一种砧木改良方法及应用
阅读说明：本技术 一种砧木改良方法及应用 (Rootstock improvement method and application ) 是由 李天忠 王胜男 王圣元 郝理 于 2020-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物嫁接技术领域,涉及一种砧木改良方法及应用,包括：步骤1：合成传递基因；步骤2：将合成传递基因与功能基因构建到载体上；步骤3：以农杆菌侵染方式转基因的烟草为砧木,野生番茄为接穗,进行异源嫁接；步骤4：取嫁接口及不同位置茎段及花,提取植物总RNA,反转录成cDNA,RT-PCR检测SlZFP2-tRNA～(Met)和SlZFP2-3×CTCT等在异源嫁接体系中的运输情况；步骤5：调查转基因砧木上野生型番茄的分枝及开花情况。方法可应用在果树转基因砧木育种中,通过砧木转基因定点高效改良接穗性状,人为操控砧木基因,影响接穗性状,提高调控效率,缩短育种年限,减少人力物力成本,普遍应用于各类植物。(The invention belongs to the technical field of biological grafting, and relates to a stock improvement method and application, which comprises the following steps: step 1: synthesizing a transmission gene; step 2: constructing a synthetic transmission gene and a functional gene on a carrier; and step 3: taking tobacco with transgene in an agrobacterium infection mode as a stock and wild tomatoes as scions, and carrying out heterologous grafting; and 4, step 4: taking the graft port and stem segments and flowers at different positions, extracting total RNA of the plant, performing reverse transcription to obtain cDNA, and detecting SlZFP2-tRNA by RT-PCR Met And SlZFP2-3 × CTCT and the likeTransportation conditions in the grafting system; and 5: and (5) investigating the branching and flowering conditions of the wild tomato on the transgenic rootstock. The method can be applied to breeding of fruit tree transgenic stocks, the scion character is efficiently improved at fixed points through the rootstock transgenosis, the rootstock gene is manually controlled, the scion character is influenced, the regulation efficiency is improved, the breeding period is shortened, the manpower and material resource cost is reduced, and the method is generally applied to various plants.)
技术领域
本发明属于生物嫁接技术领域，涉及一种砧木改良方法及应用,具体涉及砧穗间长距离传递片段携带功能基因调控接穗农艺性状的方法，更具体涉及的是，通过砧木传递mRNA(信使核糖核酸)片段融合重要农艺性状功能基因遗传转化，进而调控接穗相关性状的技术。
背景技术
嫁接是园艺作物最主要的无性繁殖方式；在嫁接后，砧木与接穗之间相互作用，会影响树体的生长发育、抗性、开花、果实产量和品质等。在实际的生产中，主要是砧木对接穗的调控，选择适宜的砧木是保障果树栽培成功的关键。优良砧木的选用一般通过实生选种、杂交育种和诱变育种等方式获得，后期再通过无性繁殖，保持砧木品种的优良性状(李天忠等在2008提出；沙广利等在2015年提出)，近年来，也有通过基因工程和DNA(脱氧核糖核酸)分子标记技术等方式改良砧木(韩斌等在2014年提出)。然而，以上方式仅能通过天然的人工筛选获得优良砧木，无法定向应用于实际生产中，同时也存在转基因食品不被公众接受的问题。
随着近年来砧穗间传递mRNA的发现，使得砧穗间表型调控机理逐渐清晰，也为定点改良砧木提供理论基础。然而，绝大多数表型相关基因还未知，或者功能基因自身不具有传递性，使得通过砧木定点调控接穗性状的目标难以实现。在对砧穗间长距离运输mRNA的研究中，发现一些特殊结构的mRNA具有较高的传递效率。因此，可以利用上述特殊结构的mRNA具有的传递效率高的特点，并融合不可传递的功能基因，在砧穗间调控性状，从而高效地定点改良砧木。
前期关于传递mRNA携带功能基因的研究较少；在2001年，Kim等将传递基因LeT6与焦磷酸盐依赖的磷酸果糖激酶PFP(PYROPHOSPHATE-DEPENDENT PHOSPHOFRUCTOKINASE)进行融合表达转化番茄，发现番茄叶片由正常叶片转化为鼠耳叶，当把正常叶片番茄嫁接在鼠耳叶番茄上，接穗的叶片也出现了鼠耳叶表型；在2007年，Kudo和Harada在马铃薯上发现，将野生型马铃薯嫁接在引起鼠耳叶性状的番茄上，接穗也会出现鼠耳叶；在2016年，Zhang等将与减数分裂过程相关的功能基因DMC1(DISRUPTION OF MEIOTIC CONTROL1)融合表达可传递基因tRNAMet转化烟草植株，其上嫁接野生型烟草，将接穗与对照相比，发现：出现了大量败育的花粉，说明RNA(核糖核酸)能够长距离运输到花器官中，并翻译成有功能的蛋白。
虽然关于mRNA携带功能基因调控接穗表型已有相关研究，然而存在对接穗性状调控效果不明显，效率较低，且多数性状不具有产业意义等问题，无法最终应用到砧穗间的重要农艺性状调控的实际生产中。
本发明利用传递效率高的mRNA片段，与产业中不传递的重要农艺性状基因融合表达，构建成mRNA运输载体，通过砧木运输载体遗传转化调控接穗表型，最终达到改良砧木的目的。前期相关技术均存在传递效率低，调控表型不明显，且无法在产业上应用等问题，本发明运用的高效传递mRNA片段可将传递效率提高到90％以上。本发明可应用在果树转基因砧木育种中，解决了通过砧木转基因定点高效改良接穗性状困难的分子育种问题；并通过人为操控砧木基因，影响接穗性状，达到提高调控效率，缩短育种年限，减少人力物力成本的目的；同时避免出现接穗直接转基因等公众不认可，且争议较大等问题，具有能够普遍应用于各种类型植物的特点。
发明内容
为解决背景技术中提出的技术问题，本申请提出一种砧穗间长距传递片段携功能基因调控接穗农艺性状的方法，具体技术方案如下：
一种砧木改良方法(即涉及一种砧穗间长距传递片段携功能基因调控接穗农艺性状的方法)，包括以下步骤：
步骤1：合成传递基因tRNAMet、3×CTCT、3×CTCTt，
其中3×CTCTt代表3×(CTCT:tRNAMet)；
所述传递基因tRNAMet的基因序列如序列表序列1所示；
所述传递基因3×CTCT的基因序列如序列表序列2所示；
所述传递基因3×CTCTt的基因序列如序列表序列3所示；
步骤2：克隆促进分枝及提早开花功能基因SlZFP2，将步骤1所述合成传递基因与功能基因共同构建到pCAMBIA1305载体上，用于后续融合表达；
所述功能基因SlZFP2的基因序列如序列表序列4所示；
步骤3：采用农杆菌侵染的方式在烟草中转基因过表达pCAMBIA1305-SlZFP2-tRNAMet、pCAMBIA1305-SlZFP2-3×CTCT、pCAMBIA1305-SlZFP2-3×CTCTt，以上述转基因烟草为砧木，野生型番茄为接穗，进行番茄/烟草异源嫁接；
步骤4：取嫁接口及嫁接口上下不同位置茎段及花，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-PCR检测SlZFP2-tRNAMet、SlZFP2-3×CTCT、SlZFP2-3×CTCTt在番茄/烟草异源嫁接体系中的运输情况；
步骤5：调查不同转基因砧木上野生型番茄的分枝及开花情况。
在上述技术方案的基础上，步骤1所述传递基因tRNAMet是在原基因tRNAMet序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点形成；
步骤1所述传递基因3×CTCT是在原基因3×CTCT序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点形成；
步骤1所述传递基因3×CTCTt是在原基因3×CTCTt序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点形成。
在上述技术方案的基础上，步骤2所述将合成传递基因与功能基因共同构建到pCAMBIA1305载体上的具体步骤如下：
S21、将步骤1所述可传递基因片段tRNAMet、3×CTCT、3×CTCTt与pCAMBIA1305载体共同采用SalI和BglII进行双酶切，形成酶切产物；
S22、将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，Axgen回收试剂盒回收目标片段；
S23、将回收目标片段与pCAMBIA1305载体用T4连接酶连接，构建pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×CTCTt三个可传递载体；
步骤2所述克隆促进分枝及提早开花功能基因SlZFP2的具体步骤如下：
S24、采用CTAB法提取番茄和烟草叶片RNA；
S25、将步骤S24提取的RNA采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA；
S26、设计引物克隆番茄SlZFP2基因全长序列，引物序列如下：
SlZFP2-F：ATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SlZFP2-R：TTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG。
在上述技术方案的基础上，步骤3的具体步骤如下：
S31、设计引物，通过PCR扩增将SlZFP2回收产物加酶切位点，引物序列如下：
加入酶切位点SalI的上游引物序列：
GTCGACATGAGTTATGAACCAAACACGG；
加入酶切位点SpeI的下游引物序列：
ACTAGTTTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG；
S32、琼脂糖凝胶电泳检测并回收，与pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×CTCTt载体分别进行双酶切，采用T4连接酶16℃连接过夜，转入E.coli DH5α感受态细胞中，次日挑取单克隆，摇菌提取质粒；
S33、制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞；
S34、转化农杆菌感受态细胞；
S35、转基因烟草；
S36、鉴定烟草转基因阳性株，取阳性苗叶片，用CTAB法提取DNA；
S37、田间嫁接番茄/转基因烟草。
在上述技术方案的基础上，步骤4的具体步骤如下：
S41、检测功能基因在番茄/烟草田间嫁接体系中的传递性；
具体步骤如下：
S411、将番茄与烟草于田间进行嫁接；
S412、嫁接口愈合，待番茄有新叶长出，去除嫁接口处封口膜，并不断移除老叶使接穗新叶生长；
S413、1个月后，取样番茄的叶片、茎段以及烟草的叶片、茎段，采用液氮研磨，提取RNA后反转录成cDNA；
S414、采用RT-PCR的方式验证GAI和ZFP2基因的传递情况，烟草及番茄中各基因特异性引物序列如下：
SlZFP2-F：ATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SlZFP2-R：ACCATGACTAGTATGGCTCGGAC；
NtZFP2-F：GCTTATCAAGAAATGAACTTAGCTT；
NtZFP2-R：GCTCAATTCAGTAGTAACAAACCTAG；
SlGAI-F：CTCTAATGGTGCTGTTTCTTCAGG；
SlGAI-R：GGTACTTGTTCGATGATTTTGTGAG；
NtGAI-F：AGCATGTTATCTGAGCTCAACAAC；
NtGAI-R：TTGCATCTGCTGTTAGTGGTACAC；
SlActin-F：GGAATGGGACAGAAGGAT；
SlActin-R：CAGTCAGGAGAACAGGGT；
NtActin-F：TTGCCTGATGGACAAGTTATTACC；
NtActin-R：TAGGAGCCAAAGCCGTGATT；
S42、检测砧穗间传递mRNA及融合基因运输载体传递性；
具体步骤如下：
S421、将SlZFP2基因作为融合表达的功能基因，与可传递基因tRNAMet、3×CTCT、3×CTCTt进行融合表达，构建mRNA运输载体转化烟草植株；
S422、将野生型番茄作为接穗嫁接到转基因砧木上，嫁接2周后，取样接穗茎段提取RNA，通过巢式PCR进行传递性鉴定，引物序列如下：
F：ACACGGCCTTAAACCTAAGTCTATC；
R：ATCCTGGTGCCTCCCTGTTAG；
巢式PCR正向引物序列(CSF)：
TCATCAACCCCTTTAAGCCCGGTTG；
番茄分枝基因SlZFP2-tRNAMet的巢式PCR反向引物序列即SlZPF2-t(CSR)-：
CGATCCTGGGACCTGTGGGTTATGG；
番茄分枝基因SlZFP2-3×CTCT的巢式PCR反向引物序列即SlZPF2-3CU(CSR)-：
GCAGAAGAAAAGAAGATGTTAACAAG；
番茄分枝基因SlZFP2-3×CTCTt的巢式PCR反向引物序列即SlZPF2-3CUt(CSR)-：
GATGCAGAAGAAAAGTTAAAGCCTTAATGACAAATC；
S423、取样砧木茎、嫁接口、距离嫁接口不同距离的接穗茎段以及茎尖、分枝茎、分枝叶、花组织，检测其融合片段的传递距离以及传递到的植株部位。
在上述技术方案的基础上，步骤S35的具体步骤如下：
S351、取烟草叶片，用流水冲洗2-3h；
S352、在超净台中，采用75％乙醇漂洗30s，灭菌水冲洗2次；
S353、2％NaClO漂洗6min，灭菌水冲洗5-6次；
S354、将叶片沿主脉，将两侧叶片切成0.5cm×0.5cm大小的方块，平铺于预培养基上，25℃光下培养48h。
S355、挑取转化农杆菌阳性克隆，接种于5mL含Rif和Kan的YEP液体培养基中，28℃200rpm过夜培养至OD600＝0.6-0.8；
S356、6000rpm 5min集菌，弃上清，用50ml含Rif和Kan的YEP液体培养基重悬，28℃200rpm培养3-4h至OD600＝0.6-0.8；
S357、6000rpm 5min集菌，弃上清，用30mL液体MS培养基重悬，28℃200rpm培养3-4h；
S358、将预培养的叶片置于菌液中轻轻摇动1min取出，在无菌滤纸中吸取多余菌液，放回原预培养基中25℃暗培养48h；
S359、转入脱菌固体培养基中，光下继续培养；
S3510、待再生苗长出，切取接种在含有Cef的培养基中。
在上述技术方案的基础上，步骤5的具体步骤如下：
S51、对转基因烟草砧木调控番茄接穗分枝进行表型分析；
具体步骤为：待嫁接后3个月，观察不同融合片段转基因烟草上番茄接穗的分枝情况；
S52、可传递片段融合早花功能基因调控花期性状；
具体步骤为：对嫁接体系进一步统计开花时间，调控番茄的花期。
在上述技术方案的基础上，步骤S36的具体步骤如下：
S361、液氮中研磨叶片，加入700μL 60℃预热含0.2％β-巯基乙醇的CTAB提取液；
S362、65℃约30min，加入700μL氯仿：异戊醇＝24:1，涡旋振荡15s；
S363、室温13000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中；
S364、加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀30min以上；
S365、室温13000rpm离心10min，70％乙醇漂洗2次，晾干；
S366、加入30μL ddH2O溶解；
S367、用特异性跨区引物鉴定阳性植株，并对阳性植株提取RNA，特异性跨区引物鉴定RNA水平阳性植株，引物序列如下：
pCAMBIA1305-F(即1305-F，又称为1305载体上设计的正向鉴定引物或1305-F)：
GCCGTCTAGAGTTAGATGGTTAAC；
pCAMBIA1305-R(即1305-R，又称为1305载体上的反向鉴定引物)：
GCAAGACCGGCAACAGGATTCAATC。
在上述技术方案的基础上，步骤S37的具体步骤如下：
S371、移栽生长大小一致的转基因烟草和番茄植株于土里；
S372、在生长1个月后，用手术刀片以平切的方式去除砧木顶端叶片，再纵切砧木茎，形成向下的2-3cm切口，接穗只保留顶端1-2片叶，将接穗茎段底部用手术刀削成楔形，插入砧木切口中，用封口膜紧密缠绕嫁接口；
S373、嫁接成活后去除封口膜，嫁接1-2个月后，取样品速冻于液氮中，用于后续RNA提取。
前述砧木改良方法在转基因砧木育种中的应用。
本发明的有益技术效果如下：
本发明提供的方法可应用在果树转基因砧木育种中，通过砧木转基因定点高效改良接穗性状的分子育种技术，人为操控砧木基因影响接穗性状，达到提高调控效率，缩短育种年限，减少人力物力成本的目的；同时避免由于接穗直接转基因，导致公众不认可且争议较大的问题。本发明所述方法且具有能够普遍应用于各种类型植物的特点。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为CoYMV启动子转基因mRNA运输载体构建以及融合片段传递情况统计示意图；
图2(a)为番茄/烟草田间嫁接体系示意图；
图2(b)为PCR检测GAI以及ZFP2基因的传递性示意图；
图3(a)为野生型番茄/转基因烟草田间嫁接取样示意图；
图3(b)为PCR检测tRNAMet、3×CTCT、3×(CTCT:tRNAMet)融合SlZFP2基因的传递距离以及传递组织示意图；
图4(a)为野生型番茄/转基因烟草田间分枝表型观察示意图一；
图4(b)为野生型番茄/转基因烟草田间分枝表型观察示意图二；
图4(c)为野生型番茄/转基因烟草田间分枝表型观察示意图三；
图4(d)为野生型番茄/转基因烟草田间分枝表型观察示意图四；
图5为野生型番茄/转基因烟草田间分枝表型统计示意图；
图6为野生型番茄/转基因烟草田间开花节位表型统计示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：可传递基因序列获得及传递载体的构建过程
1.可传递基因序列获得
tRNAMet、3×CTCT、3×(CTCT:tRNAMet)均由生工生物技术有限公司合成，并在序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点，序列见文末。
2.可传递载体构建(如图1所示)
将带有酶切位点的可传递基因片段tRNAMet、3×CTCT、3×(CTCT:tRNAMet)与pCAMBIA1305载体共同采用SalI和BglII进行双酶切，反应体系如下表所示：
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，Axgen回收试剂盒回收目标大小片段，步骤如下：
(1)将切下的胶块置于2mL离心管中，加入500μL DE-A，65℃溶胶至胶块完全溶解，加入250μL DE-B，混合溶液上到回收柱中；
(2)12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液；
(3)加入500μL漂洗液PW1，12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液；
(4)加入700μL漂洗液PW2，12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液，此步骤重复2次；
(5)将回收柱放回收集管内，12000rpm离心2min，吹干残留乙醇；
(6)将回收柱置于新的1.5mL离心管中，加入35μL已65℃预热的EB洗脱液，室温放置2min；
(7)12000rpm离心2min。
将回收目标片段与pCAMBIA1305载体用T4连接酶(购自TAKARA公司)连接，构建pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×(CTCT:tRNAMet)三个可传递载体，反应体系如下表所示：
将上述反应体系混匀，16℃过夜；将连接体系加入50μL E.coli DH5α感受态细胞(购自全式金生物技术有限公司)中，冰上放置20min；42℃热击45s，冰上放置2min；加入200μL无抗LB培养基，37℃160rpm振荡培养1h；4500rpm，3min离心收集菌体，弃掉150μL上清液，用剩余的培养基重悬细胞，均匀涂布于Kan抗性固体LB培养基上，37℃倒置过夜培养。
次日，挑取单克隆于200μL Kan抗性的LB培养基中，37℃200rpm振荡培养6h后，进行PCR鉴定，挑取阳性菌液测序(生工生物技术有限公司)，测序正确菌株重摇，加入等体积甘油，-80℃保存备用。
3.可传递质粒提取
测序正确菌株接种于5mL Kan抗性的LB培养基中，37℃200rpm过夜振荡培养，次日提取质粒(Axygen质粒提取试剂盒)。
(1)将菌液加入2mL离心管中，12000rpm离心30s多次集菌，弃上清；
(2)在沉淀中加入Buffer S1，涡旋振荡混匀；
(3)在溶液中加入Buffer S2，轻轻颠倒混匀10次；
(4)在溶液中加入Buffer S3，立即轻轻颠倒混匀10次；
(5)12000rpm离心10min，吸上清加入吸附柱上；
(6)静置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
(7)加入500μL漂洗液PW1，12000rpm离心30s，弃去吸附柱中的废液；
(8)加入700μL漂洗液PW2，12000rpm离心30s，弃去吸附柱中的废液，此步骤重复2次；
(9)将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心2min，吹干残留乙醇；
(10)将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加入70μL已65℃预热的EB洗脱液，室温放置2min；
(11)12000rpm离心2min，-20℃保存，用于后续功能融合载体构建。
实施例2可传递片段融合分枝功能基因调控分枝性状
1.番茄和烟草RNA提取
为扩增SlZFP2基因全长序列，首先采用CTAB法提取番茄和烟草叶片RNA，具体步骤如下：
(1)65℃预热CTAB，每1mL加入20μLβ-巯基乙醇；
(2)液氮中研磨样品，取0.5g样品装入2mL无RNA酶离心管中，加入1mL预热的CTAB，涡旋振荡30s，65℃水浴10min；
(3)加入1mL CI(氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋振荡；
(4)置于预冷的4℃离心机中13000rpm，10min；
(5)取上清，加入等体积CI，轻轻混匀；
(6)4℃离心机中13000rpm 10min；
(7)取上清，加入2倍体积异丙醇，-20℃30min以上；
(8)4℃离心机中13000rpm 10min；
(9)弃上清，沉淀用75％乙醇(DEPC水配制)1mL洗2次，4℃离心机中13000rpm5min；
(10)吹干残留乙醇，加入40μL DEPC水溶解，用DNaseⅠ去除DNA，37℃30min，体系如下表所示；
(11)加入550μL DEPC水，600μL CI，颠倒混匀，4℃离心机中13000rpm 10min；
(12)取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃1h；
(13)4℃离心机中13000rpm 15min；
(14)弃上清，沉淀用75％乙醇(DEPC水配制)1mL洗2次，4℃离心机中13000rpm5min；
(15)吹干残留乙醇，加入30μL DEPC水溶解，-80℃保存备用。
2.将RNA反转录为cDNA
将提取的植物总RNA采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Promega Bio)反转录成cDNA，反应体系如下：
冰上操作，轻轻吸打混匀，放入PCR仪中，70℃10min，4℃forever。再加入如下反应体系：
冰上操作，轻轻吸打混匀，放入PCR仪中，42℃1h，70℃10min，-20℃保存。
3.功能基因SlZFP2全长克隆
设计引物克隆番茄SlZFP2基因全长序列，引物序列如下：
上述引物均由生工生物技术有限公司合成。
PCR体系及程序如下表所示：
2×Es Taq MasterMix(Dye)购自(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0682S)
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，Axgen回收试剂盒回收目标大小片段，并连接PMD19-T，反应体系如下：
16℃连接2h，转入E.coli DH5α感受态细胞中，次日挑取单克隆送生工生物技术有限公司测序，将测序正确的菌液摇菌提取质粒，方法同上。
4.功能基因传递载体构建(如图1所示)
将功能基因SlZFP2分别构建到pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×(CTCT:tRNAMet)载体上。设计引物，通过PCR扩增将SlZFP2回收产物加酶切位点，引物序列如下：
琼脂糖凝胶电泳检测并回收，与pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×(CTCT:tRNAMet)载体分别进行双酶切，采用T4连接酶16℃连接过夜，转入E.coli DH5α感受态细胞中，次日挑取单克隆，摇菌提取质粒，方法同上。
5.根癌农杆菌GV3101感受态细胞制备
(1)将农杆菌划线在YEP+Rif固体培养基上，28℃培养2-3d；
(2)挑取单克隆接种于5mL液体YEP+Rif培养基中，28℃200rpm振荡培养12h；
(3)5000rpm 5min集菌，转接于50mL液体YEP培养基中，28℃200rpm振荡培养过夜至OD600值为0.6-0.8；
(4)于50mL离心管中5000rpm 5min集菌，弃上清；
(5)将菌体用10mL 0.15M NaCl溶液重悬，冰上静置20min；
(6)4℃5000rpm 5min集菌，弃上清；
(7)用1mL预冷的0.02Mol CaCl2溶液轻轻重悬；
(8)分装于预冷的1.5mL离心管中，每管100μL，加等体积甘油-80℃保存备用。
6.农杆菌感受态细胞转化
(1)分别将pCAMBIA1305-SlZFP2-tRNAMet、pCAMBIA1305-SlZFP2-3×CTCT、pCAMBIA1305-SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)质粒1-2μL加入100μL感受态细胞中，冰上放置30min；
(2)将带有质粒的感受态细胞放入液氮中1min；
(3)放在37℃金属浴5min；
(4)置于冰上2min；
(5)加入500μL无抗性的YEP液体培养基，28℃160rpm振荡培养4-6h；
(6)4000rpm集菌，吸除300μL上清，剩余菌液重悬，涂布于YFP+Rif+Kan固体培养基上，28℃过夜培养；
7.烟草转基因
(1)取烟草叶片，用流水冲洗2-3h；
(2)在超净台中，采用75％乙醇漂洗30s，灭菌水冲洗2次；
(3)2％NaClO漂洗6min，灭菌水冲洗5-6次；
(4)将叶片沿主脉，将两侧叶片切成0.5cm×0.5cm大小的方块，平铺于预培养基上，25℃光下培养48h。
(5)挑取转化农杆菌阳性克隆，接种于5mL含Rif和Kan的YEP液体培养基中，28℃200rpm过夜培养至OD600＝0.6-0.8；
(6)6000rpm 5min集菌，弃上清，用50ml含Rif和Kan的YEP液体培养基重悬，28℃200rpm培养3-4h至OD600＝0.6-0.8；
(7)6000rpm 5min集菌，弃上清，用30mL液体MS培养基重悬，28℃200rpm培养3-4h；
(8)将预培养的叶片置于菌液中轻轻摇动1min取出，在无菌滤纸中吸取多余菌液，放回原预培养基中25℃暗培养48h；
(9)转入脱菌固体培养基中，光下继续培养；
(10)待再生苗长出，切取接种在含有Cef的培养基中。
8.烟草转基因阳性株鉴定
取阳性苗叶片，用CTAB法提取DNA，方法如下：
(1)液氮中研磨叶片，加入700μL 60℃预热含0.2％β-巯基乙醇的CTAB提取液；
(2)65℃约30min，加入700μL氯仿：异戊醇＝24:1，涡旋振荡15s；
(3)室温13000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中；
(4)加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀30min以上；
(5)室温13000rpm离心10min，70％乙醇漂洗2次，晾干；
(6)加入30μL ddH2O溶解；
(7)用特异性跨区引物鉴定阳性植株，并对阳性植株提取RNA，特异性跨区引物鉴定RNA水平阳性植株。引物序列如下：
9.番茄/转基因烟草田间嫁接
移栽生长大小一致的转基因烟草和番茄植株于土里，在生长1个月后，用手术刀片以平切的方式去除砧木顶端叶片，再纵切砧木茎，形成向下的2-3cm切口，接穗只保留顶端1-2片叶，将接穗茎段底部用手术刀削成楔形，插入砧木切口中，用封口膜紧密缠绕嫁接口，注意保湿并及时去除砧木的萌蘖。嫁接成活后及时去除封口膜，嫁接1-2个月后，取样品速冻于液氮中，用于后续RNA提取。
10.功能基因在番茄/烟草田间嫁接体系中的传递性检测
将番茄与烟草于田间进行嫁接，嫁接口愈合，待番茄有新叶长出，去除嫁接口处封口膜，并不断移除老叶使接穗新叶生长(如图2(a)所示)，1个月左右，取样番茄的叶片、茎段以及烟草的叶片、茎段，采用液氮研磨，提取RNA(植物总RNA提取试剂盒(博迈德生物技术有限公司))后反转录成cDNA，采用RT-PCR的方式验证GAI(已知可传递基因为阳性对照)和ZFP2基因的传递情况。烟草及番茄中各基因特异性引物序列如下：
结果显示：在番茄接穗叶片以及茎中可以检测到番茄自己的SlGAI以及烟草的NtGAI，但不能检测到烟草中的NtZFP2，而在烟草砧木中也可以检测到烟草自己的NtGAI以及番茄SlGAI，但不能检测到番茄中的SlZFP2(如图2(b)所示)。因此，说明了GAI基因可以在番茄与烟草的嫁接体系里进行双向的传递，而ZFP2功能基因不能在该嫁接体系中进行传递。
11.砧穗间传递mRNA及融合基因运输载体传递性检测
由于前面已经通过番茄/烟草证明了ZFP2功能基因不能进行长距离传递，因此我们将SlZFP2基因作为融合表达的功能基因，与可传递基因tRNAMet、3×CTCT、3×(CTCT:tRNAMet)进行融合表达，构建mRNA运输载体转化烟草植株。将野生型番茄作为接穗嫁接到转基因砧木上，嫁接2周后，取样接穗茎段提取RNA，通过巢式PCR进行传递性鉴定，引物序列如下：
结果显示：SlZFP2全长不传递，SlZFP2融合tRNAMet、3×CTCT、3×(CTCT:tRNAMet)片段则可以进行传递(如图1所示)。
同时嫁接后8周，我们取样砧木茎、嫁接口、距离嫁接口不同距离的接穗茎段以及茎尖、分枝茎、分枝叶、花等组织(如图3(a)所示)，GU代表嫁接口，ST代表砧木，SC代表接穗；检测了其融合片段的可以传递的距离以及传递到的植株部位，结果发现：融合片段可以长距离传递到茎尖以及高度距离嫁接口60cm的茎中，其中SlZFP2-tRNAMet和SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)可以传递到花器官中，而SlZFP2-3×CTCT在花器官中没有检测到融合片段(如图3(b)所示)。
12.转基因烟草砧木调控番茄接穗分枝表型分析
待嫁接后3个月，观察不同融合片段转基因烟草上番茄接穗的分枝情况。结果显示，SlZFP2-tRNAMet、SlZFP2-3×CTCT、SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)转基因烟草上番茄接穗的分枝数与SlZFP2转基因烟草上番茄接穗的分枝数相比明显增加，且SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)表型最为明显(如图4所示，其中，星号表示分枝)。以上结果表明可传递的片段融合了不可传递的分枝SlZFP2功能基因到接穗中，最后在接穗中翻译成了功能蛋白而使分枝增多。
实施例3可传递片段融合早花功能基因调控花期性状(如图6所示)
前期研究中我们发现SlZFP2调控番茄分枝的同时，也可以调控番茄的花期，因此我们对上述嫁接体系进一步统计开花时间。
结果显示：SlZFP2-tRNAMet、SlZFP2-3×CTCT、SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)转基因烟草为砧木的番茄接穗与对照SlZFP2相比明显提早开花，且SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)表型最为明显(如图5所示)。以上结果表明可传递的片段融合了不可传递的SlZFP2早花功能基因到接穗中，最后在接穗中翻译成了功能蛋白而使花期提前。
以上实施例说明：tRNAMet、3×CTCT、3×(CTCT:tRNAMet)作为可传递基因，可以携带不可传递功能基因SlZFP2从砧木传递到接穗中，最终翻译成功能蛋白发挥作用，其中且SlZFP2-3×(CTCT:tRNAMet)调控功能最明显，其可用于后续更多调控果皮颜色、果实大小、抗寒、抗旱等功能基因的携带研究，最终达到仅通过砧木遗传转化，调控接穗多种性状的目的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
本说明书中未做详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
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