的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920。

较优地，所述转入为电转入。

一种利用如上所述的工程菌在提高透明质酸产量方面中的应用。

较优地，所述应用为在以蔗糖为底物发酵生产透明质酸方面的应用。

一种利用如上所述的工程菌高产透明质酸的方法，使用所述工程菌发酵获得。

较优地，步骤如下：取工程菌的发酵培养基，按接种量2-8％向发酵培养基中接入工程菌，37℃，pH 7.0，转速150-300r/min，通气量1.2-1.5vvm，发酵16-24小时，即得透明质酸；

其中，所述工程菌的发酵培养基为：蔗糖：30-50g/L，酵母提取物：2-3.5g/L，酪蛋白胨：8-10g/L，NaCl：1-1.5g/L，K₂HPO₄：2-7g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.6g/L。

更具体地，步骤如下：

摇瓶发酵：

从-80℃冰箱取出菌种，在THY固体培养基上划线，37℃，转速200r/min，培养12h，挑取长出的单菌落接种到装有4mL THY液体培养基的试管中，37℃，转速200r/min，培养12h，将菌液以1％接种量，接种到装有50mL THY液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃，转速200r/min，培养12h，将菌液以1-4％的接种量，接种到装有100mL FSB发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，pH 7.0，转速150-200r/min，发酵24h，即得HA；

其中，所述FSB发酵培养基为：蔗糖：30-50g/L，酵母提取物：2-3.5g/L，酪蛋白胨：8-10g/L，NaCl：1-1.5g/L，K₂HPO₄：2-7g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.6g/L。

发酵罐发酵：

从-80℃冰箱取出菌种，在THY固体培养基上划线，37℃，转速200r/min，培养12h，挑取长出的单菌落接种到装有4mL THY液体培养基的试管中，37℃，转速200r/min，培养12h，将菌液以4％的接种量接种到含有100mL TSB种子培养基的500mL锥形瓶中，37℃，转速200r/min，培养12h，将种子液以2-8％的接种量，接种到装有1.2LFSB发酵培养基的2L发酵罐中，37℃，pH 7.0，转速150-300r/min，通气量1.2-1.5vvm，发酵16-24h，即得HA。

其中所述的THY培养基为：牛肉浸粉：10.0g/L，胰蛋白胨：20.0g/L，葡萄糖：2.0g/L，酵母浸出物：2.0g/L，NaHCO₃：2.0g/L，NaCl：2.0g/L，Na₂HPO₄：0.4g/L。

TSB种子培养基为：大豆蛋白胨：3.0g/L，胰蛋白胨：17.0g/L，无水葡萄糖：2.5g/L，NaCl：5.0g/L，K₂HPO₄：2.5g/L。

发酵培养基为：蔗糖：30-50g/L，酵母提取物：2-3.5g/L，酪蛋白胨：8-10g/L，NaCl：1-1.5g/L，K₂HPO₄：2-7g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.6g/L。

具体地，相关制备及检测如下：

以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920基因组为模板，将基因glnA克隆至载体pSET4S::repA::Ppgk(pLH275)上，并经过菌落PCR(图2)EcoRI/BamHI双酶切(图3)和测序验证后，成功构建了glnA过表达载体pSET4S::repA::Ppgk::GlnA(图1)。将表达载体电转至宿主菌兽疫链球菌ATCC 39920出发菌菌株中，成功获得过表达菌株glnA/OP。经过对上述菌株进行摇瓶发酵和上罐发酵分析。

摇瓶发酵生产HA的方法是：将WT、glnA/OP菌株分别接种到FSB液体培养基中，经发酵培养，前16h每隔2h取样一次，隔天在24h取样一次，发酵结束。经样品处理和分析得到其HA产量。所述的发酵培养条件为温度为37℃，培养时间24h，pH值为7.0以及转速200r/min。

摇瓶发酵过程中，菌株glnA/OP与出发菌WT的生长情况无明显区别，菌株glnA/OP与菌在4个小时左右进入对数生长期，6小时左右对数生长期结束，8个小时到达平稳期，菌体生长变慢(图4)。摇瓶发酵12小时时，菌株glnA/OP的HA产量为0.44g/L，相较出发菌WT产量提高了12.82％；摇瓶发酵24小时，菌株glnA/OP的HA产量为0.48g/L，较出发菌提高了9.09％(图5)。

上罐发酵生产HA的方法是：将WT、glnA/OP菌株分别接种到FSB液体培养基中，经发酵培养，发酵开始12小时内每2小时收集一次发酵液，12小时之后每4小时收集一次发酵液，在发酵至16小时时补加30g蔗糖，经样品处理和分析得到其HA产量和蔗糖残余量，所述的发酵培养条件为温度为37℃，培养时间24h，pH值为7.0以及转速200r/min。

如图6所示，上罐发酵过程中，菌株glnA/OP与出发菌的生长情况并无明显区别，菌株glnA/OP与出发菌前4个小时生长缓慢，在4个小时左右进入对数生长期，8个小时左右对数生长期结束，10个小时左右到达平稳期，菌体生长缓慢，16个小时后菌体生长进入衰退期，菌体生物量减少，在24小时发酵结束。

如图7所示，菌株glnA/OP的HA产量明显高于出发菌，发酵进行到10小时时出发菌HA产量为1.3g/L，菌株glnA/OP的HA产量为2.2g/L，较出发菌高70％；12小时时，出发菌HA产量为1.76g/L，菌株glnA/OP的HA产量为1.97g/L，较出发菌高10％；发酵16小时时，出发菌HA产量为2.26g/L，较出发菌HA产量为2.75g/L，较出发菌高21％；发酵进行到20小时时，由于添加了30g蔗糖，出发菌与菌株glnA/OP的HA产量均有提升，出发菌HA产量为2.71g/L，菌株glnA/OP HA产量为3.64g/L，较出发菌高34％，发酵进行到24小时时，出发菌HA产量为3.31g/L，菌株glnA/OP HA产量为3.55g/L，较出发菌高7.2％。

如图8所示，发酵培养基中初始蔗糖浓度为50g/L，菌株glnA/OP在相同时间内对蔗糖的消耗速度比出发菌快，且在4个小时后蔗糖的消耗加快，到16小时出发菌发酵培养基中蔗糖剩余8.58g/L，菌株glnA/OP发酵培养基中蔗糖剩余仅为4.71g/L，此时向发酵培养基中加入30g蔗糖，16小时到20小时之间菌株glnA/OP比出发菌对蔗糖的消耗的更多，而20小时后，出发菌消耗蔗糖减慢，而菌株glnA/OP几乎不消耗蔗糖，发酵结束。

更为具体的实施细节如下：

一、glnA表达载体构建

以兽疫链球菌ATCC39920基因组为模板，在glnA基因起始密码子ATG上游15bp处设计上游引物glnA-F，在终止密码子TAA下游20bp处设计下游引物glnA-R，扩增glnA基因。

PCR反应体系为：5×PS Buffer 10μL，dNTP(2mM)4μL，上游引物和下游引物(10μM)各2μL，模板0.5μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(Takaru，R010A)0.5μL，加无菌水至终体积为50μL。

PCR反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min,反应30个循环，70℃后延伸10min。

用上述PCR体系扩增获得完整glnA基因核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQID NO.1所示。

表1.所用引物序列

将扩增获得的glnA基因片段回收后与经EcoRI/BamHI切酶处理过的质粒片段pSET4S::repA::Ppgk(pLH275)进行连接，pSET4S::repA::Ppgk(pLH275)的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示序列。

将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有壮观霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，如图2、图3所示。并经测序比对正确，获得基因表达载体pSET4S::repA::Ppgk::GlnA(pLH860)如图1。

其中，LB培养基为：胰蛋白陈：10.0g/L，酵母浸出物：5.0g/L，NaCl：10.0g/L，去离子水溶解后，定容至1.0L,pH调至7.0～7.2，固体培养基加1.5％的琼脂粉。121℃灭菌20min。

二、重组菌株glnA/OP的构建

2.1兽疫链球菌感受态的制备。

(1)从-80℃取出保藏的菌株甘油管，在THY固体平板上进行三区划线，置于37℃培养箱中培养12-24h，至出现清晰单菌落。

(2)挑取单菌落接入装有50mL THY(含0.5mol/Lsucrose，2％glycine)液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养12～14h。

(3)按2％的接种量将其接入新鲜的l00mL的THY的液体培养基中，37℃，200r/min继续培养至OD₅₃₀大约为0.38左右，加入透明质酸酶(12.5kU/l00mL)(上海生工生物工程有限公司，37326-33-3)继续培养30min。置于冰上冰浴5min。

(4)于无菌操作台将冰浴的三角瓶中的菌液分装至灭过菌的50mL离心管中，8000r/min，4℃，离心10min。

(5)弃上清，加入20mL冰浴的0.5M的蔗糖溶液重悬菌体，8000r/min，4℃离心10min。

(6)弃上清，加入500μL含质量浓度为15％的甘油的0.5M的蔗糖溶液，重悬菌体，分装至无菌的1.5mL的EP管中，每管50μL，放置-80℃冰箱中保藏。

2.2.兽疫链球菌的电转化和基因表达菌株的筛选。

(1)用清水将电转杯稍冲一下。

(2)向电转杯中加入75％酒精浸泡2h。

(3)弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用lmL的枪吸取超纯水反复吹打电转杯10遍以上。

(4)加入无水乙醇2mL于电转杯中，浸泡30min。

(5)弃去无水乙醇，于通风厨内吹干乙醇。

(6)将清洗好的电转杯放入-20℃冰箱内待用。

(7)-20℃取出电转杯置于冰上。

(8)从-80℃冰箱取出感受态置于冰上。待其溶化后加入5μL质粒，枪头吹打混匀后沿电转杯的壁加入电转杯，重新放回冰上。

(9)2500V(2mm电转杯)电转后将950μL复苏液加入电转杯中，吹打混匀，然后吸出置于离心管中。

(10)200r/min,37℃下复苏2h。

(11)涂板：8000r/min离心3min后，吸出900μL，将剩余的100μL混匀涂布于带有壮观霉素抗性的THY板。

(12)37℃下培养48h，可见长出转化子。将转化子在带有壮观霉素(100μg/mL)抗性的THY板上进行抗性点板验证，得到基因过表达菌株glnA/OP。

其中，THY培养基为：牛肉浸粉10.0g/L，胰蛋白胨：20.0g/L，葡萄糖：2.0g/L，酵母浸出物：2.0g/L，NaHCO₃:2.0g/L，NaCl:2.0g/L，Na₂HP0₄:0.4g/L，去离子水溶解后，定容至1.0L，pH调至6.8，固体培养基加1.5％的琼脂粉，121℃灭菌20min。

三、glnA表达菌株的代谢产物分析

3.1glnA表达菌株的发酵

(1)glnA表达菌株的摇瓶发酵

将WT、glnA菌株分别在500mL的摇瓶装液l00mL进行摇瓶发酵培养。所用发酵培养基为蔗糖：30-50g/L，酵母提取物：2-3.5g/L，酪蛋白胨：8-10g/L，NaCl：1-1.5g/L，K₂HPO₄：2-7g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.6g/L。发酵条件：500mL锥形瓶，装液量100mL，接种量1％，37℃，pH7.0，转速200r/min，发酵24h，前16h每隔2h取样一次，隔天在24h取样一次，发酵结束。

(2)glnA表达菌株的发酵罐发酵

将WT、glnA分别在装液量为1.2L的2L发酵罐中进行发酵培养。所用发酵培养基：蔗糖：30-50g/L，酵母提取物：2-3.5g/L，酪蛋白胨：8-10g/L，NaCl：1-1.5g/L，K₂HPO₄：2-7g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.6g/L。发酵条件：2L发酵罐，装液量1.2L，接种量2-8％，37℃，Ph7.0，转速150-300r/min，通气量1.2-1.5vvm，发酵16-24h，前12h每隔2h取样一次，后12/6h每4h取样一次，且发酵至16h时补加30g蔗糖。

3.2HA产量检测，

具体步骤如下：

(1)发酵液预处理。准确量取30mL发酵液，加入等体积的0.1％SDS，充分混匀，室温放置l0min。将样品在4℃，12,000r/min条件下离心15min，将50mL上清转移至一洁净的离心管中，去除菌体，加入3倍体积的无水乙醇充分混匀，4℃沉淀lh。4℃，12,000r/min离心15min，上清置于另一离心管中保存待测蔗糖残余量。沉淀用无水乙醇洗涤一遍，然后置于4℃，12,000r/min离心15min，上清倒掉，将沉淀室温晾干。准确量取50mL ddH₂0，加入试管中使沉淀充分溶解，溶解后的样品经梯度稀释到浓度为0.lg/L以下后用于HA含量的检测。

(2)透明质酸标准品的配制。用电子天平精确称取葡萄糖醛酸10mg，使用ddH₂O定容至10ml，加水溶解后定容至刻度。用lmL移液枪精确量取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别加入10mL容量瓶中，加水稀释后定容至刻度，配制成浓度为10、20、30、40和50μg/mL的对照品溶液，4℃保存备用。

(3)样品检测。将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)2.5g事先溶于100mL的2％NaOH中备用。准确吸取50μL的透明质酸标准溶液和50μL的样品溶液分别置于装有50μL0.1M的磷酸盐缓冲液(pH＝7)的96孔板中，在酶标仪中设定37℃并孵育15min，培养结束后，每个样品中加入100μL已被2％氢氧化钠溶解的CTAB溶液，37℃再次孵育10min。在培养开始和结束时，将平板摇动10s，在600nm处读取数值。制作透明质酸标准液的标准曲线，并将样品溶液数据对应于标准曲线计算数值，作图分析。

3.3蔗糖残余量检测骤如下：

(1)将上述提取HA过程中保存的上清样品，梯度稀释到蔗糖糖浓度小于250mg/L。

(2)吸取待测样品溶液0.9mL(蔗糖含量应为40-250mg/L)，0.lmL2mol/L氢氧化纳，然后在100℃沸水浴中加热10min，立即在流水中冷却。再加入间苯二酚溶液1mL以及10mol/L盐酸3mL，摇匀后置于80℃水浴中加热8min，冷却后在OD₅₀₀波长处，以空白调零，测定样品的吸光度，与标准样作对照，计算样品中蔗糖含量。

综上所述，通过克隆兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920基因组中glnA基因片段，并构建在兽疫链球菌ATCC39920内稳定存在的表达载体pSET4S::repA::Ppgk::GlnA(pLH860)，将构建成功的表达载体电转至兽疫链球菌ATCC39920菌株中得到HA高产菌株glnA/OP。

上述构建得到的菌株，在摇瓶发酵和上罐发酵过程中，HA产量均明显高于出发菌。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

SEQ ID NO.1glnA基因：

SEQ ID NO.2pSET4S::repA::Ppgk载体：

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种提高透明质酸产量的方法及菌株

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1382

<212> DNA/RNA

<213> glnA基因(Unknown)

<400> 1

gctgagtgag ttttgttttt ctaatagtta tgtaagtaat tatcaatctc ccattgcgaa 60

acaaaggtcg cataggagga ccattcaatc cgtttggcct ctaaaaagtt ggtgtaaata 120

tggtcaccta aagccttttg aataacctcg tccttttgaa gagcctttag agcattatgg 180

agtgttgatg gcaaatcaac aataccagca gcattgcgct cctctgctgt catcatgtaa 240

atgttggcct caatcggtgc tggtgcctca atgcgattaa tgattccatc taagcctgcc 300

tctagtaaaa ctgcaagtgc taaataagga ttggctgttg gatcaaccga gcgcaattct 360

aaacgagtcc ccacaccacg agaagcagga acacgaataa gaggtgaacg attgcttcct 420

gcccaggcaa cataaacagg agcctcatag ccaggaacca agcgcttgta agaattaact 480

gttggatttg taatagcggt gtaattgtaa gcatgcttca tcaacccacc taagaaataa 540

taggcatcat ctgatagctt catgccacgc ttatcatttt catcgtaaaa ggcattgttg 600

ccctccttgt caaacaagga catgttacag tgcatacctg agccggcaat accaaatttc 660

ggctttgcca taaaggtggc gtagagcccg tgctcacgag caattgtctt gacgacaagc 720

ttaaagatct gaatattatc acaggccttc aaggcatctg catatttaaa gtcaatttca 780

tgctgaccga cagctacctc atggtggctg gcttcgacct caaagcccat ttttgtcaag 840

acattaacaa tttcacgacg ggtattgtct gccagatcaa tcggagcgag gtcaaaatag 900

cctcccttgt cattgacctc aagcgttggc tctccagctt catctatctt aaacaagaaa 960

aattctggct ctggaccaag gttaaaggac tgatagccaa cctcatccat atgcttcaag 1020

gctcttttta ggttgccacg tgggtcacca gcaaagggct tgccttcagc agtgtaaata 1080

tcacaaatca agccaccaac agctccattt tcatctcccc aaggaaagac gatccaagtg 1140

tctaaatcag gatagagata catatctgat tcattgatac gcacaaagcc ttcaatcgag 1200

gagccatcaa acatgacctt attagataag actttatcta attgctcttc agttgcaggt 1260

atctcaacat ttttcataac acccataatg tccgtaaaca tcaaccgaag aaaggtcaca 1320

tgcttttctt tgacctcgcg acgaacatca gctgctgtga ttgccattaa tcaatctcct 1380

tt 1382

<210> 2

<211> 4721

<212> DNA/RNA

<213> 基因表达载体pSET4S::repA::Ppgk(Unknown)

<400> 2

actagttatc ggcataatcg ttaaaacagg cgttatcgta gcgtaaaagc ccttgagcgt 60

agcgtggctt tgcagcgaag atgttgtctg ttagattatg aaagccgatg actgaatgaa 120

ataataagcg cagcgccctt ctatttcggt tggaggaggc tcaagggagt atgagggaat 180

gaaattccct catgggtttg attttaaaaa ttgcttgcaa ttttgccgag cggtagcgct 240

ggaaaatttt tgaaaaaaat ttggaatttg gaaaaaaatg gggggaaagg aagcgaattt 300

tgcttccgta ctacgacccc ccattaagtg ccgagtgcca atttttgtgc caaaaacgct 360

ctatcccaac tggctcaagg gtttaagggg tttttcaatc gccaacgaat cgccaacgtt 420

ttcgccaacg ttttttataa atctatattt aagtagcttt attgttgttt ttatgattac 480

aaagtgatac actaacttta taaaattatt tgattggagt tttttaaatg gtgatttcag 540

aatcgaaaaa aagagttatg atttctctga caaaagagca agataaaaaa ttaacagata 600

tggcgaaaca aaaaggtttt tcaaaatctg cggttgcggc gttagctata gaagaatatg 660

caagaaagga atcagaacaa aaaaaataag cgaaagctcg cgtttttaga aggatacgag 720

ttttcgctac ttgtttttga taaggtaatt atatcatggc tattaaaaat actaaagcta 780

gaaattttgg atttttatta tatcctgact caattcctaa tgattggaaa gaaaaattag 840

agagtttggg cgtatctatg gctgtcagtc ctttacacga tatggacgaa aaaaaagata 900

aagatacatg gaatagtagt gatgttatac gaaatggaaa gcactataaa aaaccacact 960

atcacgttat atatattgca cgaaatcctg taacaataga aagcgttagg aacaagatta 1020

agcgaaaatt ggggaatagt tcagttgctc atgttgagat acttgattat atcaaaggtt 1080

catatgaata tttgactcat gaatcaaagg acgctattgc taagaataaa catatatacg 1140

acaaaaaaga tattttgaac attaatgatt ttgatattga ccgctatata acacttgatg 1200

aaagccaaaa aagagaattg aagaatttac ttttagatat agtggatgac tataatttgg 1260

taaatacaaa agatttaatg gcttttattc gccttagggg agcggagttt ggaattttaa 1320

atacgaatga tgtaaaagat attgtttcaa caaactctag cgcctttaga ttatggtttg 1380

agggcaatta tcagtgtgga tatagagcaa gttatgcaaa ggttcttgat gctgaaacgg 1440

gggaaataaa atgacaaaca aagaaaaaga gttatttgct gaaaatgagg aattaaaaaa 1500

agaaattaag gacttaaaag agcgtattga aagatacaga gaaatggaag ttgaattaag 1560

tacaacaata gatttattga gaggagggat tattgaataa ataaaagccc cctgacgaaa 1620

gtcgaagggg gtttttattt tggtttgatg ttgcgattaa tagatctcgg tgatgacggt 1680

gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc 1740

gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt 1800

aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg 1860

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 1920

tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 1980

tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 2040

acgacggcca gtgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctcgagagt 2100

caatttagcc atttcataga ctccttaata ttttttagta cactctatta taacacaatt 2160

cttttgataa ggataaaatc tgaaaacaat aaattaacta tttcacaatt tttcaaagcg 2220

cttgaaaaat cccttgaata accccctttt cagcagatca tgatcaccta agtaggcagg 2280

aagccacaac atagtcatga catcacgcaa atgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca 2340

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 2400

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 2460

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 2520

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 2580

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 2640

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 2700

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<210> 3

<211> 38

<212> DNA/RNA

<213> 引物glnA-F(Unknown)

<400> 3

gtcgactcta gaggatccaa aggagattga ttaatggc 38

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<212> DNA/RNA

<213> 引物glnA-R(Unknown)

<400> 4

acgacggcca gtgaattcgc tgagtgagtt ttgtttttc 39