具体实施方式

本发明涉及用于从样品中定性和/或定量检测ADA的新颖方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于检测样品中的抗药抗体(ADA)的方法。这样的方法包括：a)在高温下预处理所述样品以解离所述样品中的ADA:药物免疫复合物；b)通过基质从所述样品中分离出所述ADA；c)使用缓冲液从所述基质中回收所述ADA；以及d)在基于细胞的测定或体外测定中检测所述ADA。任选地，所述高温在60℃与68℃之间(例如，约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃或约68℃)。任选地，将所述样品在所述高温下预处理约30分钟与约2小时之间的时间(例如，约30-60分钟)，如约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟。

在某些特定的实施方案中，所述ADA对酸处理敏感。在某些特定的实施方案中，所述药物具有比所述ADA低的热稳定性。任选地，所述药物选自抗体或其片段、核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、脂质或小分子化合物。任选地，所述样品是选自以下的生物样品：体液、粘液分泌物、唾液、血液、全血、血浆和血清。任选地，所述样品来自已经用所述药物治疗过的受试者。

在某些特定的实施方案中，通过与生物素化的药物接触，然后与链霉亲和素包被的基质接触，从所述样品中分离出所述ADA。可替代地，通过与所述药物偶联的基质从所述样品中分离出所述ADA。例如，所述基质是磁珠。

在某些特定的实施方案中，在基于细胞的测定中检测所述回收的ADA。例如，这样的测定包括：i)在所述药物的存在下将所述回收的ADA添加到细胞中；以及ii)通过测量所述药物对所述细胞的活性降低来检测所述ADA。

在某些特定实施方案中，在体外测定中检测所述回收的ADA。例如，这样的测定包括：i)使所述回收的ADA与用可检测标记物标记的所述药物接触；以及ii)通过测量所述可检测标记物来检测所述ADA。举例而言，所述可检测标记物是选自以下的标记物：放射性同位素、酶、荧光标记物、化学发光标记物和电化学发光标记物以及用于酶促检测反应的底物。

在某些特定的实施方案中，所述药物是抗体片段，如结构域抗体。在某些特定的实施方案中，所述药物是聚乙二醇化的。

在某些特定的实施方案中，所述药物是鲁利珠单抗(即，聚乙二醇化的抗CD28结构域抗体，也称为BMS-931699)。例如，在约62℃的高温下预处理此药物。例如，在所述血清样品中检测所述ADA。

为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。在整个具体实施方式中阐述了另外的定义。

“抗药抗体”或“ADA”是与药物的任何区域特异性结合的抗体。例如，抗药抗体可以是抗体或其片段，其可以针对药物抗体的任何区域，例如抗体的可变结构域、恒定结构域或糖结构。此类抗药抗体可能在药物疗法期间作为患者的免疫原性反应出现。ADA可以是任何人类免疫球蛋白同种型(例如，IgM、IgE、IgA、IgG、IgD)或IgG亚类(IgG1、2、3和4)的ADA。ADA包括来自任何动物来源(包括例如人或非人动物(例如兽医)来源)的ADA。

为了本说明书的目的，术语“Nab”或“中和抗体”是指ADA的一个子集，其可以与治疗性药物的药理活性区域结合，以抑制或完全中和其临床功效。

在本发明的上下文中，术语“患者”是指患有疾病或怀疑患有疾病的任何受试者，优选哺乳动物，更优选人。如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如，人或非人动物受试者)。在一些情况下，所述受试者是哺乳动物。在一些情况下，如本文所用，术语“受试者”是指人(例如，男人、女人或儿童)。在一些情况下，如本文所用，术语“受试者”是指动物模型研究的实验室动物。

如本文所用，术语“生物样品”或“样品”是指从患者获得或衍生的样品，其包含患者衍生的免疫球蛋白，因此可以称为免疫球蛋白样品。举例来说，生物样品包含选自以下的材料：体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、唾液、脑脊液(CSF)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、眼睛的液体(例如，玻璃体液、房水)、淋巴液、淋巴结组织、脾组织、骨髓以及从这些组织中的一种或多种衍生的富含免疫球蛋白的级分。在一些实施方案中，所述样品是或包含血清，或者是从血清或血液衍生的富含免疫球蛋白的级分。所述样品是体液或身体组织，或者可以从体液或身体组织衍生(获得)。在一些实施方案中，所述样品从已经暴露于药物(如反复暴露于同一种药物)的受试者获得。在其他实施方案中，所述样品从最近未暴露于药物的受试者获得，或者在计划施用药物之前从所述受试者获得。

如本文所用，鲁利珠单抗是用40kDa分支聚乙二醇(PEG)改变形式的抗人CD28受体拮抗剂Vk结构域抗体(dAb)，其正在开发用于皮下(SC)治疗自身免疫和炎性疾病(例如，系统性红斑狼疮)。例如，已经在美国专利号8,168,759、8,454,959和9,085,629中引用了鲁利珠单抗。

如本文所用，“CD28活性”是涉及CD80、CD86和/或另一种配体与CD28结合或由其产生的活性，并且包括但不限于CD28介导的细胞信号传导的激活。CD28活性还包括T细胞增殖的诱导和T细胞对细胞因子(例如，白介素2(IL-2))分泌的诱导。

“结构域抗体”意指包含抗体的重链(VH)或轻链(VL)的免疫球蛋白可变结构域的序列特征并特异性结合抗原的折叠多肽结构域。因此，“结构域抗体”包括完整的抗体可变结构域以及修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已经被不是抗体可变结构域所特有的序列替换；或者已经被截短或包含N末端或C末端延伸的抗体可变结构域；以及可变结构域的折叠片段和全长结构域的靶抗原特异性。在本文中“dAb”与“结构域抗体”可互换使用。

如本文所用，被术语“标记”修饰的实体(例如，抗体、抗药抗体、药物、蛋白质、酶、抗体、抗体片段、多结构域生物治疗剂(例如，抗体药物缀合物)或相关种类)包括与另一种分子缀合的任何实体或凭经验可检测的化学实体(例如，“可检测标记物”)。适合作为标记实体的标记物的化学种类包括但不限于酶；荧光染料；量子点；光学染料；发光染料；和放射性核素。

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当解释为进一步的限制。将在整个本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。

实施例1

1.介绍

生物治疗剂(biologic therapeutic或biotherapeutic)已经被批准用于治疗许多病状。尽管与传统的小分子相比具有许多优势，但是生物治疗剂仍具有诱导针对自身的免疫反应的可能，通常被称为免疫原性(1)。免疫原性是人体的自然防御机制，并且通常具有保护作用。作为适应性免疫反应的一部分，当宿主遇到外源蛋白或改变的自身抗原(如感染性病原体、肿瘤抗原或疫苗)时，机体可能会产生针对这些外来/改变的自身蛋白的抗体。然而，就生物治疗剂而言，这些药物特异性抗体(通常称为抗药抗体(ADA))可能诱导广泛的安全相关事件，范围从局部输注反应到更严重的不良事件，如危及生命的超敏反应和纯红细胞再生障碍(PRCA)(2,3)。另外，ADA可能导致药物功效降低(4-6)。

由ADA诱导的药物功效降低是由于药物清除加快或ADA的特殊亚群(中和ADA或NAb)所致，后者通过阻止药物与其靶标结合或由于位阻抑制结合后的下游信号传导而降低了治疗功效。卫生当局目前建议，应尽可能实施基于细胞的功能性NAb测定来表征ADA的中和潜能(7)。在常规的基于细胞的功能性NAb测定中，将固定量的指定为系统药物的药物添加到细胞中作为对照；由于存在NAb而引起的任何统计学上显著的信号变化都意味着样品中存在中和活性。在来自治疗的循环药物的存在下，并且取决于样品中NAb与药物的摩尔比，NAb可能与药物复合并且在生物测定中不再可与系统药物结合；这导致减少的或假阴性的NAb检出。对于基于细胞的功能性NAb生物测定，患者样品中高水平的mAb治疗剂特别成问题(8)。

另外，临床血清样品可能含有基质组分(生长因子、细胞因子等)，其经常直接影响细胞并且可能会影响功能性测定的读数(不管NAb存在与否)。虽然来自功能性生物测定读数中的干扰因素的小扰动可能是可容忍的，但是受试者间以及时间的可变性可能使得无法准确表征样品中NAb的存在。

已经对珠提取与酸解离(BEAD)样品预处理程序进行了修改和优化，以通过使用酸解离药物/ADA免疫复合物，然后添加过量的生物素化的药物竞争ADA结合来处理药物和基质干扰。然后通过链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素化的药物/ADA复合物，同时通过洗涤去除血清因子和药物(9)。尽管已经成功地将其应用于多个项目(10)，但是与聚乙二醇(PEG)缀合的生物治疗剂可能与这种基于酸解离的提取不兼容，如鲁利珠单抗的情况。鲁利珠单抗是用40千道尔顿(kDa)分支PEG改变形式的抗人分化群28(CD28)受体拮抗剂免疫球蛋白轻链可变区(Vκ)结构域抗体(dAb)。可替代地，我们通过在62℃下加热样品来利用结构域Ab的较低热稳定性，这不仅破坏了药物/ADA免疫复合物，而且选择性地使结构域Ab药物变性。作为破坏药物/ADA复合物的第一步，在BEAD方法中使用酸；中和后，过量的循环药物与生物素-药物竞争ADA结合，这需要大得多的量的生物素-药物才能胜过药物。因此，在62℃下结构域Ab药物的不可逆变性优于基于酸的BEAD方法，因为所需的生物素-药物要少得多。另外，使用热代替强酸来消除酸处理的第一步可以保留对酸敏感的NAb种类。

2.材料与方法

2.1.试剂

RPMI-1640、热灭活的胎牛血清(FBS)、G418、HEPES和丙酮酸钠购自Gibco/LifeTechnology(纽约州格兰德岛)。NeoLite萤光素酶报告基因测定系统购自PerkinElmer(马萨诸塞州沃尔瑟姆)，并且Hi-Sur Mag链霉亲和素珠购自OceanNanotech(加利福尼亚州圣地亚哥)。合并的人血清、个体正常人血清和个体患病狼疮人血清购自Bioreclamation(纽约州希克斯维尔)。Jurkat T细胞和Raji B细胞系最初从ATCC获得，并且对Jurkat T细胞进行了进一步修饰以产生稳定表达IL-2驱动的萤光素酶的Jurkat.CA细胞。中和阳性对照是针对药物产品的专有单克隆小鼠亲和纯化抗体。

2.2.细胞培养

使表达IL-2驱动的萤光素酶的稳定转染的Jurkat细胞(Jurkat.CA)和Raji细胞在通风的帽式细胞培养瓶(BD Falcon，新泽西州富兰克林湖)中在37℃、5％CO2和95％相对湿度(RH)下扩增。两种细胞的生长培养基都是具有10％热灭活的FBS的RPMI 1640。Jurkat.CA细胞系生长培养基还含有400μg/mL G418、HEPES和丙酮酸钠。两种细胞系的冷冻培养基都是补充有10％DMSO的纯FBS。解冻后，将细胞洗涤一次并重悬于生物测定培养基(补充有10％FBS的RPMI-1640培养基)中，并且直接在生物测定中使用。

2.3.用于珠提取和酸解离(BEAD)程序的测试对照的制备

将不同浓度的NAb PC掺入有或没有5μg/ml药物产品的合并的或个体健康人血清中，并且在室温下旋转孵育4小时，以允许形成免疫复合物。也将不同浓度的药物产品掺入人血清中并以相同方式制备。然后将样品等分，并且在-70℃下冷冻直至使用。

2.4.珠提取和酸解离(BEAD)以及珠提取和热解离(BEHD)程序

我们将先前公开的固相或珠提取与酸解离(BEAD)程序稍作修改来提取ADA(9)。简而言之，首先将100μL上文制备的人血清样品和对照样品与等体积的400mM甘氨酸-HCl(pH2.0)混合，并且在摇床(Labnet Orbit P4，新泽西州伍德布里奇)上在室温(RT)下以1200rpm孵育60min。然后将每个样品用含有50μg/mL生物素化的药物的28μL 1.8M Trizma碱(pH 8.8)中和，并且在摇床上以1200rpm孵育90min。可替代地，将100μL对照和样品添加到KingFisher深孔96孔聚丙烯板中，用板密封器覆盖，并且在设置为62℃并以400rpm摇动的Eppendorf Thermomixer R中孵育40-60min。在将深孔板冷却约15分钟之后，然后添加28μL生物素化的药物(在DPBS中的1％BSA中稀释，50μg/mL)，并且将样品板在2℃-8℃下以1000rpm摇动孵育过夜。然后使来自酸或加热处理的与药物产品解离并与生物素-药物结合的ADA固定在250μg链霉亲和素包被的磁珠上(以10mg/mL添加25μL并在室温下以1000-1200rpm摇动孵育60分钟)。然后使用KingFisher磁粒处理器(Thermo Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)，通过磁板捕获珠复合物，用600μL PBST洗涤两次并用60μL 2x RPMI-1640(pH 2.3)洗脱。将50μL最终洗脱的溶液转移到新的含有22μL 100mM HEPES(pH 8.2)的96孔聚丙烯板中。

2.5.用于检测中和活性的生物测定

使用IL-2-萤光素酶生物测定来评估抗治疗性蛋白质中和抗体在样品中的不存在、存在或相对水平。简而言之，将30μL来自第2.4节的中和的BEAD洗脱物与15μL 250ng/mL的系统药物在96孔半面积白板中在室温下一起孵育20-40min。将Jurkat.CA细胞解冻，洗涤并在生物测定培养基(RPMI 1640中的10％FBS)中重悬至终浓度为3.0x10⁶个细胞/mL，并且将15μL添加到板中并在室温下再孵育20min。在最后一步，将Raji细胞解冻，洗涤并在含有2.5μg/mL抗人CD3 Ab的生物测定培养基中重悬至终浓度为1.5x10⁶个细胞/mL，将其15μL添加到板中，混合，然后转移到设置为37℃、5％CO₂和95％湿度的培养箱中持续4h。孵育后，将75μL Neolite萤光素酶溶液添加到每个孔中，混合，放置在以500rpm摇动的黑暗的室温培养箱中，离心，然后使用EnSpire(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)读板器以默认96孔发光方案读取。

2.6.用于蛋白质热稳定性的DSF

在UNcle平台(Unchained Labs Inc.)上进行并发静态光散射的差示扫描荧光法。简而言之，将纯化的蛋白质样品在DPBS缓冲液(pH 7.2)(Thermofisher)中稀释至1mg/mL，并且将9μL的每个样品一式三份地装入微量比色皿阵列中。在运行开始之前，通过在线动态光散射确定样品聚集的程度。通过使用1℃的步长梯度从20℃加热到85℃(在每一步有30sec的温度稳定)测量本征荧光的变化来确定温度诱导的蛋白质解折叠。在UNcle软件中使用重心荧光(以纳米计)作为温度(以摄氏度计)的函数来计算Tm(解折叠曲线的中点，对应于解链温度)。记录在266nm和473nm处的并发静态光散射，以在实验过程期间检测和控制聚集体的形成。

2.7统计方法

2.7.1控制精度评估

使用在方差分析(ANOVA)模型背景下的方差分量方法来计算对照样品的精度估算值(11)。ANOVA模型包括分析人员、测定日和一天之内的测定板的因素。在ANOVA模型中计算出分析人员间、日间、板间和板内方差的估算值，并且将各自表示为标准偏差(SD)，然后表示为变异系数(CV[％]＝100*SD/平均值)。将总标准偏差(总SD)计算为这些方差估算值之和的平方根。使用总CV(％)(100*总SD/平均值)来设置板的可接受性。

2.7.2割点评估

在6种不同情况下测定每个狼疮患者样品，由3位分析人员进行两次测定。使用公开的方法计算NAb测定割点(12)。为了校正跨天的RLU的板间波动，计算出患者样品RLU与板阴性对照(NegC)RLU的比率(各自的平均重复)。由于使用比率来进行割点评估，因此计算了来自同一板的患者样品RLU与NegC RLU之间的相关性，并且对数据进行了绘制。正相关将支持使用比率计算方法。

为了计算NAb测定割点，评估了样品比率分布的正态性。基于每个患者样品的个体比率评价异常值。如果值低于分布的第25个百分位数减去四分位数间距的3倍，或者值超过分布的第75个百分位数加上四分位数间距的3倍，则它们被认为是异常值。

在排除异常值并进行对数变换以得到正态性之后，将NAb测定割点计算为比率的单侧参数99％区间的下界。利用的方程的形式为：

NAb测定割点＝EXP(平均值_比率-z*总SD_比率)。

在方程中，“平均值_比率”是排除异常值后的对数比的平均值；“z”是来自正态分布的“z得分”的值，对应于下方1％尾部正态曲线下面积(2.33)；并且“总SD_比率”是排除异常值后的比率的对数的总标准偏差的估算值。“EXP”是表达式的反对数。

3.结果

3.1.在细胞测定中治疗剂诱导的IL-2产生抑制

鲁利珠单抗是用40kDa分支PEG改变形式的抗人CD28拮抗性免疫球蛋白轻链可变区(Vκ)dAb。它是T细胞激活的有效抑制剂，并且是纯拮抗剂，如通过体外激动剂、共刺激和交联实验所确定的(13-15)。如图1A所示，来自连续培养的Jurkat.CA细胞当被激动性抗CD3Ab和Raji B细胞(其提供CD80/CD86来与Jurkat.CA细胞上的CD28接合)激活时产生了高水平的IL-2启动子驱动的萤光素酶报告物。鲁利珠单抗以剂量依赖性方式抑制了T细胞激活和萤光素酶报告物产生(图1A)。

为了使下游样品测试更容易，将冷冻的细胞解冻并立即用于测定中，以查看冷冻的细胞是否可以用作即用型板试剂，从而消除对大约3-7天的等待时间才能使冷冻的细胞恢复并开始连续细胞培养维持的需要。当与来自连续培养的细胞相比时，在新鲜解冻的细胞中发现了高得多的原始信号(图1B)。不同数量和比率的Jurkat.CA和Raji细胞显示出不同的原始信号、反应窗口以及灵敏度，如通过每条曲线的EC50所指示的。每个孔选择了45000个Jurkat.CA细胞和22500个Raji细胞用于进一步的测定开发和优化，以平衡原始信号和所需的总细胞数。(图1B和表1)。

表1.在不同数量和比率的Jurkat和Raji细胞的情况下IL-2萤光素酶产生的原始信号

3.2.针对鲁利珠单抗的中和Ab挽救IL-2的产生

在细胞测定中筛选了一组潜在的NAb阳性对照(PC)，并且选择了最有效的克隆。如图2A所示，兔多克隆Ab(pAb)和小鼠单克隆Ab(mAb)PC在0.4μg/mL鲁利珠单抗(即系统药物，其是药物在细胞测定中的最终浓度)的存在下都以剂量依赖性方式挽救了萤光素酶报告物的表达。为了进行最灵敏的NAb测定，系统药物水平应当尽可能低，同时仍具有良好的信噪比(S/N)和低变异系数(CV)。正如所预期的，在不存在NAb PC的情况下，药物浓度越高，萤光素酶报告物的信号越低(图2B和表9)。尽管对于整个NAb曲线，0.3μg/mL的系统药物具有最高的S/N，但是应当注意NAb曲线的下端，在此处决定了NAb测定的灵敏度。因此，选择了0.25μg/mL的系统药物进行进一步的测定优化；在此系统药物水平下，0.125、0.25和0.5μg/mL的NAb始终具有比其他两种药物浓度高的S/N(表2)。

表2.不同浓度的药物的NAb曲线。此处仅显示了具有相似结果的三个重复实验中的一个。

3.3.在BEAD处理的情况下在鲁利珠单抗的存在下NAb的回收率低

鲁利珠单抗正在开发用于治疗自身免疫和炎性疾病，其中患者经常在循环中表达大量炎性细胞因子(14)。如图3所示，当将十个个体系统性红斑狼疮(SLE)血清在测定培养基中稀释10倍并添加到基于细胞的测定中时，当与仅培养基的对照样品相比时，一个样品(S8)的萤光素酶原始信号增加超过50％，并且四个样品(S2、S3、S5和S9)的萤光素酶原始信号抑制超过50％。这表明10倍稀释液不足以稀释掉SLE血清中的所有干扰因子。然而，进一步稀释导致NAb测定的灵敏度降低，因为样品中的NAb也将被稀释掉。例如，如果测定需要20倍稀释液，并且如果测定在稀释后只能检测到0.5μg/mL NAb，则在纯检测血清中NAb测定的灵敏度可能潜在地高达10μg/mL。临床样品中预期的鲁利珠单抗水平高达5μg/mL，这意味着如果将样品在不进行任何提取的情况下稀释并添加到测定中，则可能无法检测到低于15μg/mL的NAb(鲁利珠单抗的分子量约为50KDa，并且15μg/mL NAb将全部与5μg/mL鲁利珠单抗以1:1的摩尔比形成免疫复合物且在测定中将无法结合系统药物)。首先测试了珠提取与酸解离(BEAD)，以查看是否可以通过酸处理将NAb PC与样品中的药物解离，然后与生物素化的药物/珠复合物结合并从链霉亲和素包被的磁珠上洗脱下来。这种提取将不仅除掉样品中过量的药物，而且除掉可能干扰测定的基质因子。尽管BEAD已经成功应用于多种基于细胞的功能性NAb测定，但是对于鲁利珠单抗NAb测定，BEAD处理后的NAb活性较差。如果我们将相对NAb活性的任意割点设置为1.3，则在5μg/mL药物的存在下NAb检出的灵敏度将约为8μg/mL(表2且数据未显示)。在证实克隆13H4是酸稳定的且优化了提取的每个关键步骤(如生物素-药物的量增加、链霉亲和素-磁珠的量增加以及在不同pH下酸处理的长度不变)之后，没有实现改善(数据未显示)。尽管鲁利珠单抗具有12kDa的小蛋白质骨架，但是它具有40kDa的支化PEG部分，其占据的巨大空间等于500kDa的蛋白质。假设在低pH下，分支PEG部分可以防止(例如，通过位阻)NAb和生物素化的鲁利珠单抗蛋白的相互作用，最终导致NAb的回收率低。

3.4.鲁利珠单抗和阳性对照的热稳定性

当与150kDa的NAb PC相比时，未聚乙二醇化的鲁利珠单抗很小，只有12kDa。这促使我们检查鲁利珠单抗是否可以在加热后被选择性地且不可逆地变性，从而留下完整的NAb被生物素化的未聚乙二醇化的药物提取。首先，我们在UNcle平台上使用差示扫描荧光法(DSF)比较了聚乙二醇化的或未聚乙二醇化的鲁利珠单抗以及一组在PBS中制备的抗鲁利珠单抗NAb PC的热稳定性。如图4A和表3所示，有或没有PEG部分的鲁利珠单抗的解链温度都低得多，因此它们中的大多数在62℃下已经变性，而包括pAb和mAb两者在内的所有NAbPC都刚刚在此温度下开始变性。

表3.通过DSF测量的鲁利珠单抗和不同NAb PC的平均解链温度。

为了进一步证实鲁利珠单抗和NAb PC的热稳定性不同，将兔pAb#1和克隆13H4在不同温度下加热50-60分钟，然后添加到基于细胞的测定法中以测试剩余的活性。虽然在62℃下加热的药物丧失了明显的活性，特别是当药物浓度低(约0.5μg/mL或更低)时，但是所有测试的NAb PC在所有测试的温度下都保留了其活性(图4B和4C)。这些结果表明在62℃下，大多数药物被不可逆地变性，而所有测试的NAb PC仍保持活性。有趣的是，当测试NAbPC的pH稳定性时，小鼠mAb克隆13H4显示出对pH 2.1(与BEAD中第一次酸处理所用的pH相同)的抗性，而兔pAb在pH 2.1处理后丧失了近60％的活性(图4D)。在其他项目中，观察到多克隆NAb PC的相似的较差的pH稳定性(数据未显示)。相同兔pAb当在62℃下加热时几乎保留了所有活性的事实表明加热可能是pH敏感的ADA/NAb解离的潜在替代方案。

3.5.加热而非酸处理提高抗鲁利珠单抗NAb的回收率

由于有希望的热稳定性数据显示药物与NAb PC之间存在显著差异，因此评价了在62℃下加热作为BEAD提取中酸解离的无效第一步的替代方法。将血清中不同浓度的兔pAb或小鼠mAb克隆13H4在室温下与或不与5μg/mL鲁利珠单抗一起孵育至少4小时，以确保形成免疫复合物。然后将样品在预热的62℃加热块中孵育30分钟；或者用400mM甘氨酸(pH 2.0)处理60分钟。然后将在具有1％BSA的PBS或1.8M Tris(pH 8.8)中制备的28μL鲁利珠单抗的生物素化的蛋白质骨架(50μg/mL)分别添加到冷却的板或酸处理的板中。在4℃下孵育过夜之后，添加链霉亲和素包被的磁珠，以下拉生物素-药物/NAb复合物。洗珠后，将NAb从珠上酸洗脱下来，中和，最后添加到基于细胞的测定中。如表4所示，加热以解离药物/NAb免疫复合物比酸解离具有好得多的NAb回收率，我们将此新程序称为珠提取和加热解离(BeadExtraction and Heating Dissociation，BEHD)。对于兔pAb PC，在有或没有药物两组中，加热在4μg/mL NAb下所实现的相对NAb活性都>1.5；而在酸处理组中，只有16μg/mL的NAb所实现的相对NAb活性>1.5。类似地，当用加热处理时，4μg/mL的克隆13H4所实现的相对NAb活性>1.6；而在酸处理组中，相同水平的>1.6的相对NAb活性仅在8-16μg/mL下出现。

表4.加热和酸处理后的相对NAb活性。在鲁利珠单抗的情况下，加热比酸更好地解离药物/NAb复合物。将原始值归一化为0μg/mL NAb组以计算相对NAb活性。

3.6.测定验证

随着优化的细胞测定和BEHD提取，通过以下参数验证测定：割点、精度、灵敏度、药物干扰、选择性和稳定性。

3.6.1割点

使用50个研究中未接受过治疗的SLE患者血清样品评估了割点。由3位分析人员在2天内将每个样品一式两份地在2个板中运行。除了SLE患者样品外，每个板还含有对照样品。通过将抗鲁利珠单抗NAb掺入来自健康供体的合并血清中来制备阳性对照克隆13H4(PC)。LPC是血清中的3μg/mL(LPC-1)或2.5μg/mL(LPC-2)的低阳性对照中和抗体。由于所述方法具有BEHD提取的预处理，因此也在5μg/mL鲁利珠单抗的存在下制备了LPC-1和LPC-2作为LPC-提取对照(LPC-EXC)，以监测每次运行中的BEHD提取。HPC是10μg/mL的高阳性对照中和抗体。NegC是来自健康供体的没有PC的相同合并的血清。将PC和NegC样品分别在每个板上作为2组和3组重复来运行。将每个板的接受标准设置为每个PC的变异系数CV(％)≤30.0％。另外，NegC的平均原始相对发光单位(RLU)值必须低于LPC、LPC-EXC和HPC的值。6个PC(HPC、LPC和LPC-EXC)中至少有4个并且在每个水平下至少有1个必须满足板的可接受性。3个NegC重复中至少有2个必须满足％CV标准。

与对照和患者样品相同地处理NegC。为了解释跨板的RLU的可能波动，使用样品RLU与板NegC RLU的比率(比率＝RLU/NegC RLU)来计算SLE患者样品的割点。观察到跨板的SLE样品RLU相比于NegC RLU之间有很强的相关性(Pearson“r”＝0.96)，支持使用NegC RLU来校正板与板之间RLU的波动。

通过Shapiro-Wilk检验证实了正态性假设。去除异常值后，将基于样品RLU/NegCRLU的比率的NAb测定割点确定为1.61(99％置信度，表5)。产生的平均RLU/NegC RLU值≥1.61的样品被视为中和。

表5.系统性红斑狼疮(SLE)受试者样品的中和测定割点的确定。

·^a统计异常值(标称n＝6)：

·^b 0.00％的精度估算值表明，板和受试者之间和/或之内的变异大于天和/或分析人员之间的变异，并且无法计算出估算值。

·^c使用对数变换的数据

3.6.2精度

跨PC比率(PC/NegC RLU比率)的所有12次运行进行了精度评估(CV[％])。参见表6。如第2.7.1节所述，分别对每个对照样品和供体样品进行了分析。跨所有对照样品的所有精度估算值(包括总精度)都在18.4％(％CV)之内。由于仅HPC/NegC的单侧99％预测区间的下界高于1.61的割点，因此HPC/NegC的接受标准≥1.94，而所有其他PC≥1.61的割点。

表6.测定PC/NegC RLU比率的精度评估和总结

^a 0.0％的精度估算值表明，板之间和/或之内的变异大于天和/或分析人员之间的变异，并且无法计算出估算值。使用板重复的平均值。

^b使用对数变换的数据进行预测间隔计算。

3.6.3选择性

用20个个体SLE人血清研究样品评估了选择性。在未掺入和掺入LPC水平的抗鲁利珠单抗(3μg/mL)的情况下运行样品。未加标样品中有75％呈阴性，并且在LPC下加标的样品中有100％呈阳性(表7)。

表7.SLE血清中的选择性评估。

3.6.4灵敏度

将测定灵敏度定义为亲和纯化的小鼠抗鲁利珠单抗NAb PC始终产生等于或高于1.61的割点的结果的最低浓度。将PC抗体以40、20、10、4、2、1和0.5μg/mL掺入合并的正常人血清中。在割点评价期间，由3位分析人员在2天内共绘制了6条曲线。发现在所有这些运行中都可靠地测试为阳性的最低PC浓度为2.0μg/mL。通过四参数逻辑斯谛(4PL)函数分析了所有6条曲线，并且使用GraphPad Prisma软件在1.61处进行了插值。中值为1.31，因此将测定的估算灵敏度设置为1.31μg/mL(图5)。

3.6.5药物干扰

3μg/mL的LPC-1和NegC掺有10、5、2.5和1μg/mL鲁利珠单抗，以估算测定的药物容忍度。掺有鲁利珠单抗的LPC在最高测试浓度(10μg/mL)下能够产生阳性反应，并且掺有鲁利珠单抗的所有NegC样品都产生了阴性(非中和)结果，因此测定在LPC-1水平下可以容忍高于10μg/mL的药物。(表8)。

表8.测定的药物干扰。在10μg/mL药物的存在下，可以在样品中检测到LPC水平(3μg/mL)的NAb PC。

3.6.6 NAb PC的稳定性

使用HPC、LPC-1和LPC-1-EXC水平评价了抗鲁利珠单抗NAb PC在人血清中的室温和冻融稳定性。将每个对照水平的三个等分试样置于环境室温下24小时，或者进行10次冻融循环。测定样品并相对于割点分类。所有样品在每种条件下都符合筛选标准，这证实NAbPC在环境室温下可稳定24小时，或可稳定最多进行10次冻融循环(表9)。

表9.稳定性测试。当在室温下放置24小时或经过10次冻融循环后，PC稳定。

4.讨论

基于细胞的功能性NAb测定(尤其是对于mAb生物治疗剂而言)的主要挑战之一是患者测试样品中存在大量药物，这经常会干扰基于细胞的测定中NAb的检出(16,17)。

在典型的ADA测定中，将生物素缀合的药物和HRP或钌标记的药物添加到测试样品中，以与循环药物竞争样品中的ADA；只要足够的ADA可以与标记的药物形成复合物，那么在桥接测定中样品将被测试为ADA阳性。换句话说，在过量的标记的药物的存在下，有可能改变平衡，以有利于ADA-标记的药物复合物的形成，而不是ADA-循环药物复合物(18)。然而，在基于细胞的NAb测定中，细胞无法区分样品中的药物与添加的药物(如生物素化的药物)：存在的所有药物都可能对细胞产生直接或间接影响。因此，如果药物水平与NAb的摩尔比超过1:1，除非在添加到基于细胞的测定中之前去除过量的药物，否则将无法检测到NAb。第一种成功去除大量药物用于进行免疫原性测试的方法是SPEAD，固相提取与酸解离：首先将含有药物/ADA免疫复合物的样品与生物素化的药物一起孵育过夜，以形成生物素-药物/ADA复合物；然后通过链霉亲和素包被的高结合板捕获这些复合物。洗涤后，使用酸从生物素-药物中洗脱出ADA(19)。这种原始的SPEAD方法有两个局限性：1)一些ADA/NAb PC具有很高的亲和力和极低的解离率，使得过夜孵育不足以形成新的平衡，有利于生物素-药物/ADA复合物。2)另外，高结合板的结合能力有限，这限制了生物素化的药物的添加量；如果测试样品中的药物过高，则添加量有限的生物素化的药物只能回收少量的ADA/NAb，从而导致药物容忍度低和NAb检出度低。由于这些原因，BEAD从SPEAD演变而来。添加了酸解离步骤以替换在没有酸情况下的过夜孵育，并且使用具有多得多的结合表面的链霉亲和素包被的磁珠来替换板，使得可以添加更多的生物素-药物，从而导致更有效地竞争ADA/NAb结合(10)。

尽管BEAD方法已经成功应用于多种NAb测定，但是我们最近发现，我们测试的一组15个NAb PC中有多达40％是酸不稳定的并且不能承受强酸处理，从而导致NAb回收率低(数据在准备中)。这意味着真实测试样品中的至少一些NAb种类也可能对酸敏感，并且在BEAD提取后可能无法检测到。

在当前的手稿中，我们进一步证明新形式的生物治疗剂(如聚乙二醇化的结构域Ab)可能与BEAD提取不兼容。在当前的案例研究中，当与完整的150kDa NAb相比时，我们利用了鲁利珠单抗的低解链温度。62℃加热步骤不仅解离NAb/药物复合物以替换BEAD中的强酸处理，而且不可逆地使测试样品中的大多数药物变性，从而留下完整的NAb被未聚乙二醇化的生物素-鲁利珠单抗提取。药物的不可逆变性是期望的，因为样品中功能性药物的量减少会促进平衡朝向ADA/生物素化的药物复合物，从而导致提取的ADA产量增加。值得注意的是，具有较差的低pH稳定性的兔pAb NAb PC在62℃下加热时仍存活，这表明加热可能是pH敏感的ADA/NAb解离的潜在替代方案。

我们能够以良好的准确度、精度和灵敏度验证测定。相同的珠提取与加热解离方法(我们将其命名为BEHD)可以应用于解链温度比全人Ab充分低的任何其他生物治疗剂。据我们所知，这是在免疫原性测试中使用热来促进ADA/NAb提取的首次报道。

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等效物

仅仅使用常规实验，本领域技术人员便将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。此类等效物旨在由所附权利要求所涵盖。