一种植物育性相关蛋白及其应用
阅读说明：本技术 一种植物育性相关蛋白及其应用 (Plant fertility-related protein and application thereof ) 是由 蒋炳军 孙�石 陈莉 韩天富 岳岩磊 侯文胜 刘路平 袁珊 武婷婷 于 2020-01-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种植物育性相关蛋白及其应用。本发明保护通过降低或抑制目的植物中GmMS1蛋白的活性和/或含量得到雄性不育植物的方法。本发明还保护通过沉默或抑制目的植物中GmMS1基因的表达或敲除GmMS1基因得到雄性不育植物的方法。本发明对于植物育性研究及不育植物的育种有重要意义。(The invention discloses a plant fertility-related protein and application thereof. The present invention protects a method for obtaining male sterile plants by reducing or inhibiting the activity and/or content of the GmMS1 protein in a target plant. The invention also provides a method for obtaining male sterile plants by silencing or inhibiting the expression of the GmMS1 gene or knocking out the GmMS1 gene in target plants. The invention has important significance for plant fertility research and sterile plant breeding.)
技术领域
本发明涉及大豆分子遗传育种领域，具体涉及一种植物育性相关蛋白及其应用。
背景技术
大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国，大豆是四大粮食作物之一，对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。
大豆是典型的短日照作物，单个品种的适种范围大都在1-1.5个纬度之间，不同纬度地区间引种会因日照长度的变化导致开花时间、成熟期提前或延迟，造成产量下降甚至颗粒无收。同时，我国地域范围大，生态类型多，育种水平不均衡，迫切需要加强优异种质资源的交流应用，提升大豆育种的整体水平，提高我国大豆单产水平。
大豆是典型自花授粉作物，花朵小、去雄难，不利于传统的人工杂交工作的开展。这严重限制了大豆种质资源的挖掘利用，严重限制了优异基因位点的聚合利用。基于大豆雄性不育突变体的大豆轮回群体选择技术，可以有效拓宽大豆种质资源的遗传基础，具有广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物育性相关蛋白及其应用。
第一方面，本发明保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：降低或抑制目的植物中GmMS1蛋白的活性和/或含量，得到雄性不育植物；
所述GmMS1蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)：
(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)来源于大豆且与(A1)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；
(A3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
第二方面，本发明保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：沉默或抑制目的植物中GmMS1基因的表达或敲除GmMS1基因，得到雄性不育植物：
所述GmMS1基因是如下任一所述的DNA分子：
(B1)序列表的序列2所示的DNA分子；
(B2)序列表的序列7所示的DNA分子；
(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(B4)与(B1)或(B2)或(B3)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述沉默或抑制目的植物中GmMS1基因的表达或敲除GmMS1基因，为突变目的植物中GmMS1基因使目的植物中GmMS1基因表达量降低或使目的植物中GmMS1基因发生功能缺失。
所述使目的植物中GmMS1基因表达量降低或使目的植物中GmMS1基因发生功能缺失是通过使目的植物中GmMS1基因发生突变；所述突变为缺失突变和/或插入突变和/或能够导致基因功能缺失的其他突变。
所述使目的植物基因组中GmMS1基因表达量降低或使目的植物基因组中GmMS1基因发生功能缺失是通过基因编辑技术实现的。
在本发明的实施例中，所述使目的植物基因组中GmMS1基因表达量降低或使目的植物基因组中GmMS1基因发生功能缺失是利用CRISPR/Cas9使目的植物中GmMS1基因发生如下(A)或(B)所述突变：
(A)序列表的序列2自5’端第51位碱基和52位碱基之间插入碱基A；
(B)序列表的序列7自5’端第749位碱基和750位碱基之间插入碱基A。
所述CRISPR/Cas9的靶序列如序列表的序列6所示。
所述利用CRISPR/Cas9使目的植物中GmMS1基因发生如下(A)或(B)所述突变包括如下步骤：将靶向所述靶序列的CRISPR/Cas9敲除载体导入目的植物中，得到转基因植物。所述CRISPR/Cas9载体具体可为将引物二聚体插入Cas9/gRNA载体得到的重组载体；所述引物二聚体是将F2(5’-TTGCGCCGAGGTCTAAGATACAG-3’)和引物R2(5’-AACCTGTATCTTAGACCTCGGCG-3’)退火形成的。
将靶向所述靶序列的CRISPR/Cas9敲除载体导入目的植物，具体可为：通过农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
在本发明的实施例中，所述使目的植物基因组中GmMS1基因表达量降低或使目的植物基因组中GmMS1基因发生功能缺失是利用CRISPR/Cas9使目的植物中GmMS1基因发生如下(C)或(D)所述突变：
(C)序列表的序列2发生自5’端第18位碱基至23位碱基的缺失突变；
(D)序列表的序列7发生自5’端第716位碱基至721位碱基的缺失突变。
所述CRISPR/Cas9的靶序列如序列表的序列4所示。
所述利用CRISPR/Cas9使目的植物中GmMS1基因发生如下(C)或(D)所述突变包括如下步骤：将靶向所述靶序列的CRISPR/Cas9敲除载体导入目的植物中，得到转基因植物。所述CRISPR/Cas9载体具体可为将引物二聚体插入Cas9/gRNA载体得到的重组载体；所述引物二聚体是将F1(5’-TTGGACGGGAACACCTGTGGCGG-3’)和引物R1(5’-AACCCGCCACAGGTGTTCCCGTC-3’)退火形成的。
将靶向所述靶序列的CRISPR/Cas9敲除载体导入目的植物，具体可为：通过农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
第三方面，本发明保护GhBZR3蛋白或其相关生物材料在调控植物育性中的应用；
所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种：
(1)GhBZR3蛋白的编码基因；
(2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质；
(3)用于降低或抑制目的植物中GmMS1蛋白的活性和/或含量的物质；
所述GmMS1蛋白如前文所述。
所述GhBZR3蛋白的编码基因(GmMS1基因)如前文所述。
所述“用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质”或“用于降低或抑制目的植物中GmMS1蛋白的活性和/或含量的物质”具体可为CRISPR/Cas9敲除载体或含有所述载体的重组菌；所述CRISPR/Cas9敲除载体的靶序列如序列表的序列4或序列6所示。所述CRISPR/Cas9载体具体可为将引物二聚体插入Cas9/gRNA载体得到的重组载体；所述引物二聚体是将F2(5’-TTGCGCCGAGGTCTAAGATACAG-3’)和引物R2(5’-AACCTGTATCTTAGACCTCGGCG-3’)退火形成的。所述CRISPR/Cas9载体具体可为将引物二聚体插入Cas9/gRNA载体得到的重组载体；所述引物二聚体是将F1(5’-TTGGACGGGAACACCTGTGGCGG-3’)和引物R1(5’-AACCCGCCACAGGTGTTCCCGTC-3’)退火形成的。
第四方面，本发明还保护(C1)或(C2)在植物育种中的应用；
(C1)前文任一所述方法；
(C2)前文任一所述的GhBZR3蛋白或其相关生物材料。
所述育种的目的可为培育雄性不育植物。
以上任一所述植物为(D1)或(D2)或(D3)：
(D1)双子叶植物或单子叶植物；
(D2)豆科植物；
(D3)大豆。
所述大豆具体可为大豆品种Jack。
上述任一所述方法培育得到的雄性不育植物也属于本发明的保护范围。
本发明对于植物育性研究及不育植物的育种有重要意义。
附图说明
图1为GmMS1基因编辑的测序检测结果。
图2为GmMS1基因编辑植株的不育表型。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
发芽培养基：3.1g/L B5培养基基础盐(Gamborgs Basal Salt Mixture，Phytotech G768)，20g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(Gamborgs Vitamin Solution，Phytotech G219)，7g/L琼脂，pH 5.8。
共培养液体培养基：2.0g/L MS基础盐混合物(Murashige&Skoog Basal SaltMixture)，3.9g/L吗啉乙磺酸(MES)，30g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(GamborgsVitamin Solution，Phytotech G219)，150mg/L二硫苏糖醇，40mg/L乙酰丁香酮，2mg/L玉米素，pH 5.4。
共培养培养基：2.0g/L MS基础盐混合物(Murashige&Skoog BasalSaltMixture)，3.9g/L吗啉乙磺酸，30g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(GamborgsVitamin Solution，Phytotech G219)，150mg/L二硫苏糖醇，40mg/L乙酰丁香酮，2mg/L玉米素，7g/L琼脂，pH 5.4。
恢复培养基：3.1g/L B5培养基基础盐(Gamborgs Basal Salt Mixture，Phytotech G768)，0.98g/L吗啉乙磺酸，30g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(GamborgsVitamin Solution，Phytotech G219)，150mg/L头孢噻肟(cefotaxime)，450mg/L特美汀(timentin)，1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，7g/L琼脂，pH 5.7。
筛选培养基：3.1g/L B5培养基基础盐(Gamborgs Basal Salt Mixture，Phytotech G768)，0.98g/L吗啉乙磺酸，30g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(GamborgsVitamin Solution，Phytotech G219)，150mg/L头孢噻肟，450mg/L特美汀，1mg/L6-苄氨基嘌呤，7g/L琼脂，6mg/L草丁膦(glufosinate)，pH 5.7。
伸长培养基：4.0g/L MS基础盐混合物(Murashige&Skoog Basal Salt Mixture)，0.6g/L吗啉乙磺酸，30g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(Gamborgs VitaminSolution，Phytotech G219)，150mg/L头孢噻肟，450mg/L特美汀，0.1mg/L吲哚乙酸(3-Indoleacetic acid)，0.5mg/L赤霉素(Gibberellic acid)，1mg/L玉米素，7g/L琼脂，6mg/L草丁膦，pH 5.6。
生根培养基：2.0g/L MS基础盐混合物(Murashige&Skoog Basal SaltMixture)，0.6g/L吗啉乙磺酸，20g/L蔗糖，1ml/L B5培养基维生素溶液(Gamborgs VitaminSolution，Phytotech G219)，7g/L琼脂，3mg/L草丁膦，pH 5.7。
大豆品种Jack的种子：参考文献：Wei Liu,Bingjun Jiang,Liming Ma,ShouweiZhang,Hong Zhai,Xin Xu,Wensheng Hou,Zhengjun Xia,Cunxiang Wu,Shi Sun,TingtingWu,Li Chen,Tianfu Han,Functional diversification ofFlowering Locus T homologsin soybean:GmFT1a and GmFT2a/5a have opposite roles in controlling floweringand maturation,New Phytologist,2018,217(3):1335-1345.；国家种质库保存号：WDD01579，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
实施例1、大豆雄性核不育基因GmMS1的获得
对大豆基因组进行测序和功能分析，发现一个大豆雄性核不育基因，将其命名为GmMS1基因，其CDS如序列表的序列2所示，基因组序列如序列表的序列7所示。所述GmMS1基因编码的蛋白质命名为GmMS1蛋白，如序列表的序列1所示。
实施例2、GmMS1基因在调控大豆育性中的应用
一、Crisper/CAS9基因编辑载体的构建
1、gRNA靶点设计与合成
设计两个靶点序列，分别为
靶点1：GACGGGAACACCTGTGGCGGTGG；
靶点2：CGCCGAGGTCTAAGATACAGAGG。
靶点1和靶点2中，下划线为PAM序列。
根据靶点序列分别设计两对引物：
靶点1引物：
F1:5’-TTGGACGGGAACACCTGTGGCGG-3’；
R1:5’-AACCCGCCACAGGTGTTCCCGTC-3’。
靶点2引物：
F2:5’-TTGCGCCGAGGTCTAAGATACAG-3’；
R2:5’-AACCTGTATCTTAGACCTCGGCG-3’。
2、引物二聚体的形成
将引物F1和引物R1分别稀释成10μM，配置反应体系：F15μl、R15μl、H2O 15μl。混匀后95℃反应3min，然后自然冷却至25℃，然后16℃，5min，得到引物二聚体1。
将引物F2和引物R2分别稀释成10μM，配置反应体系：F25μl、R25μl、H2O 15μl。混匀后95℃反应3min，然后自然冷却至25℃，然后16℃，5min，得到引物二聚体2。
3、取步骤2得到的引物二聚体1配置反应体系：Cas9/gRNA载体1μl、引物二聚体11μl、Solution11μl、Solution21μl、H2O 6μl。16℃反应2小时。
上述载体和试剂来自北京唯尚立德生物科技有限公司，货号VK005-15。
反应结束，得到重组载体CRISPR/Cas9-GmMS1-1，重组载体CRISPR/Cas9-GmMS1-1中含有序列表的序列3所示的的DNA分子(已经测序验证)，表达sgRNA。sgRNA的靶序列为序列4。
4、取步骤2得到的引物二聚体2配置反应体系：Cas9/gRNA载体1μl、引物二聚体21μl、Solution11μl、Solution21μl、H2O 6μl。16℃反应2小时。
上述载体和试剂来自北京唯尚立德生物科技有限公司，货号VK005-15。
反应结束，得到重组载体CRISPR/Cas9-GmMS1-2，重组表达重组载体CRISPR/Cas9-GmMS1-2中含有序列表的序列5所示的DNA分子，表达sgRNA(已经测序验证)。sgRNA的靶序列为序列6。
二、重组农杆菌的制备
将步骤3和步骤4构建的重组载体CRISPR/Cas9-GmMS1-1和重组载体CRISPR/Cas9-GmMS1-2分别导入导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌GmMS1-1和重组农杆菌GmMS1-2。
三、基因编辑大豆的获得
取步骤二得到的重组农杆菌，采用根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化方法转化大豆，具体转化方法如下：
(1)选取大小均匀一致、无病斑、无裂纹，表面光滑、无褶皱的饱满大豆品种Jack的种子，将其装入玻璃培养皿中。然后放入干燥器内，敞开培养皿。在干燥器中放入一个玻璃烧杯，先加入100mL次氯酸钠，再向烧杯中滴入4mL的浓盐酸。凡士林涂于干燥器盖的四周后盖上干燥器，形成密封状态。然后将干燥器置于通风橱中，种子消毒16-20h。
(2)完成步骤(1)后，将灭菌的种子下胚轴垂直向上接入发芽培养基中，培养皿不封口，放在25℃，16h光照/18小时黑暗的组培间培养1d。
(3)完成步骤(2)后，以萌发的大豆种子的子叶节为外植体。首先剥去大豆种皮，纵切分离两片子叶，在子叶与胚轴交接部位(子叶节)划成条状伤口，将划伤的外植体放入含重组农杆菌重悬液的共培养液体培养基(菌液OD值为0.6—0.8)中，28℃浸染30min，侵染后，将外植体(子叶)内平面向下接种于表面铺有滤纸的共培养培养基中，25℃、16h光照/18小时黑暗条件下培养5天。
(4)完成步骤(3)后，将外植体转入恢复培养基中，25℃、16h光照/18小时黑暗条件下培养7d。
(5)完成步骤(4)后，切除外植体产生的主芽，将其转入筛选培养基中，25℃、16h光照/18小时黑暗条件下培养21d。
(6)完成步骤(5)后，剥去褐化的叶片，将产生的不定芽转入伸长培养基中，进行伸长。15d继代一次，继代2-3次。期间将产生的伸长苗转入生根培养基中，进行生根。
(7)完成步骤(6)，待根长出，将苗子从培养基中取出，移栽到装有基质的小盆中进行炼苗。炼苗1周后，转入大盆生长，获得T0代植株。
(8)对T0代植株进行检测，检测方法如下：
分别提取转基因植株和野生型植株基因组DNA，以此为模板，用检测引物进行PCR扩增。
F-614:CGCCATAGTGAAGTAGCGGA；
R-614:CAGTTGAAAACAAACTTACCGAAGG。
PCR反应条件：先95℃预变性5min；然后95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，35个循环；再72℃延伸10min。将PCR产物送去测序，筛选基因编辑植株。
测序结果显示，重组农杆菌GmMS1-1转化大豆后，共得到60株T0代植株，在T1后代中得到1株为在GmMS1基因中发生突变且为纯合型突变的植株，与野生型相比，纯合突变植株的差异在于：存在6bp的缺失，该缺失位于序列2的第18位和第23位之间(GGCGGT)。重组农杆菌GmMS1-2转化大豆后，共得到56株T0代植株，在T1后代中得到5株为在GmMS1基因中发生突变且为纯合型突变的植株，与野生型相比，纯合突变植株的差异在于：存在一个核苷酸的差异(即发生了一个插入突变且为纯合型，该插入位于序列2的第51位和52位之间，插入的单碱基为A，测序结果见图1)，该核苷酸的差异引起移码，从而不能有效表达GmMS1蛋白(图1)。
四、大豆育性检测
待测植株：野生型植株、5株纯合型突变植株(转入重组农杆菌GmMS1-2得到的插入突变植株)。
室外自然条件下，盆栽种植待测植株。
结果如图2所示。结果显示，野生型对照植株结荚正常，籽粒饱满，而GmMS1基因编辑移码突变的纯合植株为雄性不育植株，不能正常结荚。这些结果说明对GmMS1基因进行编辑可以导致雄性不育。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种植物育性相关蛋白及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 950
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)
<400> 1
Met Thr Gly Thr Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Thr Pro Arg Ser Lys
1 5 10 15
Ile Gln Arg Asn Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gly Pro Lys Val Arg Glu
20 25 30
Glu Lys Ile Arg Val Thr Val Arg Met Arg Pro Leu Asn Thr Lys Glu
35 40 45
Gln Ala Met Tyr Asp Leu Ile Ala Trp Asp Cys Leu Asp Glu His Thr
50 55 60
Ile Val Phe Lys Asn Pro Asn Gln Glu Arg Pro Thr Thr Pro Tyr Thr
65 70 75 80
Phe Asp Lys Val Phe Ala Pro Thr Cys Ser Thr His Lys Val Tyr Glu
85 90 95
Glu Gly Ala Lys Asp Val Ala Leu Ser Ala Leu Ser Gly Ile Asn Ala
100 105 110
Thr Ile Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Ser Ser Gly Lys Thr Phe Thr Met
115 120 125
Arg Gly Val Thr Glu Ser Ala Ile Lys Asp Ile Tyr Asp Tyr Ile Lys
130 135 140
Asn Thr Pro Glu Arg Asp Phe Ile Leu Arg Ile Ser Ala Leu Glu Ile
145 150 155 160
Tyr Asn Glu Thr Val Ile Asp Leu Leu Lys Arg Glu Ser Gly Pro Leu
165 170 175
Arg Leu Leu Asp Asp Pro Glu Lys Gly Thr Ile Val Glu Lys Leu Asn
180 185 190
Glu Glu Val Ala Glu Asp Arg Gln His Leu Arg Arg Leu Ile Gly Ile
195 200 205
Cys Glu Ala Gln Arg Gln Val Gly Glu Thr Ala Leu Asn Asp Lys Ser
210 215 220
Ser Arg Ser His Gln Ile Ile Arg Leu Thr Val Glu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Glu Ser Ser Gly His Val Lys Ser Tyr Ile Ala Ser Leu Asn Phe Val
245 250 255
Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg Ile Ser Gln Thr Asn Thr Cys Gly Ala
260 265 270
Arg Met Lys Glu Gly Ser His Ile Asn Arg Ser Leu Leu Thr Leu Ala
275 280 285
Ser Val Ile Arg Lys Leu Ser Gly Gly Lys Cys Gly His Ile Pro Tyr
290 295 300
Arg Asp Ser Lys Leu Thr Arg Ile Leu Gln Ser Ser Leu Gly Gly Asn
305 310 315 320
Ala Arg Thr Ala Ile Ile Cys Thr Ile Ser Pro Ser Leu Ser His Val
325 330 335
Glu Gln Thr Arg Asn Thr Leu Ala Phe Ala Thr Ser Ala Lys Glu Val
340 345 350
Ile Asn Thr Ala Arg Val Asn Met Val Val Ser Asn Lys Thr Leu Val
355 360 365
Arg Gln Leu Gln Lys Glu Val Ala Arg Leu Glu Gly Glu Leu Arg Ser
370 375 380
Pro Asp Leu Ser Val Asn Ser Cys Leu Arg Ser Leu Leu Ala Glu Lys
385 390 395 400
Glu Leu Lys Ile Gln Gln Met Glu Arg Asp Met Glu Asp Leu Arg Arg
405 410 415
Gln Arg Asp Leu Ala Gln Thr Gln Leu Asp Leu Glu Arg Arg Val Asn
420 425 430
Lys Val Pro Lys Gly Ser Asn Asp Cys Gly Pro Ser Ser Gln Ile Val
435 440 445
Arg Cys Leu Ser Phe Pro Glu Glu Asn Lys Ser Ala Asn Gly Lys Arg
450 455 460
Thr Pro Glu Arg Arg Glu Ala Val Gly Arg Gln Ala Met Leu Lys Asn
465 470 475 480
Leu Leu Ala Ser Pro Asp Pro Ser Ile Leu Val Gly Glu Ile Arg Lys
485 490 495
Leu Glu Asp Arg Gln Leu Gln Leu Cys Glu Asp Ala Asn Arg Ala Leu
500 505 510
Glu Val Leu His Gln Asp Phe Ala Thr His Lys Leu Gly Asn Gln Glu
515 520 525
Thr Ala Glu Thr Met Ser Lys Val Leu Ser Glu Ile Lys Asp Leu Val
530 535 540
Ala Ala Ser Ser Thr Pro Glu Glu Ile Val Ala Ala Asp Lys Ala Asp
545 550 555 560
Leu Met Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Asn Gln Gly Asn Thr Ile Ala
565 570 575
Ser Leu Glu Arg Lys Leu Glu Asn Val Gln Lys Ser Ile Asp Lys Leu
580 585 590
Val Ser Ala Phe Asn Ala Glu Glu Thr Pro Glu Asn Lys Thr Thr Pro
595 600 605
Leu Arg Arg Lys Lys Ile Leu Pro Phe Thr Leu Ser Asn Ser Pro Asn
610 615 620
Met Gln His Ile Ile Arg Ala Pro Cys Ser Pro Leu Ser Ser Ser Arg
625 630 635 640
Lys Ala Met Glu His Asp Ile Glu Asn Arg Ala Pro Glu Asn Asn Ile
645 650 655
Gly Ile Ser Gly Ser Asp Ser Phe Ala Lys Phe His Lys Asp Thr Pro
660 665 670
Arg Lys Asp Asp Lys Ser Cys Asp Ser Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ser
675 680 685
Pro Ala Thr Arg Lys Ser Lys Ser Val Asn Val Met Lys Ile Gln Lys
690 695 700
Met Phe Lys Asn Ala Ala Glu Glu Asn Ile Arg Ser Phe Arg Val Tyr
705 710 715 720
Val Thr Glu Leu Lys Glu Leu Val Ala Lys Leu His Tyr Gln Lys Gln
725 730 735
Leu Leu Val Cys Gln Val Leu Glu Leu Glu Ala Asn Lys Ser Leu Asn
740 745 750
Glu Glu Lys Asp Thr Pro Asp Arg Ser Pro Leu Pro Trp His Ile Leu
755 760 765
Phe Asp Gln Gln Arg Lys Gln Ile Ile Met Leu Trp His Leu Cys His
770 775 780
Ile Ser Leu Val His Arg Thr Gln Phe Phe Leu Leu Leu Gly Gly Asp
785 790 795 800
Pro Ser Asp Gln Ile Tyr Met Glu Val Glu Leu Arg Arg Leu Thr Arg
805 810 815
Leu Glu Gln His Leu Ala Glu Leu Gly Asn Ala Ser Pro Ala Leu Leu
820 825 830
Gly Asp Glu Pro Ala Gly Ser Val Ser Ala Ser Ile Arg Ala Leu Lys
835 840 845
Gln Glu Arg Glu His Leu Ala Arg Lys Val Asn Thr Lys Leu Thr Ala
850 855 860
Glu Glu Arg Glu Leu Leu Tyr Ala Lys Trp Glu Val Pro Pro Val Gly
865 870 875 880
Lys Gln Arg Arg Leu Gln Phe Val Asn Lys Leu Trp Thr Asp Pro Tyr
885 890 895
Asn Met Gln His Val Gln Glu Ser Ala Glu Ile Val Ala Lys Leu Ile
900 905 910
Asp Phe Ser Val Ser Asp Glu Asn Ser Lys Asp Met Ile Glu Leu Asn
915 920 925
Phe Ser Ser Pro Phe Asn Lys Lys Thr Trp Ala Gly Trp Asn Phe Ile
930 935 940
Ser Asn Leu Leu Asn Leu
945 950
<210> 2
<211> 2850
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)
<400> 2
atgacgggaa cacctgtggc ggtggctgcg gcaacgccga ggtctaagat acagaggaat 60
gcttcaggta cgccgggtgg ccccaaagtt cgggaggaga aaattcgagt cacggttcgg 120
atgaggccgc tcaatacaaa ggagcaagct atgtacgatc taattgcttg ggattgtttg 180
gatgaacaca ctattgtgtt caagaatcca aaccaagaga ggcctacaac accatacacc 240
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<210> 3
<211> 548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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acagctagag tcgaagtagt gattgcgccg aggtctaaga tacaggtttt agagctagaa 480
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cttttttt 548
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)
<400> 7
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