具体实施方式

[核]

本发明人等对生理活性物质进行了全面的调查后发现，选自细菌素、多酚、氨基酸或其衍生物、有机酸或其衍生物、HSP诱导剂、抗氧化剂、及多糖中的至少1种确认具有优异的膜坚固化能力(固膜功能)。

细菌素根据Paul D.Cotter的分类(Nat.Rev.Microbiol.2005第3(10)卷,第777-88页)被分为I类和II类这两类。

属于I类的细菌素也被称为羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其结构中存在由翻译后修饰而产生的异常氨基酸。作为具体例子，可列举乳酸链球菌素A(NisinA)、乳酸链球菌素Z(NisinZ)、乳酸链球菌素Q(NisinQ)、枯草菌素(Subtilin)、耐久霉素(Duramycin)、美杀菌素(mersacidin)、乳链球菌素-481(lacticin481)。

II类是其结构中不含异常氨基酸的肽。II类被进一步分为3个亚类a～c。作为属于IIa类的细菌素的具体例子，可列举片球菌素PA-1(pediocinPA-1)、肠道菌素A(enterocinA)。属于IIb类的细菌素是同时产生的2个肽，已知它们协同地提高彼此的效果。作为具体例子，可列举植物乳杆菌素(Plantaricin：PlnE、PlnF)、肠道菌素X(enterocin X：Xalpha、Xbeta)、乳球菌素Q(Lactococcin Q：Qalpha、Qbeta)。属于IIc类的细菌素具有N末端与C末端通过肽键连接而成的环状结构。作为具体例子，可列举乳酸菌素A(GassericinA)、环状菌素A(CircularinA)、乳酸菌环素Q(lactocyclicinQ)。

作为本发明中使用的细菌素，优选为属于I类、IIb类及IIc类的细菌素。作为本发明中使用的细菌素，更优选为乳酸链球菌素(Nisin)、乳酸菌素(Gassericin)、植物乳杆菌素(Plantaricin)、枯草菌素(Subtilin)。

应予说明，各细菌素的名称后未附带字母的情况下，表示该细菌素的总称(例如，术语“乳酸链球菌素”是包含乳酸链球菌素A、乳酸链球菌素Z等的概念)。

通过本发明人等的实验，确认了乳酸链球菌素具有膜坚固化能力，所以对筛选具有膜坚固化能力的细菌素的指标进行了探讨，结果发现膜坚固化能力并不一定与抗菌活性或抗菌谱相关(参照后述的实验例B)。

被用作AGP的抗生素已知不会被消化酶分解，因此在体内也保持活性，作为粪便排出后也具有抗菌活性。另一方面，作为蛋白质或肽的细菌素会被消化酶轻易地分解，因此在消化道内失去活性。用于饲料用途的情况下，为了避免因消化酶而失活，理想的是进行保护(被覆)，如果受到保护，则在小肠中10～100ppm就可充分发挥膜坚固化能力。然后，进入粪便中的细菌素因粪便中的酶而失活，因此是安全的。因此，具有下述优点：即使将含有代替AGP的细菌素的饲料用添加剂或饲料给予家畜也不会产生耐药菌的问题。应予说明，本说明书中，“ppm”是指“质量ppm(ppm by mass)”。

作为本发明中使用的多酚，可列举槲皮素(Quercetin)、姜黄素(Curcumin)等。优选为槲皮素。

作为本发明中使用的氨基酸，可列举谷氨酰胺(Glutamine，Gln)、色氨酸(Tryptophan，Trp)、缬氨酸(Valine，Val)、酪氨酸(Tylosin，Tyr)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)等。作为氨基酸的衍生物，可列举苯乳酸盐(酯)(Phenyllactate，PLA)等。

作为本发明中使用的有机酸，可列举丁酸等。有机酸的总碳数为2～5左右。作为有机酸的衍生物，可列举例如与碳数1～5的醇的酯。

作为本发明中使用的HSP诱导剂(热休克蛋白诱导剂，heat shock protein(HSP)inducer)，可列举多聚磷酸(Poly-Phosphate)和来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的感受态和芽孢形成因子(Competence and sporulation factor(CSF))等。

作为本发明中使用的抗氧化剂，可列举虾青素(Astaxanthin)等。

作为本发明中使用的多糖，可列举阿拉伯胶(Arabic Gum)、普鲁兰多糖(Pullulan)、半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan，GGM)、黄原胶(Xanthan Gum，XG)等。

本发明中，所述生理活性物质可单独使用1种，也可将2种以上组合使用。作为本发明中使用的生理活性物质，优选为细菌素、多糖、氨基酸及它们的组合，更优选为乳酸链球菌素、Tyr及它们的组合。

另外，已知多聚磷酸通过提高热休克蛋白(HSP inducer)的产能而强化屏障功能(Shuichi Segawa等,PLoS ONE,2011,6(8):e23278)。一般认为，如果以热休克蛋白为代表的应激反应蛋白被诱导，则细胞间屏障功能得到增强。

另一方面，紧密连接(tight junction)是相邻细胞的细胞膜紧密贴合而其外膜相互融合所形成的层，位于上皮细胞的基侧膜(basolateral membrane)与顶端膜(apicalmembrane)的边界处，被认为在两者之间防止膜蛋白和脂质相互混杂(岩波《生物学辞典》第4版CD-ROM版，1998年)。

推测本发明中使用的生理活性物质具有由基于紧密连接的防止物质扩散的功能和基于应激反应蛋白的细胞间屏障功能中的任一者或两者产生的膜坚固化能力，但这并不受限于任何理论。虽然认为若使紧密连接坚固化，就可变得健康，但以往没有将可使紧密连接坚固化的物质递送至肠的饲料。此外，以往并不知道将在体外(in vitro)可使紧密连接坚固化的抗菌剂给予家畜的情况下显示出体增重效果。应予说明，本说明书中，也将膜坚固化能力称为屏障功能(barrier function)。

只要可获得所期望的效果，本发明中使用的生理活性物质的纯度不受限制。例如，可连同培养物一起使用使微生物生产而得的生理活性物质。亦可通过冷冻干燥获得发酵液中的固体物，还可通过喷雾造粒作为固体物获得发酵液。

或者，本发明中使用的生理活性物质还可直接使用来自植物、藻类、甲壳类或鱼类的分泌物或提取物。作为本发明中使用的生理活性物质，也可直接使用市售品。

作为含有生理活性物质中的多酚(polyphenol)的植物，可列举葡萄、酒、茶、苹果、蓝莓、柿子、香蕉、姜黄、肉桂、咖啡豆、柑橘类、洋葱等。

作为产生生理活性物质中的多糖的微生物，例如，斯达油脂酵母(LypomycesStarkey)产生的半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan，GGM)可通过日本专利特开平7-298873号公报、日本专利特开平9-131199号公报中记载的方法获得。作为产生生理活性物质中的多糖的微生物，可列举野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、暗金黄担子菌(Aureobasidium pullulans)、斯达油脂酵母(Lypomyces Starkey)、褐藻中的海带(Phaeophyta)、藻类中的麒麟菜(Eucheuma)。此外，植物中，可列举阿拉伯胶树(Acaciasenegal)和瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)、长枝沙菜(Hypnea musciformis)、塔拉(Tara spinosa)、长角豆(Ceratonia siliqua)等。

作为产生生理活性物质中的氨基酸或其衍生物的微生物，可列举黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)等。

作为产生生理活性物质中的有机酸或其衍生物的微生物，可列举乳杆菌属(Lactbacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)等。

作为产生生理活性物质中的HSP诱导剂的微生物，可列举芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus lactis)、乳杆菌属(Lactbacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)。

作为产生生理活性物质中的抗氧化剂的微生物，可列举红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)和嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌(Pseudomonas thiazolinophilum)、作为藻类的雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)等。

作为本发明中使用的生理活性物质之一的细菌素还优选为选自芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus lactis)、乳杆菌属(Lactbacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)中的1种以上的微生物的培养产物。

其中，作为产生细菌素的微生物，优选为在美国饲料品管协会(AAFCO)或欧洲食品安全局(EFSA)已登记的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、植物乳杆菌(Lactbacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(牛)(Lactobacillus buchneri(cattle))、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、香肠乳杆菌(猪)(Lactobacillus farciminis(swine))、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、柠檬色明串珠菌(Leuconostoc citreum)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、啤酒片球菌/有害片球菌(Pediococcus cerevisiae/damnosus)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的培养产物。

特别优选乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactbacillus plantarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinickii)的培养产物。其中，优选乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的培养产物。

特别优选乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)FERMBP-8552(乳酸链球菌素Z产生菌)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633(枯草菌素产生菌)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NCIMB702054(乳酸链球菌素Z产生菌)、植物乳杆菌(Lactbacillusplantarum)JCM1057(植物乳杆菌素产生菌)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)LA39JCM 11657(乳酸菌素A产生菌)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinickii)JCM1390(环状菌素A产生菌)的培养产物。最优选乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)FERMBP-8552(乳酸链球菌素Z产生菌)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NCIMB702054(乳酸链球菌素Z产生菌)。

应予说明，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)FERMBP-8552在2003年11月19日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1-1-1，邮政编码305-8566，现为独立行政法人制品评价技术基盘机构，日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8，邮政编码292-0818)。本说明书中，有时将该菌株称为AJ110212。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA.)。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NCIMB702054保藏于英国苏格兰阿伯丁的英国国家工业和海洋细菌保藏中心(National Collection of Industrial,Food and MarineBacteria,NCIMB Ltd.,Aberdeen,Scotland,UK.)。

植物乳杆菌(Lactbacillus plantarum)JCM1057、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)LA39JCM 11657和拜氏梭菌(Clostridium beijerinickii)JCM1390保藏于国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心微生物材料开发室(邮政编码305-0074，茨城县筑波市高野台3-1-1)。

核可包含保护剂。作为保护剂，可列举脱脂奶粉(脱脂奶)、谷氨酸钠等氨基酸盐、山梨糖醇等糖醇、海藻糖及蔗糖等双糖等。

核可包含赋形剂。作为赋形剂，只要是一般用于提高成形性的赋形剂即可，无特别限定，可列举例如碳酸钙、二氧化硅、硅酸钙、沸石、山梨糖醇、玉米淀粉、滑石、酵母膨润土、稻壳、液体石蜡、除具有使革兰氏阴性菌凝集的性质的多糖以外的多糖、单糖、双糖等。核包含赋形剂的情况下，赋形剂的量相对于100质量份的核通常优选为0.1～100质量份。

核还可包含惯用的能含于饲料的任意的添加剂。核包含任意的添加剂的情况下，任意的添加剂的量相对于100质量份的核通常优选为0.1～100质量份。

[被覆剂]

被覆剂为可形成肠溶性被膜的物质，只要是家畜摄取也安全的物质，可无特别限制地使用。被覆剂可单独使用1种，也可将2种以上组合使用。从操作的难易度和经济性的观点来看，被覆剂优选为氢化植物油、和作为通常用作片剂的被覆剂的物质的虫胶、玉米醇溶蛋白、羟丙基甲基纤维素及麦芽糖醇等。作为氢化植物油，可列举菜籽油、亚麻籽油、红花油、葵花籽油、大豆油、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、米糠油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、或椰子油的氢化油等。作为被覆剂，优选为氢化菜籽油及虫胶。氢化菜籽油的层可在短时间内使核溶出，故优选。虫胶的层在(通过胃后的)中性或碱性使核溶出，故优选。

或者，被覆剂还可以是产生这样的生理活性物质的微生物本身。

对于被覆剂而言，以本发明的被覆型饲料用添加剂的总质量为基准，优选为5～90质量％的量，更优选为20～30质量％的量。被覆剂还可包含惯用的能含于饲料的任意的添加剂。

被覆可以是单层，也可以是两层以上的多层。因为容易控制在体内的溶出度，所以优选为多层被覆。特别是如果将最外侧的层设置为氢化菜籽油的层，将与核相接的最内侧的层设置为虫胶的层，则被覆剂不会在胃中溶解，而在肠中溶解，所以优选。

本发明的被覆型饲料用添加剂在胃液中的溶出度理想的是低于50％，而在肠液中的溶出度与在人工胃液中的溶出度之差理想的是10％以上。为了实现这样的溶出度，可通过采用双层膜或多层膜、或者控制各层的被膜剂的种类和被膜厚度来进行调整。

[被覆方法]

被覆所述核的方法无特别限定，例如，通过用市售的流化床型喷雾造粒机，一边使粉末或颗粒状的核流动，一边喷雾加热至高于熔点的温度而形成为液态的被覆剂，从而可获得被覆型饲料用添加剂。如果使由粉末或颗粒状的多糖得到的被覆型饲料用添加剂呈0.05～5mm左右的大小，则操作较容易，所以优选。此外，加热被覆剂时的温度只要是被覆剂的熔点以上即可，无特别限定，优选为比被覆剂的熔点高5℃～15℃左右。

[饲料]

本发明的被覆型饲料用添加剂既可直接给予家畜，也可与玉米、大豆粉、米糠、鱼粉、啤酒酵母等赋形剂或稀释剂一起制成饲料。本发明的饲料还可包含能含于饲料的任意的添加剂。本发明的饲料适合于每天连续摄取。饲料的摄取量根据家畜的大小而不同，例如鸡的情况下，理想的是以所述生理活性物质的平均1天的摄取量相对于除被覆型饲料用添加剂以外的饲料为1～200ppm左右、优选为10～100ppm的量给予。

本说明书中，“家畜”是指人类所饲养的生物(动物)。具体来说，包括牛、绵羊、山羊等反刍动物，马、猪、鸡、狗、鱼等单胃动物。特别优选将本发明的饲料给予单胃动物。

本发明的被覆型饲料用添加剂的喂食方法无特别限定。

实施例

实验例A：膜坚固化实验

按照J.Nutr.(2009)第139(5)卷,第965-974页的记载，对试验物质的膜坚固化能力进行了评价。

将Caco-2细胞(人消化道上皮细胞(ECACC，编号86010202))接种于双层式的Transwell系统，于37℃在DMEM培养基中进行培养。培养的第12天，添加TNF-α，使紧密连接(Tight Junction)的屏障功能下降。培养的第14天，添加试验物质，在同样的温度下培养24小时后，使用Millicell ERS-2(密理博(Millipore)公司制)，测定跨膜电阻值TER(Ω·cm²)，从而评价了屏障功能的恢复(恢复率％，recovery ratio％)。结果示于图1A～图1H。

如图1A所示，确认了作为AGP的卑霉素(Avilamycin)和粘菌素(Colistin)等具有即使是低浓度也使屏障功能坚固化的功能。将仅TNF-α的添加组作为对照(control)，以恢复对比率(恢复率/对照，Recovery ratio/control)计在1.1以上的情况下判断为具有膜坚固化能力。表1中示出各生理活性物质的恢复对比率为1.1左右时的材料(Material)本身的浓度。槲皮素(Qurcetin)、葡萄籽提取物(Grape Seed Extract)(味之素株式会社制)、乳酸链球菌素A、酪氨酸(味之素株式会社制)、虾青素(帝斯曼(DSM)公司制)等也观察到使屏障功能坚固化的功能。

[表1]

*1：与对照(仅TNFα添加组)的比较值

*2：乳酸菌素(sup)：将产生菌(加氏乳杆菌LA39 JCM 11657)的培养上清液通过超滤膜(MW：3000)浓缩3倍而得的溶液

*3：植物乳杆菌素(sup)：将产生菌(植物乳杆菌JCM 1057)的培养上清液通过超滤膜(MW：3000)浓缩3倍而得的溶液

*4：味之素株式会社制“OmniVin^TM10R”。

实施例1：被覆的槲皮素(Coated-Quercetin)

1-1：被覆的槲皮素的制备

作为核，使用槲皮素(东京化成工业株式会社制的试剂(纯度95％))；作为被覆剂，使用氢化菜籽油(熔点67℃)及天然树脂虫胶。向形成为粉末或颗粒状的核喷雾规定量的通过加热至高于熔点的温度而形成为液态的被覆剂，从而获得被覆型饲料用添加剂。被覆通过以下方式进行：相对于77质量份核喷雾作为第一层(内侧层)的5质量份虫胶、作为第二层(外侧层)的17质量份氢化菜籽油。

1-2：耐酸性及肠溶性试验

(人工胃液处理)向使用默克密理博(Merck Millipore)公司制的纯水制造装置制造的纯水中加入0.2质量％NaCl和0.2质量％胃蛋白酶(pepsin)(来自猪胃粘膜(fromPorcine stomach Mucosa)，1:5000，2500单位/mg)，调节至pH2后，投入上述1-1中制备的被覆型饲料用添加剂，在37℃进行了2小时的酶处理。通过自动连续测量在此期间的光密度而测定溶出度。应予说明，“2小时”设想为从饲料到达鸡的胃开始至通过鸡的胃为止的时间。

(人工肠液处理)人工胃液处理后，加入0.2％胰蛋白酶(trypsin)(来自猪胰腺(from Porcine Pancreas)，1:5000，4500单位/mg)，调节至pH6后，在37℃进行了2小时的酶处理。通过自动连续测量在此期间的光密度而测定溶出度。应予说明，“2小时”设想为从饲料到达鸡的肠开始至通过鸡的肠为止的时间。

pH调节中使用了盐酸及氢氧化钠。光密度使用Advantec株式会社制的生物光学记录仪(Biophoto-recorder)TVS062CA以OD660nm进行了测定。

结果示于图2。根据图2，两层被覆时，胃液处理开始后2小时的溶出度被抑制为25％，另一方面在肠液处理中溶出了65％。由该结果可知，外层施以氢化菜籽油层、内层施以虫胶层的饲料用添加剂具有耐酸性及肠溶性，释放控制优异。

1-3：鸡生长试验

将通过上述1-1的两层被覆法制备的被覆的槲皮素以核材料的量成为20ppm、200ppm的条件添加至表2所示的组成的饲料基质中，得到了饲料组合物。在空地饲养的鸡舍中，使用1个区划、25只肉鸡的新生雏鸡，喂食饲料组合物，以3份重复(triplicate)在0～21日龄饲养22天，对鸡的体增重(Body Weight Gain，BWG)及饲料转化率(Feed ConversionRatio，FCR＝Feed/BWG)进行了评价。应予说明，作为阳性对照，使用了作为惯用的抗菌性促生长物质(Antimicrobial Growth Promoter，AGP)的卑霉素。卑霉素直接使用了市售品(ELANCO公司的Surmax200(注册商标)，无被覆)。

结果以阴性对照为100示出。结果示于表3。尽管已知未被覆的槲皮素对肠道菌群显示负面作用(J.Nutr.139：965-974，2009.)，但被覆的槲皮素观察到体增重效果、饲料转化率改善效果。应予说明，未被覆的槲皮素对肠道菌群显示负面作用，因此，未进行使用未被覆的槲皮素的鸡生长试验。

[表2]

*饲料组成

[表3]

实施例2：被覆的Phe及被覆的Tyr

2-1：被覆的Phe及被覆的Tyr的制备

按照实施例1·1-1的记载制备了被覆的Phe及被覆的Tyr。

2-2：耐酸性及肠溶性试验

使用以上得到的被覆的Tyr，与实施例1·1-2同样地操作，进行了耐酸性及肠溶试验。结果示于图3。

2-3：鸡生长试验

将以上得到的被覆的Phe及被覆的Tyr以核材料的量成为200ppm的条件添加至表2所示的组成的饲料基质中，按照实施例11-3记载的方法对鸡的体增重效果及饲料转化率进行了评价。结果示于表4。

Phe及Tyr即使未被覆也确认到一定程度的体增重效果，但代谢组(metabolome)分析的结果中，肠道内容物和血液中未检出Phe或Tyr。因此，可认为被覆的Phe及被覆的Tyr在粪便中被肠道细菌同化，并且在血液中也被迅速代谢。因此，可认为被覆的氨基酸比未被覆的氨基酸更稳定地发挥效果。

[表4]

2-4：鸡中的采用沙门氏菌感染试验的L-Tyr及被覆的L-Tyr的评价将与实施例2-1同样地操作而制备的被覆的Tyr及Tyr以核材料的量成为200ppm的条件添加至表2所示的组成的饲料基质中，制成饲料。将1日龄肉鸡投入感染试验用饲养设备(6只/重复，2份重复/试验组)后，将肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica，SE)口服给予2日龄肉鸡，给予试验饲料21天，对鸡的体增重效果及饲料转化率进行了评价。应予说明，作为阳性对照，使用了作为惯用的抗菌性促生长物质的恩拉霉素(Enramycin)。恩拉霉素直接使用了市售品(株式会社科学饲料研究所制的“恩拉霉素F-80”，无被覆)。

结果以阴性对照为100示出。结果示于表5。

[表5]

其结果是，未实施被覆的酪氨酸(“L-Tyr”)无效果，但被覆的Tyr显示了与恩拉霉素同等的体增重效果及饲料转化率改善效果。

实施例3：被覆的乳酸链球菌素A(Coated-NisinA)

3-1：被覆的乳酸链球菌素A的制备

作为核，使用乳酸链球菌素A(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司制的试剂(乳酸链球菌素含量2.5质量％，余量为氯化钠及变性乳固体(balance sodium chloride anddenatured milk solids)))；作为被覆剂，使用氢化菜籽油(熔点67℃)及天然树脂虫胶。按照实施例11-1的记载，得到了两层被覆的被覆型饲料用添加剂。

3-2：耐酸性及肠溶性试验

使用以上制成的被覆的乳酸链球菌素A，与实施例11-2同样地操作，进行了耐酸性及肠溶试验。结果示于图4。

3-3：鸡生长试验

将3-1中制成的被覆的乳酸链球菌素A以核材料的量成为1ppm、10ppm的条件添加至表2所示的组成的饲料基质中，对鸡的体增重效果及饲料转化率进行了评价。在空地饲养的鸡舍中，使用1个区划的25只肉鸡的新生雏鸡，以3份重复从0日龄饲养至21日龄。结果示于表6。尽管乳酸链球菌素因胃酸而活性下降、并且因消化酶胰蛋白酶而完全失活，但被覆的乳酸链球菌素A观察到体增重效果、饲料转化率改善效果。

[表6]

3-4：鸡中的采用沙门氏菌感染试验的被覆的乳酸链球菌素A及被覆的普鲁兰多糖 的评价

将3-1中制备的被覆的乳酸链球菌素A单独、或与被覆的普鲁兰多糖组合，以各核材料的量成为10ppm的条件添加至表2所示的组成的饲料基质中，制成饲料。将0日龄肉鸡投入感染试验用饲养设备(2份重复/试验组，6只/重复)后，将肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica，SE)以107个/只用探针投入2日龄肉鸡的嗉囊内，给予试验饲料21天，对体增重效果及饲料转化率进行了评价。结果示于表7。

[表7]

其结果是，“被覆的乳酸链球菌素组”和“被覆的乳酸链球菌素+被覆的普鲁兰多糖组”均显示了体增重效果及饲料转化率改善效果。

3-5：鸡中的采用沙门氏菌感染试验的乳酸链球菌素A及被覆的乳酸链球菌素A的 评价

将与实施例3-1同样地操作而制备的被覆的乳酸链球菌素A及乳酸链球菌素A按照表2添加至饲料中，制成饲料。将0日龄肉鸡投入感染试验用饲养设备(6只/重复，2份重复/试验组)后，将肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica，SE)口服给予2日龄肉鸡，给予试验饲料21天，对体增重效果及饲料转化率进行了评价。应予说明，作为阳性对照，使用了作为惯用的抗菌性促生长物质的恩拉霉素(Enramycin)。恩拉霉素直接使用了市售品(株式会社科学饲料研究所制的“恩拉霉素F-80”，无被覆)。

结果示于表8。

[表8]

其结果是，未实施被覆的乳酸链球菌素A无效果，但被覆的乳酸链球菌素A显示了与恩拉霉素同等的体增重效果及饲料转化率改善效果。

实验例B：细菌素的抗菌活性评价、抗菌谱评价

B-1：最低抑菌浓度的测定

测定AGP和乳酸链球菌素的最低抑菌浓度并进行了比较。

作为乳酸链球菌素Z产生菌，使用了乳酸乳球菌AJ110212(FERM BP-8552)。在加入于5L容量的坂口烧瓶(Sakaguchi flask)的培养基(BD Difco公司制的乳杆菌(Lactobacilli)MRS肉汤1L)中，将所述乳酸链球菌素Z产生菌在30℃以100rpm进行了培养。培养以20小时为基准，对于培养液而言，通过分光光度计(Advantec株式会社制的生物光学记录仪TVS062CA)以波长610nm测定光密度(Optical density)，以26倍稀释进行制备使得成为0.1以上。对所得的培养液进行离心分离(6000G×10min，4℃)，分离了菌体组分(cellfraction)(湿菌体，Wet Cell)。

作为检验菌，利用了以下的菌株。培养基、培养温度记载于菌株末尾的括号内。MRS培养基使用Difco公司的乳杆菌MRS肉汤，GAM培养基和LB培养基使用日水制药株式会社的产品，NB培养基使用Difco公司的产品。

革兰氏阳性菌

·嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AJ13778(MRS，37℃，对应于以登录号(accession number)JCM1132保藏的菌株)

·唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)AJ110152(MRS，37℃，对应于以登录号JCM1231保藏的菌株)

·嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)AJ110569(GAM，37℃，对应于以登录号JCM1207保藏的菌株)

·脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)JCM11019(GAM，37℃)

·大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655(LB，37℃，对应于以登录号ATCC700926保藏的菌株)

·产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)AJ3350(GAM，37℃，对应于以登录号ATCC10873保藏的菌株)

革兰氏阴性菌

·粪肠球菌(Enterococcus faecalis)AJ110149(MRS，30℃，对应于以登录号JCM5803保藏的菌株)

·肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)AJ2785(NB，37℃，对应于以登录号IAM1648保藏的菌株)。

应予说明，以JCM开头的登录号特定的细菌的保藏机构为国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心微生物材料开发室(邮政编码305-0074，茨城县筑波市高野台3-1-1)。以ATCC开头的登录号特定的细菌的保藏机构为美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国模式培养物保藏中心。以IAM开头的登录号特定的细菌的保藏机构为日本国东京都东京大学分子细胞生物科学研究所分子细胞研究中心IAM培养物保藏中心(IAM CultureCollection,Center for Cellular and Molecular Research,Institute of Molecularand Cellular Biosciences,The University of Tokyo,Tokyo,Japan)(保藏中心被转移至JCM，collection transferred toJCM)。

最低抑菌浓度通过采用Mayr-Harting，A.等，Methods Microbiol.1972，7A，第315-422页中记载的平板斑点草坪法(Spot-on-lawn method)的抗菌活性测定而算出。使用培养液的情况下，以抑菌圈的大小进行了定性判断。结果示于表9。

[表9]

AGP与乳酸链球菌素的最低抑菌浓度的比较数据

最低抑菌浓度(mg/mL)

″ND"：表示未检测到效果(未检出)。

B-2：抗菌谱的测定

对于试剂中难以获得的化合物，于30℃在Difco公司制的乳杆菌MRS肉汤培养基中培养下述的产生菌，制备含细菌素(Bacteriocin)的培养液。

·细菌素/I类：乳酸链球菌素使用实施例3·3-1中采用的乳酸链球菌素A和乳酸链球菌素Z(产生菌为乳酸乳球菌NCIMB702054)。枯草菌素产生菌使用枯草芽孢杆菌ATCC6633。耐久霉素使用西格玛奥德里奇公司制的试剂(1mg/ml)。

·细菌素/IIb类：植物乳杆菌素产生菌使用植物乳杆菌JCM1057。

·细菌素/IIc类：乳酸菌素A产生菌使用加氏乳杆菌LA39 JCM11657，环状菌素A产生菌使用拜氏梭菌JCM1390。

抗菌谱使用将培养液上清浓缩10倍而得的溶液，通过平板斑点草坪法(Spot-on-lawn method)进行了评价。调查的结果示于表10。

[表10]

细菌素的抗菌谱

乳酸链球菌素A(1mg/m1)，耐久霉素(1mg/ml)，其他：细菌素产生菌

″+″至″+++++″：表示抗菌效果的强度。″+″越多，表示效果越强。

″ND″：表示未检测到效果(未检出)。

由表9和表10与表1的比较可知，膜坚固化功能与抗菌活性的有无或其强弱无关。

实施例4：被覆的细菌素产生菌益生菌(Probiotics)

4-1：细菌素产生菌的培养

实施例3中使用了乳酸链球菌素A，但实施例4中作为乳酸链球菌素Z产生菌，使用了乳酸乳球菌FERM BP-8552。在加入于5L容量的坂口烧瓶的培养基(BD Difco公司制的乳杆菌MRS肉汤1L)中，将所述乳酸链球菌素Z产生菌在30℃以100rpm进行了培养。培养以20小时为基准，培养液通过分光光度计(Advantec株式会社制的生物光学记录仪TVS062CA)以波长610nm测定光密度，以26倍稀释进行制备使得成为0.1以上。

同样地，得到了枯草菌素和植物乳杆菌素的菌体组分。应予说明，作为枯草菌素产生菌，使用了枯草芽孢杆菌ATCC 6633。作为植物乳杆菌素产生菌，使用了植物乳杆菌JCM1057。

4-2：细菌素产生菌粉末的制备

将4-1中得到的乳酸链球菌素Z的菌体组分添加至120ml保护剂中，通过喷雾干燥机(入口温度80℃，出口温度50℃)或减压冷冻干燥进行了粉体化。保护剂如下。

(A)脱脂乳(Skim milk)10质量％(BD公司制)+谷氨酸钠盐3质量％(MSG，AJICO公司制)

(B)MSG 3质量％、山梨糖醇10质量％、海藻糖10质量％、蔗糖10质量％(MSG为AJICO公司制，MSG以外为和光纯药株式会社制)

对所得的乳酸链球菌素Z产生菌粉末的活菌数进行了测定。活菌数的测定如下进行：将0.01g粉体样品悬浮于1ml生理盐水，依次进行10倍生理盐水稀释，将0.1ml涂抹于MRS琼脂平板，于30℃培养24小时，根据生成的菌落数测定菌落形成单位(cfu)/g。

同样地，得到了枯草菌素和植物乳杆菌素的产生菌粉末，测定了产生菌。

4-3：被覆的乳酸链球菌素Z产生菌粉末、被覆的枯草菌素产生菌粉末和被覆的植 物乳杆菌素产生菌粉末的制备

将4-2中制备的乳酸链球菌素Z产生菌粉末与实施例11-1中的记载同样地进行被覆，获得被覆的乳酸链球菌素Z产生菌粉末。

同样地，制成被覆的枯草菌素产生菌粉末和被覆的植物乳杆菌素产生菌粉末。

4-4：耐酸性及肠溶性试验

将4-3中得到的进行了被覆的细菌素产生菌粉末分别供于实施例11-2中记载的人工胃液处理和人工肠液处理。

关于耐酸性，通过测定人工胃液处理和人工肠液处理后的各细菌素的活菌数和抗菌活性而进行了评价。活菌数按照4-2的记载进行了测定。抗菌活性按照实验例B·B-2的记载进行了测定。结果示于表11。应予说明，表中的“+”等和“ND”的含义与关于表10的记载相同。

[表11]

4-5：使用被覆的乳酸链球菌素Z产生菌粉末的鸡生长试验

将4-3中制成的被覆的乳酸链球菌素Z产生菌粉末以达到下表的活菌数的条件添加至表2所示的饲料基质中，按照实施例11-3中记载的方法对鸡的体增重效果及饲料转化率进行了评价。

[表12]

实施例5：鸡生长试验

制备了三个条件的饲料，即：向标准饲料中添加了抗生素(拉沙里菌素(lasalocid)0.05质量％，卑霉素0.01质量％)的含药饲料(PC)、向标准饲料中添加了2％与实施例4-1同样地培养乳酸乳球菌NCIMB8780而得的乳酸链球菌素A培养液的PRB添加饲料(乳酸链球菌素(Lc))、无药饲料(仅标准饲料)(NC)，给予新生雏鸡。应予说明，对于1个条件的饲料，使用10只科宝(Cobb)肉鸡的雄性新生雏鸡，以3份重复进行实验，对鸡的体增重效果及饲料转化率进行了评价。无药组(NC)使用标准饲料(ME3160kcal，CP 22质量％，不使用抗生素)。对于PC和乳酸链球菌素(Nisin)添加组，向标准饲料(ME3160kcal，CP 22质量％)中分别添加了2质量％的抗生素(拉沙里菌素和卑霉素)或含乳酸链球菌素Z的溶液。

[表13]

*：抗生素：添加了拉沙里菌素0.05％、卑霉素0.01％。

**：关于乳酸链球菌素，添加了2％乳酸乳球菌培养液。